Abstract
Kültürlenmiş kardiyomiyositlerde vivo sistemler tamamlayıcı olan teknikler kullanılarak kardiyomiyosit biyolojisi okumak için kullanılabilir. Örneğin, in vitro kültür saflığı ve erişilebilirlik biyokimyasal analizler, canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji üzerinde hassas kontrol sağlar. kardiyomiyositlerinin uzun süreli kültür kısa vadeli kültürlerde tamamlanamaz ek deneysel yaklaşımlara erişim imkanı sunmaktadır. Örneğin, dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesinin in vitro soruşturma şimdiye kadar büyük ölçüde uzun vadeli kültüründe daha sağlam gibi görünen sıçan kardiyomiyositlerde, sınırlı olmuştur. Ancak, transgenik fare hatları ve iyi gelişmiş hastalık modellerinde zengin bir araç seti durumu kalp araştırma için fare sistemleri cazip kılmaktadır. çeşitli raporlar yetişkin fare kardiyomiyosit izolasyon bulunmasına rağmen, az sayıda çalışma uzun vadeli kültürünü göstermektedir. Burada yer alan, bir adım adım bir yöntemdiryetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun süreli kültür. İlk olarak, retrograd Langendorff perfüzyonu etkin gravite sedimantasyon, ardından arıtma için proteazlarla kalp sindirimi için kullanılır. farksızlaşma Aşağıdaki izolasyon bir süre sonra, hücreler giderek kültür tutunur ve hafta içinde kültürlenebilir. Adenovirüs, hücre lisatı etkin izole kardiyomiyositlerde transduse etmek için kullanılır. Bu yöntemler kalp biyoloji okumak için basit, ama güçlü bir model sistemi sağlar.
Introduction
Kültürlü kardiyomiyositlerde sıklıkla in vitro iyi kontrollü bir ortamda hücre davranışlarını izlemek için kullanılır. Örneğin, morfolojik, elektrik, biyokimyasal veya mekanik hücre özellikleri, oluşturulmuş ortam içinde 1,2 ve küçük moleküllü ilaçlar, peptid, gen düzenlenmesi, 3 ya da elektriksel uyarıya tepki olarak tasarlanmış substratlar üzerinde incelenebilir. 4, hücresel içeriği olabilir Ayrıca, tanımlanan eş-kültür ile kontrol edilebilir. 5 Bu in vitro deneyler, büyük ilaç ya da genetik ekranlar yararlıdır ve kardiyomiyosit biyoloji içeren araştırmalar çeşitli in vivo yöntemlerinde tamamlar.
Uzun süreli kültür fenotipik değişim elde etmek için zaman uzun zaman gerektirebilir deneysel yollar sağlar. Zamanında bir örnek olduğunu dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi genellikle üzerinde çalışılan se Erişkin memeli kardiyomiyosit çoğalması, biridirhaftaya veral gün. Burada 6,7, uzun kültür süresi, genetik manipülasyon, 7,8 işlevsel farklılaşma bozukluğunun (örneğin, sarkomerik demontaj) 9 ve potansiyel transkripsiyon dediferansiyonunu kolaylaştırır. 6 sonraki hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi daha uzun kültür dönemleri gerektirmektedir bölünme birden mermi deneysel hedef, özellikle gözlemlemek. Kardiyomiyosit hücre döngüsünün önemi önceden mevcut kardiyomiyositlerinin farksızlaşma ve çoğalması zebrabalıkları ve neonatal farelerde kalp rejenerasyon sorumlu gösterilmiştir kalp rejenerasyon, birkaç yeni anahtar bilimsel çalışmalar için merkezi. 10-12 Böylece, olasılık memeli yetişkin kardiyomiyositlerde farksızlaşma ve hücre döngüsü yeniden giriş uyarmak için insan kalbi rejenerasyon 13-15 anahtar soruyu kalır
Ben n memeli kardiyo hücre döngüsünü okuyan in vitro deneylermiyositler ağırlıklı nedeni fare modelleri ile karşılaştırıldığında uzun dönem kültür göreceli kolaylığı, sıçan kaynakları kullanılmıştır. 16 Bununla birlikte, faregiller sistemlerinin her ikisi de, in vitro ve in vivo olarak yararlı olan, iyi karakterize transjenik araçları ve hastalık modellerinde zengin bir kaynak sunar protokoller. Örneğin, Cre tabanlı soy izleme in vivo yenidoğan fare kalbinde miyokard rejenere kaynağı olarak önceden varolan kardiyomiyositlerinin belirlenmesini sağladı. Soy-takip yenidoğan fare kardiyomiyositlerde 12 In vitro çalışmalar stromal ile etkileşimlerin inceleme sağlamıştır fibroblastlar ile ko-kültür yoluyla hücreler. 5 Ancak, onun zorluklar nedeniyle, 17 birkaç rapor yetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun vadeli kültürü var. 18,19
yalnız kısa süreli kültür için geçerli yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu zor bir görev olduğu bilinmektedir. Bu protocol kısa vadeli hem de uzun vadeli soruşturma hem de kullanılabilir yetişkin farelerin canlı kardiyomiyositlerde ulaşmak için nasıl adım adım yönergeler sağlar. Bu protokolü kullanılarak izole kardiyomiyositlerde verimli adenoviral vektörlerin hafta boyunca 20,21 ve kültürlü kalıt edilebilir. Bu yöntemler, in vitro kardiyomiyosit biyolojisi okumak için güçlü sistem sağlar.
Burada tarif edilen yöntemler Langendorff retrograd perfüzyon varyasyonları kullanarak önceki eserlerinden çeşitli unsurları dayanmaktadır. 18,22 birkaç protokoller kısa süreli kültür ve çalışma, 23-25 avantajı için yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu yayınlanan olmasına rağmen Bu protokol kültürüne yeteneği izole kardiyomiyositlerde uzun vadeli olduğunu. Bu ektopik gen ekspresyonunu içeren ve hücre yeniden programlama stratejileri gibi uzun süreler gerektiren hücresel süreçlerin çalışmasında yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada özetlenen tüm işlemler Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi, San Francisco tarafından onaylanmıştır.
Not: Kısaca, fare göğüs kalbi çıkardıktan sonra, koroner retrograd perfüzyon etkin kolajenaz ve proteaz XIV ile hücre dışı matris sindirimi için kullanılır. ventriküller daha sonra mekanik olarak ayrılmış ve tek bir hücre süspansiyonu içine süzüldü izole edilir. Yerçekimi sedimentasyon yüksek yoğunluğu ile fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi stromal hücreler ayrılır kardiyomiyositlerde izole etmek için gerçekleştirilir. Saflaştırılmış kardiyomiyositlerde laminin kaplı polistiren üzerinde hafta kültüre ve adenovirüsün, gen vektörleri ile dönüştürülmüş olabilir.
1. kardiyomiyosit izolasyonu
- Tamponlar, Cerrahi İstasyonu ve Perfüzyon Aparatı hazırlayın
- Tab göre tamponlar ve ortamı hazırlayınle 1.
- Su banyosu dolaşan açmak ısıtılmış su ceketi çıkışı 37 ˚C bir sıcaklığa ulaşacak şekilde giriş sıcaklığını ayarlamak.
- % 70 etanol ile yıkama temizleyin perfüzyon sistemi. Daha sonra steril su birkaç hacim püskürtülerek sistemi etanol tüm izlerini silmek.
- Perfüzyon tamponu (Tablo 1) ile perfüzyon sistemi yükleyin. İlk tahliye su sisteminden, daha sonra perfüzyon tamponu 2 hacim ile yıkayın. Daha sonra ısı ceketi iç sütun perfüzyon tamponu ile doldurulur, böylece perfüzyon tamponu ile ölü alanı dolduran, ancak debubbling odası boştur.
İPUCU: Herhangi bir hava kabarcıkları debubbling odasının altındaki satırda bulunan olduğundan emin olun. , Inatçı kabarcıklarını çıkarmak tüm stopcocks meşgul ve basınç birkaç saniye hattı içinde birikmesine izin vermek için. Sonra prizinden jet yüksek basınçlı perfüzyon tampon izin düşük musluğunu serbest; akış hızı ve turbulence perfüzyon çıkışının yakınına yakalanan kabarcıklarını çıkarmak yardımcı olacaktır. - iğnesi olan bir şırınga Hazırlama aort kanülasyon için kullanılır. Perfüzyon tamponu ile dolu bir 1 ml şırınga 18 G, kör bir iğne takın. hava kabarcıklarını çıkarmak ve laboratuar bant ile diseksiyon miscroscope aydınlatıcı bir koluna şırınga tertibatını sabitleyin.
İPUCU: Eğimli iğne künt bir iğne uçlu oluşturmak için, tel kesme ile iğne mili transect. ucu düz olana kadar bir zımpara taşı ile ucu bilemek.
NOT: kanülasyon sırasında iğneden aortun kaymasını azaltmak jilet kullanarak kanülasyon iğne milini pürüzlendirin için. Birkaç oluklar iğne milinin ucuna 1 cm mesafe içinde oluşturulmuş kadar dönerken göbek ve üst mili tarafından iğne Güvenli, daha sonra ileri geri dik iğne milinin uzun eksenine jilet gördü. Bıçak donuk hale geldiğinde yeni bir jilet geçin. - Temiz bir koyunmikroskop altında petri kanülasyon kalbi içeren. kanül ucu görüş alanının kenarına yakın olacak şekilde aydınlatıcı kolunu, ancak diseksiyon engel değil. kanül ucu petri kenarına altında olduğundan emin olun.
NOT: - petri 215 mikron mesh kare küçük bir (7 cm 2 ~ 5) yerleştirin diseksiyon sırasında kalbi hareketsiz yardımcı olmak. Kalp bu örgü üzerine yerleştirildiğinde, sürgülü ve mekanik manipülasyon sırasında kalbin dönen azaltmak için sürtünme yaratacak. - aortun sabitleme için kullanılacak kanül iğne göbek etrafında gevşek çift overhand knot ile 2 sütür bağlayın.
- Kalp Ekstraksiyon ve kanülasyonu
- intraperitonal enjeksiyon ile heparin (5 U / g vücut ağırlığı) uygulayınız. Heparin kalbe almasını sağlamak amacı ile 20 dakika bekleyin.
- intraperitoneal enjekte tarafından fare anestezisi% 20 etil karbamat (2 mg, etil karbamat / g vücut ağırlığı) iyonu. (- 5 dk yaklaşık 3) fare derin anestezi altında olana kadar yakından gözlemleyin.
NOT: Derin anestezi ayak tutam ve kornea refleksleri hem eksikliği ile teyit edilir. Fare 8 derin anestezi ulaşmış değilse - 10 dakika sonra etil karbamat ek bir dozunu. Anestezi bireysel tepkiler fareler arasında değişecektir rağmen, başarısızlık sonra bile tekrarlanan doz derin anestezi engel olabilir bozulmuş etil karbamat, gösterebilir ilk doz üzerine derin anestezi girmek için. bozulmasını önlemek için, her kullanımdan önce etil karbamat taze solüsyon hazırlanır. - ameliyat bandı ile her uzuv güvence tarafından ameliyat platformu için fareyi hareketsiz. % 70 etanol liberal bir miktarda kesi alanı dezenfekte edin. Pat laboratuar silin bir ile kurulayın.
- sadece sternum altında doku forseps ile cilt kaldırın. bir uçtan bir uca kesim, küçük makas ile yanal kesi yapmakCildi ve karın ugh.
- nazikçe sternum üzerinden göğüs kafesi kaldırmak için hemostat kullanın. küçük diseksiyon makas kullanarak, aksilla doğru bir V-şeklinde kesi uzatmak. ilk kaburga kesti ve her iki tarafta diyafram delinme.
- hemostatlarla göğüs kafesi kaldırın ve tamamen diyafram transect küçük iris makas kullanmaya devam edin. kalbi ponksiyon özen gösterin.
- rostrally hızlı bir şekilde bağlı hemostat kullanarak göğüs kafesi geri çekin ama dikkatle her iki tarafta aksilla doğru göğüs kafesi üzerinden keserek V şeklinde kesi uzatmak. tam göğüs kafesi orta bölümünü geri çekin ve yerinde tutmak için ekli hemostat uzandı.
- Ince forseps kullanarak perikard çıkarın.
- hafifçe kavisli bir forseps kullanarak kalbi kaldırırken, kalbe bağlı damarları ve arterler transect. Hemen kas kasılmasını yavaş buz soğukluğunda perfüzyon tampon maddesi içinde kalp yerleştirin.
- petri altında kalbi yerleştirinBir diseksiyon mikroskobu (215 mikron mesh küçük bir parçası üzerinde yer diseksiyonu sırasında hareketsiz yardımcı olmak için). İnce iris makas kullanılarak herhangi bir aşırı kalp dışı doku kesin. aorta yakın keserken dikkatli olun.
- brachioencephalic arter yakın aort transect ve kabarcıklar veya doku enkaz açılış girmesine izin vermemeye dikkat çekmek.
- sıvı seviyesi kanül açılması üzerine çıktığı şekilde buz gibi soğuk perfüzyon tamponu ile kalbi içeren petri doldurun. ucu aort kapak hemen distalinde olacak şekilde kanül üzerine aorta kılıf.
İPUCU: Biraz kanül sonunda gelişmiş olabilir potansiyel hava kabarcıklarını çıkarmak için önce kanülasyona kanül üzerinde şırınga bastırın, hava embolisi riskini azaltmak için. Buna ek olarak, aort kaplamak ise baloncuklarının oluşumunu ortadan kaldırmak için çözelti yüzeyinin altında kanül ucu ve aort tutun. - aşağı önceden bağlı 7-0 ipek sütür kaydırınsadece iğne ucu yukarıda kanülasyon iğne ve pozisyon şaft. ince forseps ile düğüm sıkın. İlk üzerine yerleştirilen ikinci bir dikiş ile bu adımı yineleyin.
NOT: iğne ucu öncesi ve sıkıldıktan sonra aort kapağının üzerinde hala emin olun. - Yavaş yavaş koroner damar sistemi aracılığıyla perfüzyon tampon 0.5 ml çıkarmak için şırınga bastırın.
NOT: kanülasyon başarılı olursa, kan koroner arter bırakarak ve dorsal venler ve arterler dışında havuzu görüntülenmiştir olacaktır.
ÖNEMLİ: (özellikle diyafram delme) perfüzyon başlangıç hipoksik maruz kalmayı azaltmak ve izole kardiyomiyositlerinin hayatta kalma ve sağlık maksimize etmek için minimize edilmelidir göğüs boşluğunun açılması zamanı. İdeal olarak, bu süre 5 dakikadan daha az olmalıdır.
- serpilme
NOT: retrograd perfüzyonCihaz uygun standart bir laboratuar sırası üzerinde temiz bir ortamda çalışan veya steril üst düzeye çıkarmak için bir laminer akış başlığı içinde yerleştirilebilir. perfüzyon işlemi tamamlandıktan sonra, ancak, çalışma kontaminasyonu en aza indirmek için, laminer akış altında yapılmalıdır.- Nazikçe ama sıkı yavaş ileri geri çevirerek (steril eldiven kullanarak) şırınga kanül göbeğini çıkarın. şırınga kapalı kanülasyon iğne çekerken, yavaş yavaş perfüzyon sırasında hava kabarcıklarının önlemek için iğne hub içine perfüzyon tampon çıkarın.
- perfüzyon çıkış deliğinden aşağıdan sirkülasyon yakalamak tüpünü çıkarın ve atık yakalamak beher ile değiştirin. Perfüzyon çıkış portuna sabitlenir Luer adaptörü iğne göbeğini takın (Şekil 1, 2) su ceket, pompa en düşük ayarda çalışırken (15 RPM, ~ 6 ml / dk).
İPUCU: Luer adaptörü iğne hub bağlarken, damlama perfüzyon tampon con izinbaloncuklarının oluşumunu ortadan kaldırmak için, iğne göbek sıvı bağlantısını kurmadan. - perfüzyon tamponu 8 ml giriş hortumu ile aspire edilinceye kadar sirkülasyon olmadan kalbi serpmek.
NOT: Bu adımda, giriş hortumu ile emilen perfüzyon tamponu hacmi kalp pompalanır perfüzyon tamponu, 15 ml elde etmeyi sağlamaktadır, perfüzyon sistemine 7 ml ölü hacim varsayar. - perfüzyon tampon giriş borusunu sökün. İzin hava sisteminin ölü hacminden daha az giriş tarafından aspire edilmesi.
NOT: Bu aşamada emilen havanın hacmi koroner arter (adım 1.3.7 bakınız) hava girmesini önlemek için ayarlanması gerekir. - Sadece tüpün tabanından, sindirim tamponu (Tablo 1) giriş borusunu yerleştirin. Yavaş yavaş Yem ve giriş borusu tüpü taşmayı önlemek için yeterli hacim aspire izin verin.
- Görselleştirmek ve aralarında hava kabarcığı izleyinperfüzyon tampon ve ısı ceketi üzerinden geçecek şekilde sindirim tampon. ısı ceketi merkezinde perfüzyon tampon seviyesini gözlemleyin hava kabarcığı de-köpüren odasına ulaştığında düşmeye başlar. sindirim tampon de-köpüren odasına ulaştığında, ısı ceketi sıvı seviyesi sabit kalacaktır.
ÖNEMLİ: perfüzyon tampon seviyesi çok düşük düşerse, çıkış stopcock kapatın ve havalandırma musluğunu açın. (- Çıkış portu üzerinde 5 inç 3) seviye rahat bir düzeye yükselmesine izin verir. Ardından, perfüzyon pompa durdurmak ve havalandırma musluğunu kapatın. çıkış noktası musluğunu açın ve perfüzyon pompası yeniden başlatın. - kalpten çıkan çözüm izleyin. perfüzyon tampon son kalbini bırakır ve sindirim tampon kalp ile dolaşan başlar başlamaz, açık kahverengi açık renk değişimi nedeniyle kollajenaz varlığı görülecektir.
- sindirim tamponu ile kalp serpmek15 dakika - yaklaşık 10. Kollajen bozulmuş olarak kalp gitmeden başlayacak ve mekanik destek kaybeder.
- Mekanik Ayrışma ve Arıtma
- kuru petri forseps ve yer ile kanül kalbi çıkarın. Hızlı bir şekilde ince iris makas kullanılarak ekstra ventriküler doku kırpın. yıkamak için taze bir petri içeren perfüzyon tamponuna ventriküllerin aktarın. steril bir kaput petri taşıyın ve taze, kuru petri ventriküllerin aktarın.
- Çevirerek karıştırın, ısı ceketi gelen sindirim tampon 7.5 ml toplayın ve 1 M CaCl2 2.8 ul ekleyin. Petri karıncıklara CaCI2 ile sindirim tamponu 3 ml - 2 ekleyin.
NOT: Ca 2 + konsantrasyonu 300 700 uM dan yükseltilir - En parçalar küçük 1 mm'den 3 olduğu kadar çabuk, ince forseps ile ventriküler doku çiğnemek. kalır eklepetri ayrışmış ventriküllere adım 1.3.2 Ca 2+ takviye sindirim tampon ing ve hafif çalkalama ile karıştırın.
- % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde petri yerleştirin. Yeterli Kardiyomiyositlerde (aşağıdaki Not bakınız) dokudan serbest bırakıldı kadar petri her 2 dakikada çalkalayın.
Not: kuluçka süresi gerekebilir deney ihtiyaçlarına göre ince ayar sindirme derecesinin ayarlanması. Genellikle, uzun inkübasyon süreleri verim ve saflık artırmak, ancak hücre eki ve hayatta kalma oranını azaltabilir. 5-10 dakika, yüksek verim elde etmek için genelde yeterlidir (~ 5-10 x 10 5 hücre kalp başına). - Laminer akış kaputu geri petri aktarın. ayrıca ayırmak doku pipetle yavaşça, 45 ° açıyla kesilmiş bir transfer pipet kullanarak.
- bir koni içine 215 mikron örgü kat ve 50 ml'lik bir konik üzerinde tutmak için steril eldiven kullanın. Pipetayrışmış doku örgü üzerine süspansiyon ve süzülen 50 ml konik içine boşaltın. Birinci filtre malzemesiyle birleştirilerek, örgü ile petri kardiyomiyositlerde yıkamak için önceden ısıtılmış durdurma tamponu (Tablo 1) 7.5 ml kullanın.
Not: Ca + 2 son 1.1 mM yükseltilir ve durdurma tamponu nihai% 2.5 FBS proteaz aktivitesini nötralize. - 15 ml konik bir hücre süspansiyonu aktarın ve 15 dakika boyunca yerçekimi ile oturmasına izin verin.
- çözeltisi 100 ul hücre üzerinde kalması - dikkatle 50 böyle bir transfer pipeti ile süpernatantı. Önceden ısıtılmış, dengelenmiş kültür ortamı (Tablo 1) 10 ml ilave edilir ve özenli bir şekilde ters karıştırılır. Kardiyomiyositlerde 15 dakika yerçekimi tarafından yerleşmek için izin verin.
İPUCU: istediğiniz gibi adımı 1.4.8 tekrarlayın, saflığını artırmak için. - 100 ul o - dikkatle bir transfer pipet gibi sadece 50 ile süpernatant kaldırmakf çözüm hücreleri üzerinde kalır.
2. kardiyomiyosit Kültür
- Ön kaplama, doku önce hücreler, kaplama 2 saat boyunca 37 ° C 'de laminin (10 ug / ml) ve mağaza ile Petri kapları kültür işlemden geçirildi. Hemen önce, kaplama, doku kültürü plaka laminin çözüm aspire. MEM veya PBS ile bir kez yıkayın, daha sonra sigara adsorbe laminin kaldırmak için kalan sıvı aspire.
- Istenen hücre yoğunluğu elde hafifçe ters çevirerek karıştırın kadar ön-ısıtılmış, dengelenmiş kültür ortamı eklenir. (- 20 x 10 4 hücre / cm2, tipik olarak 5) plaka kültür kabına hücre konsantrasyonu istenilen. Kardiyomiyosit izolasyon verimi değerlendirmek için, bir mikroskop altında yoğunluğunu kontrol ederek hemasitometre veya test-plaka üzerinden hücreleri saymak. Protokol bu aşamada 1.0 x 10 6 hücre - Bir yetişkin fare kalp tipik 0.5 sağlar.
İPUCU: 96 kuyucuğu kullanıyorsanız, 1000 ul micropip kullanın45 ° açıyla kesilmiş bir ucu ile ette kuvveti kayma nedeniyle hücre hasarı en aza indirmek için. Bu kabarcıkların giriş en aza indirmek için, hücre süspansiyonunun püskürtülmesi sırasında kuyusunun alt temas edilecek şekilde pipet yerleştirin. - % 5 CO 2 ve% 95 nem ile 37 ° C inkübatör derhal hücre kültür çanak taşıyın. asitlenme önlemek için gerektiği gibi medya değiştirin: Her 1-5 günde hücre yoğunluğuna bağlı olarak değişir. Hücre kültürü yüzeyine bağlanmasını kolaylaştırmak için 6 gün - ilk 3 sırasında kültür çanak işlemeyi en aza indirmek.
NOT: hücrelerin tam takılı değil iken, medya değişiklikleri sırasında hücre rahatsızlığı en aza indirmek yarım medya değişikliğini gerçekleştirmek için. Sadece medya yüzeyinin altında pipet tutarken yavaşça medya aspire. Sonra yavaş yavaş sadece kültür çanak duvara medyanın yüzeyi üzerinde pipet tutarak ek medya ekleyin. - kardiyomiyositlerinin canlılığını değerlendirmek için, kontrolaydınlık mikroskobu altında morfolojisi. Taze izole edilmiş kardiyomiyositlerde aydınlık aydınlatma altında keskin tat kenarlı kabaca çubuk şeklinde bir yapıya (Şekil 2) muhafaza.
NOT: tripan mavisi ile hücrelerin boyanarak canlılığı onaylayın. - Kardiyomiyosit izolasyon saflığını değerlendirmek için, kardiyomiyositlerde tanımlamak için hücre morfolojisi kontrol edin. toplam hücreleri belirlemek için Hoescht 33342 ile çekirdekleri leke.
Not: Kardiyomiyositler karakteristik morfolojisi (çubuk şeklinde) ve boyutuna göre olmayan kardiyomiyositlerde arasında tespit edilebilir (yaklaşık 100 - uzunluğu 200 um). Alternatif olarak, taze izole kardiyomiyositlerde alfa-aktinin 26 (Şekil 3C, D) veya kardiyak troponin T 27 olarak kardiyomiyosit-spesifik belirteçler, pozitif leke olacak
Adenovirüs 3. gen transdüksiyonu
- Kurulan m kullanarak adenovirüs hücre lizat hazırlanmasıö n- tem. 21 adenovirüs üretici hücreleri 10 hücre lisatı kullanılarak kardiyomiyositlerde transdüksiyonu. izolasyon gün sonra, 0 veya 1. günde, dikkatli bir şekilde kardiyomiyositlerde içeren ortamda hücre lizatı ekleyin.
NOT: yüksek titre adenovirüs hazırlık yaklaşık 48 güçlü ifade başaracaktır - 72 saat. deneysel tasarım uygun enfeksiyon çokluğu ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir vahşi tip yetişkin ICR (CD1) fare kalp tipik başarılı bir izolasyondan 500.000 ile 1 milyon kardiyomiyositlerde verir. Hemen izolasyonundan sonra, hücreler, sağlam sarkomer bir çok çubuk biçimli bir görünüm (Şekil 3A) korumak ve kardiyomiyosit kasılma ile ilgili fonksiyonel çalışmalar için de kullanılabilir. çubuk şeklindeki kardiyomiyositlere (% 90 üzeri) yüksek bir yüzdesi etkili perfüzyon ve sindirim bir göstergesidir. Canlı Kardiyomiyositlerde büyük olacaktır (~ 100-200 uzunluğunda mikron) ve aydınlık aydınlatma (Şekil 3A) altında keskin bir dış membran var görünüyor. Alfa-aktinin olarak kardiyomiyosit özgü sarkomerik işaretçileri için immün bir tat sarkomerik bantlama desen (Şekil 3C) neden olur. DAPI ile morfolojik analiz, nükleer boyama ile bağlantılı olarak, immün izole kardiyomiyositlerde saflığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Fibroblastları hemen sonra izole küçük ve yuvarlak olacak, ama hızla böylece kardiyomiyositlere gelen yüzeysel bir ayrım sağlayan takmak ve hücre kültürü plastik ince yayılacak.
çubuk şekilli kardiyomiyositlerin düşük bir yüzdesi başarısız izolasyonun bir göstergesidir. Bu kalp hayvandan çıkarılan sonra hızlı bir şekilde aorta cannulate bir başarısızlık neden olabilir. Verimsiz perfüzyon, hava embolisi ya da örneğin yanlış kanülasyona nedeniyle de kardiyomiyositlerinin morfoloji ve canlılığı etkileyebilir.
Kültür içinde, birkaç gün sonra, kardiyomiyositler yuvarlak morfoloji (Şekil 3B) varsayalım. 1 içinde - 2 hafta, canlı kardiyomiyositlerde yüzeye tutunur ve (Şekil 3B, E) yayılan başlar. Ölü hücreler tripan mavisi alınması ile tespit edilebilir. Başarılı bir izolasyon ve kültür canlı kardiyo yaklaşık% 50 verecektir1 hafta sonra miyositlere. Bu nedeniyle çoğalma potansiyeli daha sonra kültür içinde bu hücrelerin bir yüzdesinde sonuçlanır fibroblastlar olmayan kardiyomiyositlerde kirlenmenin. Bu saflığı arttırmak ve / veya ön kaplama vasıtasıyla yerçekimi sedimantasyon sayısının arttırılması ile önlenebilir. 28
72 saat (Şekil 3E) - adenovirüs İletimi 48 içindeki kuvvetli gen ekspresyonunu elde etmek için kullanılabilir. Adenovirüs serotip 5 nedeniyle coxackie-adenovirüs reseptör yüksek ifadesine in vitro yetişkin fare kardiyomiyositlerde transducing de etkilidir, ancak kullanılan ortamın türüne göre farklılık gösterebilir. 20
Şekil 1. kardiyomiyosit İzolasyon Ekipmanları ve Enstrümantasyon. (A) Cerrahi aletler fare elde etmek için kullanılmaktadırKalp ve yukarıdan aşağıya doğru, aort cannulate: hemostatlar, doku forseps, kavisli forseps, Dumont # 5 ince forseps, küçük diseksiyon makas, ince iris makas, ince sıkma makas (B) fare kalbi sindirmek için kullanılan Langendorff perfüzyon sistemi. . Perfüzyon tamponu perfüzyon pompası ile giriş borusu (1) ila aspire edilir (2) ve ısıtılmış su ceketi, giriş portuna pompa çıkış borusu (3) ila (4). Perfüzyon tamponu bunlar sarmal cam tüp, debubbling bölmesi boyunca seyahat ısıtılmış su ceketi ile ısıtılır, ve daha sonra bir valf ile bağlıdır perfüzyon çıkış ağzı (5), bağlı kanülasyon iğne üzerinden edilmiştir. konik tüp aşağıda giriş tüp aracılığıyla yeniden dolaştırılan perfüzyon tamponlar, yakalar. Basınç portu (6), uyum portu (7) ve (8) sabit bir akış hızını korumak için perfüzyon sırasında kapalı kalır havalandırın. su ceketi dolaşan su banyosu th girerek ısıtılıre ceket girişi (9) ve çıkış (10) portları. Bir halka standı dikey konumda ısıtılmış su ceketi (kırmızı kelepçeler, mor konik tüp raf altında siyah baz) tutmak için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Perfüzyon Sistemi şematik bakış. Elyazması Maddede atıfta bulunulan olarak Perfüzyon Aparatı önemli parçaları Etiketli edilir. Perfüzyon tampon akış yönü oklarla gösterilir. Aort kanül konumlandırma Not ucu o aort kapağının üstüne yerleştirilir sağlanması, saydam aort aracılığıyla görünür olmalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İzole. Kardiyomiyositlerde protokolü, burada tarif edildiği gibi laminin kaplı 96 oyuklu plakalar üzerine İzole ve tohumlandı. / Cm-2, yaklaşık 8.000 hücre tohumlanır (A) Taze izole kardiyomiyositlerde. Taze izole canlı kardiyomyositler yaklaşık görünen keskin kenarlı (beyaz ok başı) ile çubuk şekilli unutmayın. Ancak, aydınlık altında yaygın dış membran var görünüyor kardiyomiyositlerde öldü. Kültürün ilk birkaç gün boyunca, kardiyomyositler yuvarlak bir şekil (B). (C) alfa-aktinin (yeşil) için immün d1 sonrası izolasyon bir kardiyomiyosit karakteristik sarkomerik bantlama ortaya varsayalım. mavi gösterilen nükleer leke (DAPI). En gösterileri alt resimde belirtilen bölgenin imajını uzaklaştırdınız. (D) (E) aydınlık ve epifluorescent görüntüleri adenovirüs bir CMV promoter kontrolü altında bir GFP muhabiri taşıyan transduced gün 11 sonrası izolasyon de kardiyomiyositlerde (göstermek UT Southwestern Robert Gerard bir hediye). Hücreler, yaklaşık 18,000 hücre / cm2 tohumlanmıştır ve hücre başına yaklaşık 800 plak oluşturucu birimler (PFU) arasında bir enfeksiyon çokluğu ile 0. günde kalıt. Ölçek çubukları:. 50 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Kardiyomiyosit yalıtım tamponu (CIB) | |||
| mag altında temiz bir behere ultra saf su 900 ml ilave edilirmanyetik karıştırma. | |||
| belirtilen tabloda tampon bileşenleri ekleyin. | |||
| Bileşen | MW | Final Kons (mM) | 1X (g / l) |
| NaCI | 58.44 | 120 | 7,013 |
| KCI | 74,55 | 5.4 | 0.403 |
| Na 2 HPO4.7H 2 O | 268,07 | 0.33 | 0.088 |
| MgSO 4 .7H 2 O | 246,48 | 0.5 | 0.123 |
| boğa | 125.1 | 30 | 3,753 |
| BDM | 101.1 | 10 | 1.011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5,958 |
| glikoz | 180,16 | 22 | 3,964 |
| pH zekâ ayarlayınH 5 M NaOH. | |||
| ultra saf su ile 1 L ses seviyesini ayarlayın. | |||
| Steril filtre ağ / 0.22 uM vakum filtresi. | |||
| kardiyomiyosit yalıtım tamponu litresi başına 0.1 U / mL arasında insülin 0.5 ul ekle. | |||
| Perfüzyon tamponu | |||
| Bileşen | final | Hacim (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0.4M) | 0.4 mM | 0.2 | |
| Genel Toplam | - | 200 | |
| sindirim tampon | |||
| Bileşen | final | miktar | |
| CIB | - | 15 mi | |
| CaCl2 (1 M) | 300iM | 4.5 ul | |
| proteaz XIV | 0.2 mg / ml | 3 mg | |
| Kollajenaz II | 2.4 mg / ml | 36 mg | |
| Genel Toplam | - | 15 mi | |
| durdurma tamponu | |||
| Bileşen | final | Hacim (ml) | |
| Perfüzyon tamponu | % 95 | 14.25 | |
| CaCl2 (1 M) | 1.5 mM | 22.5 | |
| FBS | % 5 | 0.75 | |
| Genel Toplam | - | 15 mi | |
| Kültür ortamı | |||
| Bileşen | Final% | Hacim (ml) | |
| MEM ortam | % 90 | 90 | |
| FBS | % 10 | 10 | |
| Primocin | % 0.2 | 0.2 | |
| Genel Toplam | 100% | 100 mi | |
| kültür ortamı, 37 ° C'de,% 5 karbon dioksit dengelenmeye bırakın. | |||
Tablo 1: Çözümler ve Tamponlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İzole kardiyomiyositlerinin genel sağlık Bu protokolün birkaç önemli yönlerini bağlıdır. İlk olarak, perfüzyon kalp çıkartılmasından süresi önemli ve 5 dakika veya daha kısa sürede yapılmalıdır. Kalsiyum çıkarılması hücre-hücre etkileşimleri ayırmak yardımcı olur, ancak negatif hücre sağlığı uzun vadeli etkileyebilir. 29-32 Böylece, bu yeterli EGTA tarafından perfüzyon ilk birkaç dakika boyunca kalsiyum kaldırmak için (etilen glikol tetraasetik asit) şelasyon bulmak 22 ama hızla sindirim ve sonraki adımlar sırasında kalsiyum geri.
proteaz XIV kullanımı büyük ölçüde tek başına kollajenaz göre sindirim verimini artırır. Bunun nedeni kollajenaz toplu değişkenlik 18,24 tutarsızlığı azaltır ve yerçekimi sedimantasyon sırasında ayrılmasını kolaylaştırarak kardiyomiyositlerinin saflığını artırır. Bununla birlikte, aşırı sindirim kültür alt tabakaya etkili eki, bu yüzden ince bir denge i önleyecektirHücre eki ve canlılığı korurken hücre verim ve saflık optimize etmek için gerekli s. Bu nedenle, proteazlar ve sindirim uzunluğu konsantrasyonu deneysel hedeflerine uygun şekilde değiştirilebilir. Genel olarak, sindirim daha az derecede kardiyomiyositlerinin eki ve hayatta kalma artıracaktır. Tripsin kullanımı, bazı kardiyomiyosit yalıtım protokollerinde bildirilmiştir. 18 Bununla birlikte, burada kullanılan proteaz kokteyli tripsin ilave edilmesi (kolajenaz ve proteaz XIV) belki de aşırı sindirim veya bölünmeye, kültürdeki kardiyomiyositlerin uzun süreli canlılık azaltır temel yüzey ve / veya hücre dışı matris proteinlerinin.
Izolasyonu sırasında butanedione monoxime (BDM) dahil kalp kas kasılması inhibe ve böylece nedeniyle, terminal kontraktürü, enerji harcaması ve kalsiyum paradoksa olumsuz sonuçları azaltır. 29,33 Ancak, bizim deneyim, BDM çıkarılması öncesinde kültür dedifferentiatio hızlandırırn ve hücreler, iki boyutta kültüre uyum sağlar.
Böyle kontraktilite olarak kardiyomiyositlerinin fonksiyonel yönlerini etkileyebilir 2-D kültürüne uzun vadeli adaptasyonları dikkat etmek önemlidir. Böylece, kontraktilite ve elektrofizyoloji deneyleri yakında yerli sarkomerik örgüt hala bozulmamış izolasyon, sonra yapılmalıdır. Bundan başka, herhangi bir in vitro deney ile olduğu gibi, kültürde hücreler, humoral ya da bağışıklık sinyal olarak in vivo mevcut olan belirli dış etkiler, yoksundur. Öte yandan, tanımlanan eş-kültür kardiyomiyositlerde ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri incelemek için uygulanabilir. 5,34 Buna ek olarak, in vitro kültür içinde kültür ortamında tanımlanmış moleküler sinyallerle kardiyomiyosit davranışı incelemek için kullanılabilir. Böylece, deney genel amaçları dikkatle kabul ve bu kültür sisteminin avantaj ve sınırlılıklarını karşı değerlendirilmelidir.
35 FBS ve diğer hayvan türevli sera hücre fizyolojisinin etkileyebilir bilinmeyen bileşenleri içeren unutulmamalıdır . 36,37 FBS büyüme faktörlerinin de takdir varlığına rağmen burada sunulan 38 kardiyomiyosit kültürleri çoğalmazlar. Aksine, hücre döngüsü blok ex vivo olarak, gelişme perinatal dönemde kendi hücre döngüsü çıkış yapılmaktadır. 12,39 Bu özellik kardiyak rejeneratif tıp, alanında başlıca ilgi çekicidir yetişkin fare kardiyomiyositlerde kalıcı bir özellik gibi görünüyor proliferatif bir fenotip yetişkin memeli kardiyomiyositlerinin reversion 3,26,40-42 Özellikle, kardiyomiyositlerde hücre döngüsünü yeniden girmeniz için gerekli olan ne derece farksızlaşma şu anda belli değil. bir ağır izlenen amaç, ama contributio ettidüşük omurgalılarda rejenerasyona farklılaşmanın giderilmesi n de farksızlaşma artan miyofibriler sökme 6,12,9 olmak üzere en az işlevsel düzeyinde, memeli sistemlerde, kardiyomiyosit çoğalması ve kalp rejenerasyonunda gözlenmektedir, ayrıca 43,44,10,11 desteklenir Bu nedenle, kültür kardiyomiyositlerin farklılaşma durumu dikkatle araştırma hedefleri ihtiyaçlarına göre kabul edilir ve modüle edilmiş olmalıdır. Bu şekilde, kültür koşulları, potansiyel daha yüksek serum konsantrasyonu, kullanımı tarif Serum maddeler veya serumsuz ortam azaltmak için değiştirilebilir. Örneğin, düzenlenmiş sarkomer sergileyen yetişkin sıçan kardiyomiyositlerde serumsuz kültür, uzun vadeli, ama bu fibroblast büyüme faktörü, epidermal büyüme faktörü ve triiyodotironin gibi büyüme faktörleri tanımlanmıştır ortamı kullanılmıştır. 45 akla yakın olduğu benzer bir ortam formülasyonları ve potansiyel olarak diğer bu DİFERANSİYEL uyarlanan gibi formülasyonlaration protokolleri, 46 derece organize sarkomerik yapılarını görüntülemek kültürde iyi diferansiye yetişkin fare kardiyomiyositlerde korumak için kullanılabilir. Alternatif formülasyonlar ayrıca deney ihtiyaçlarına bağlı olarak (örneğin yüksek de farklılaşmış kardiyomiyositlerde gibi) diğer fenotipleri 6 ulaşmak için gelişmiş olabilir, ancak daha fazla çalışma gerekmektedir.
Fibroblast rolü uzun vadeli kültüründe yenidoğan fare kardiyomiyosit hücre döngüsü 5 ve (hipertrofik IL-6 sinyalizasyon yoluyla) yetişkin fare kardiyomiyosit farklılaşma kontrolünde sorumlu tutulmuştur. 19 Dolayısıyla, kültürde fibroblast büyüme deneysel yorumlarında hesaba alınmalıdır . Kültür içinde fibroblast büyüme ön kaplama adımları sitosin arabinosid 19 (AraC) ya da bu gibi bileşiklerin kısıtlayıcı büyüme ilavesiyle kontrol edilebilir. 28 Bununla birlikte, araç, aynı zamanda bu nedenle alternatif, kardiyomiyositlerin büyümesini inhibe edecekYöntemi kardiyomiyosit Hücre döngüsü ile ilgili çalışmalarda fibroblastların büyümesini kontrol etmek için kullanılır. Burada tarif edilen protokol, ilk kardiyomiyosit saflığı gravite sedimentasyon adım (1.4.8 bakınız) tekrar arttırılabilir.
Bu buluşun yöntemleri, yetişkin memeli kardiyomiyosit hücre döngüsü blokajı doğasını incelemek için kullanılabilecek bir in vitro sistem sağlar. Örneğin sıçan veya gine domuzu gibi diğer organizmalar, birincil hücrelerin aksine, primer fare kardiyomiyositlerde bu Cre tabanlı nesilli knock-in modelini takip gibi güçlü ve iyi karakterize edilmiş genetik araçlar, bir zenginlik sunar, 47 kolayca kullanılabilecek önceden var olan kardiyomiyositlerde türetilen hücreleri belirlemek. Buna ek olarak, birincil yetişkin fare kardiyomiyositlerde hücre döngüsü blokaja neden olan ana gelişim şartlarına maruz edilmiştir 12,48, hücre çizgileri ve farklı ES veya iPSC hücre 46 farklı olarak kendi convenien rağmen hangiBüyük ilaç ekranlara ce ve uyum, 2 yetişkin kardiyomiyosit hücre döngüsü çıkış doğasını sondalama deneylerde sınırlı yarar olabilir.
Bu protokol, güvenilir izole etmek yöntem ve kültür yetişkin fare kardiyomiyositlerde özetliyor. Çeşitli yöntemler, daha önce kısa süreli çalışma için yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu göstermiştir, ancak bugüne kadar, birkaç yayın yetişkin fare kardiyomiyositlerde uzun vadeli kültürü var. 18,19 kültürde etkinleştirmeniz gerekir yetişkin fare kardiyomiyositlerde korumak için yeteneği uzun vadeli inceleme gerektiren deneysel koşullar altında kardiyomyosit biyoloji in vitro çalışma. Örneğin gen ekspresyonu, tipik olarak tam olarak ifade elde etmek için birkaç gün gerektirir adenovirüs vektörleri kullanılarak manipüle edilebilir. Sonradan fenotipik değişiklikler ve analiz deneysel hedeflerine bağlı olarak zaman daha uzun süreler gerekebilir. Burada sunulan yöntemler yetişkin fare kardiyomiyopati kültürünü izinbirkaç hafta yocytes. Bu tür hücre döngüsünün düzenlenmesine ilişkin olanlar gibi kardiyomiyosit biyoloji ihtiyatlı soruların, soruşturma için güçlü bir sistem sağlamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu proje (Sandler Vakfı tarafından kısmen finanse edilen) Atılım Biyomedikal Araştırma UCSF Programı, Bağımsızlık Ödülü NIH Pathway (R00HL114738) ve Edward Mallinckrodt Jr Vakfı tarafından finanse edildi. JJ NIH (T32HL007731) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir. Yazarlar mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir, bu işin, içeriklerinden sorumludur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
