Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

Published: August 28, 2016 doi: 10.3791/54012
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Abstract

العضلية مثقف يمكن استخدامها لدراسة cardiomyocyte البيولوجيا باستخدام التقنيات التي هي مكملة للأنظمة في الجسم الحي. على سبيل المثال، ونقاء وسهولة الوصول إليها من ثقافة في المختبر يمكن دفع غرامة السيطرة على التحاليل البيوكيميائية، والتصوير الحي، والكهربية. ثقافة على المدى الطويل العضلية تقدم الوصول إلى المناهج التجريبية الإضافية التي لا يمكن أن تكتمل في الثقافات على المدى القصير. على سبيل المثال، وحتى الآن إلى حد كبير اقتصر التحقيق في المختبر فقد التمايز، دورة الخلية اعادة الدخول، وانقسام الخلايا العضلية على الفئران، والتي تظهر لتكون أكثر قوة في الثقافة على المدى الطويل. ومع ذلك، فإن توافر مجموعة أدوات غنية من خطوط الماوس المعدلة وراثيا ونماذج المرض متطورة تجعل أنظمة الماوس جاذبية للأبحاث القلب. على الرغم من أن العديد من التقارير وجود من الماوس الكبار cardiomyocyte العزلة، عدد قليل من الدراسات تظهر ثقافة على المدى الطويل. المقدمة هنا هي طريقة خطوة بخطوة لالعزلة وطويلة الأجل ثقافة العضلية الماوس الكبار. أولا، يتم استخدام الوراء نضح Langendorff الهضم بكفاءة القلب مع البروتياز، تليها تنقية خطورة الترسيب. بعد فترة من العزلة فقد التمايز التالية، وخلايا إرفاق تدريجيا للثقافة ويمكن تربيتها لمدة أسابيع. يستخدم المحللة خلية اتش لتنبيغ بكفاءة العضلية معزولة. وتوفر هذه الأساليب لذلك، نظام نموذجي بسيطة لكنها قوية لدراسة البيولوجيا القلب.

Introduction

وكثيرا ما تستخدم العضلية مثقف لمراقبة سلوك الخلايا في بيئة تسيطر عليها بشكل جيد في المختبر. على سبيل المثال، خصائص الخلية المورفولوجية والكهربائية، والكيمياء الحيوية، أو الميكانيكية يمكن دراستها على ركائز هندسيا، 1،2 في وسائل الاعلام محددة، وردا على المخدرات جزيء صغير، والببتيدات، تنظيم الجينات، 3 أو التحفيز الكهربائي. 4 المحتوى الخلوي يمكن أيضا يمكن السيطرة عليها باستخدام تعريف المشترك الثقافات. 5 هذه التجارب في المختبر هي مفيدة في مجال مكافحة المخدرات كبيرة أو شاشات الوراثية وتكمل في طرق الحي لأنواع مختلفة من التحقيقات التي تنطوي على البيولوجيا cardiomyocyte.

ثقافة على المدى الطويل تمكن السبل التجريبية التي تتطلب فترات زمنية طويلة لتحقيق التغيير المظهري. والمثال في الوقت المناسب هو أن من البالغين انتشار cardiomyocyte الثدييات، حيث عادة ما يتم دراستها فقد التمايز، دورة الخلية اعادة الدخول، وانقسام الخلايا على ذاتهأيام veral إلى أسابيع. 6،7 هنا، وهي المرة ثقافة بمد يسهل التلاعب الجيني، 7،8 فقد التمايز الوظيفي (على سبيل المثال، التفكيك الساركومير) 9 وفقد التمايز يحتمل النسخي. 6 اللاحقة دورة الخلية اعادة الدخول وانقسام الخلايا يتطلب فترات أطول الثقافة للاحتفال، خاصة إذا جولات متعددة من الانقسام هي الهدف التجريبي. أهمية الخلية دورة cardiomyocyte أمر أساسي لعدة أعمال العلمية الرئيسية الأخيرة في تجديد القلب، حيث تبين أن فقد التمايز وانتشار الخلايا العضلية الموجودة من قبل المسؤولين عن تجديد القلب في الزرد والفئران حديثي الولادة. 10-12 وهكذا، فإن إمكانية لتحفيز فقد التمايز ودورة الخلية اعادة الدخول في العضلية الكبار الثدييات يبقى السؤال الرئيسي في تجديد قلب الإنسان 13-15

أنا ن التجارب في المختبر دراسة دورة الخلية من القلب الثديياتوقد استخدمت myocytes في الغالب مصادر الفئران، نظرا لسهولة النسبية للثقافة على المدى الطويل مقارنة مع نماذج الماوس. 16 ومع ذلك، نظم الفئران توفر الموارد غنية من الأدوات المعدلة وراثيا تتميز بشكل جيد ونماذج المرض التي هي مفيدة في كل من في المختبر والمجراة البروتوكولات. على سبيل المثال، قد مكن تتبع النسب استنادا لجنة المساواة العرقية تحديد العضلية الموجودة مسبقا كمصدر للتجديد عضلة القلب في قلب فأر حديثي الولادة في الجسم الحي. 12 في الدراسات المختبرية العضلية الماوس حديثي الولادة، تتبع النسب مكنت دراسة التفاعلات مع انسجة الخلايا من خلال ثقافة مشتركة مع الخلايا الليفية. 5 ولكن نظرا لتحدياتها، وجود 17 تقارير قليلة من العزلة وطويلة الأجل ثقافة العضلية الماوس الكبار. 18،19

ومن المعروف ان عزلة العضلية الماوس الكبار قابلة للثقافة على المدى القصير وحدها أن تكون مهمة صعبة. هذا protocيوفر رأ خطوة بخطوة على تعليمات حول كيفية تحقيق العضلية قابلة للحياة من فئران بالغة التي يمكن أن تستخدم في كل من المدى القصير وكذلك التحقيقات على المدى الطويل. العضلية معزولة باستخدام هذا البروتوكول يمكن transduced بكفاءة مع ناقلات الفيروسة الغدانية 20،21 وتربيتها لمدة أسابيع. وتوفر هذه الأساليب نظام قوي لدراسة البيولوجيا cardiomyocyte في المختبر.

وتستند هذه الأساليب المذكورة في هذه الوثيقة على عدة عناصر من الأعمال السابقة باستخدام أشكال مختلفة من نضح الوراء Langendorff. 18،22 وعلى الرغم من عدة بروتوكولات تم نشرها على عزل الخلايا العضلية الماوس الكبار للثقافة على المدى القصير والدراسة، 23-25 ​​ميزة هذا البروتوكول هو القدرة على ثقافة العضلية معزولة على المدى الطويل. وسيكون هذا مفيدا في دراسة العمليات الخلوية التي تنطوي على التعبير الجيني خارج الرحم والتي تتطلب فترات طويلة من الوقت، كما هو الحال في استراتيجيات إعادة برمجة الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل لجنة استخدام ورعاية الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو.

ملاحظة: لفترة وجيزة، بعد استخراج القلب من الصدر الماوس، يتم استخدام نضح الوراء التاجي الهضم بكفاءة المصفوفة خارج الخلية مع كولاجيناز والرابع عشر البروتيني. ثم يتم عزل البطينين، فصل ميكانيكيا وتصفيتها في تعليق خلية واحدة. يتم تنفيذ الترسيب الجاذبية لعزل العضلية، التي يتم فصلها من الخلايا اللحمية مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية التي كتبها الكثافة العالية. والعضلية النقاء يمكن تربيتها لمدة أسابيع على البوليسترين المغلفة laminin وtransduced مع ناقلات اتش الجينات.

1. Cardiomyocyte عزل

  1. إعداد المخازن، محطة الجراحية وأجهزة الإرواء
    1. إعداد مخازن وسائل الإعلام وفقا للتبويب1 جنيه.
    2. بدوره على تعميم حمام الماء، ضبط درجة الحرارة المدخلات مثل هذا الانتاج من سترة المياه ساخنة تصل درجة حرارة 37 مئوية.
    3. نظام نضح نظيفة عن طريق تنظيف مع 70٪ من الإيثانول. ثم إزالة كل آثار الإيثانول من النظام عن طريق تنظيف مع عدة مجلدات من الماء المعقم.
    4. تحميل نظام نضح مع العازلة نضح (الجدول 1). استنزاف المياه الأولى من النظام، ثم شطف مع 2 مجلدات من العازلة نضح. ثم ملء الفضاء الميت مع العازلة نضح بحيث يتم تعبئة العمود الداخلي من سترة الحرارة مع العازلة نضح، ولكن غرفة debubbling فارغ.
      TIP: تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء موجودة في السطر أسفل غرفة debubbling. لإزالة فقاعات المتمردة، إشراك جميع الصمامات والسماح ضغط لبناء داخل الخط لبضع ثوان. ثم حرر محبس أقل، مما يسمح المخزن المؤقت نضح ارتفاع ضغط على طائرة من مأخذ. تدفق سريع وturbulencه سوف تساعد طرد الفقاعات التي يتم صيدها بالقرب من منفذ نضح.
    5. إعداد المحاقن مع إبرة لاستخدامها في إقناء؛ إدخال القنية الشريان الأبهر. إرفاق إبرة حادة 18 G لحقنة 1 مل مليئة عازلة الارواء. إزالة فقاعات الهواء وإصلاح التجمع حقنة لذراع واحدة للإضاءة تشريح miscroscope مع الشريط المختبر.
      TIP: لإنشاء إبرة العضوية حادة من إبرة مشطوف، القطع رمح إبرة مع قواطع للاسلاك. ثم صقل طرف مع الحجر الرملي حتى غيض مسطح.
      ملاحظة: للحد من انزلاق الشريان الأورطي من الإبرة خلال إقناء؛ إدخال القنية، خشن رمح من الإبرة إقناء؛ إدخال القنية باستخدام شفرة حلاقة. تأمين إبرة من قبل محور ورمح العلوي، ثم رأى الحلاقة ذهابا وإيابا عمودي على محور طويل من رمح إبرة في حين تناوب حتى تم إنشاء العديد من الأخاديد في 1 سم من غيض من رمح الإبرة. التبديل إلى شفرة حلاقة جديدة عندما تصبح شفرة مملة.
    6. وضع نظيفةطبق بتري تحت المجهر تشريح لاحتواء القلب أثناء إقناء؛ إدخال القنية. وضع الذراع إضاءة مثل هذا غيض من قنية بالقرب من حافة مجال الرؤية، ولكن ليس عرقلة تشريح. ضمان غيض من قنية أقل من حافة طبق بتري.
      ملاحظة: للمساعدة لشل حركة القلب أثناء تشريح، ومكان صغير (~ 5-7 سم 2) مربع من 215 شبكة ميكرون في طبق بتري. عندما يتم وضع القلب على هذه الشبكة، فإنه سيتم إنشاء الاحتكاك للحد من انزلاق والدورية للقلب خلال التلاعب الميكانيكية.
    7. التعادل 2 الغرز مع عقدة الذراع مزدوجة فضفاضة حول محور الإبرة قنية لاستخدامها في securement من الشريان الأورطي.
  2. القلب استخراج وكيفية تركيب الكانيولا
    1. إدارة الهيبارين (5 وحدة دولية / غرام من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. الانتظار 20 دقيقة للسماح الهيبارين أن يعمم على القلب.
    2. تخدير الماوس عن طريق حقن داخل الصفاقأيون من 20٪ الكرباماتية الإيثيلي (2 ملغ إيثيل الكرباماتية / غرام من وزن الجسم). مراقبة عن كثب حتى الفأر هو تحت التخدير العميق (حوالي 3-5 دقائق).
      ملاحظة: تأكيد التخدير العميق بسبب عدم وجود حد سواء قرصة أخمص قدميها، وردود الفعل القرنية. إذا كان الماوس لم تصل التخدير العميق من 8-10 دقائق، ثم إدارة جرعة إضافية من الكرباماتية الإيثيل. رغم أن الاستجابات الفردية للتخدير سوف تختلف بين الفئران، وعدم تدخل التخدير العميق على الجرعات الأولى قد يشير المتدهورة الكرباماتية الإيثيل، والذي قد يحول دون تخدير عميق حتى الجرعات بعد تكرار. لمنع تدهور، وإعداد حل جديد من الكرباماتية إيثيل قبل كل استعمال.
    3. لشل حركة الماوس إلى منصة الجراحة من خلال تأمين كل طرف مع الشريط الجراحية. تطهير منطقة شق مع الليبرالية مبلغ من 70٪ من الإيثانول. ثم جففيها مع مختبر مسح.
    4. رفع الجلد مع ملقط الأنسجة أسفل عظمة القص. جعل شق الوحشي مع مقص صغير، وقطع ترولاف الجلد والبطن.
    5. استخدام المرقأة لرفع بلطف القفص الصدري عن طريق القص. باستخدام مقص تشريح الصغيرة، وتوسيع شق في شكل V نحو الإبطين. قطع طريق الضلع الأول وثقب الحجاب الحاجز على كل جانب.
    6. الاستمرار في رفع القفص الصدري مع المرقأة واستخدام مقص القزحية الصغيرة إلى القطع تماما الحجاب الحاجز. الحرص على عدم ثقب القلب.
    7. سحب القفص الصدري rostrally استخدام المرقأة المرفقة وبسرعة بل تمتد بعناية شق على شكل V من خلال قطع القفص الصدري نحو الإبطين في كلا الجانبين. سحب الجزء الأوسط من القفص الصدري بشكل كامل ووضع المرقأة المرفقة إلى عقد في المكان.
    8. إزالة التامور باستخدام ملقط غرامة.
    9. في حين رفع بلطف القلب باستخدام ملقط منحنية، القطع الأوردة والشرايين التي تعلق على القلب. المكان على الفور قلب في المخزن رذاذ الثلج الباردة إلى إبطاء تقلص العضلات.
    10. وضع القلب في طبق بتري تحتالمجهر تشريح (مكان على قطعة صغيرة من 215 ميكرون شبكة للمساعدة في شل خلال تشريح). تقليم أي نوع من الأنسجة الزائدة غير القلب باستخدام مقص القزحية الجميلة. توخي الحذر عند قطع بالقرب من الشريان الأورطي.
    11. القطع الشريان الأورطي بالقرب من الشريان brachioencephalic، والحرص على عدم السماح لفقاعات أو الحطام الأنسجة تدخل الافتتاح.
    12. ملء طبق بتري تحتوي على القلب مع عازلة الجليد نضح الباردة مثل أن مستوى السائل يرتفع فوق افتتاح قنية. غمد الشريان الأورطي على قنية مثل هذا غيض هو مجرد البعيدة للصمام الأبهري.
      TIP: لتقليل خطر الانسداد الهواء، خفض طفيف في المحقنة على قنية قبل إقناء؛ إدخال القنية من أجل إزالة فقاعات الهواء المحتملة التي قد وضعت في نهاية قنية. بالإضافة إلى ذلك، والحفاظ على غيض من قنية والشريان الأورطي تحت سطح الحل لتجنب إدخال فقاعات في حين تغليف الشريان الأورطي.
    13. الشريحة مسبقا مرتبطة-7-0 خياطة الحرير أسفلرمح من الإبرة إقناء؛ إدخال القنية والموقف العادل فوق رأس الإبرة. تشديد عقدة مع ملقط غرامة. كرر هذه الخطوة مع خياطة الثانية وضعت للتو فوق أولا.
      ملاحظة: تأكد من رأس الإبرة لا يزال فوق الصمام الأبهري قبل وبعد تشديد.
    14. خفض ببطء حقنة لإخراج 0.5 مل من العازلة نضح من خلال الأوعية الدموية التاجية.
      ملاحظة: إذا كان إقناء؛ إدخال القنية بنجاح، يتم تصور الدم تاركا الأوعية الدموية التاجية وحشد من الأوردة الظهرية والشرايين.
      هام: الساعة من فتح التجويف الصدري (على وجه الخصوص، ثقب الحجاب الحاجز) المبدئي نضح يجب أن يكون الحد الأدنى للحد من التعرض ميتة وتحقيق أقصى قدر من البقاء على قيد الحياة وبصحة العضلية معزولة. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هذا وقتا أقل من 5 دقائق.
  3. نضح
    ملاحظة: نضح الوراءجهاز يمكن تشغيلها بسهولة في بيئة نظيفة على مقاعد البدلاء المختبر القياسية أو وضعها في غطاء تدفق الصفحي لتحقيق أقصى قدر من العقم. ومع ذلك، بعد نضح كاملة، يجب أن يتم تنفيذ العمل في إطار تدفق الصفحي للحد من التلوث.
    1. بلطف ولكن بحزم إزالة مركز قنية من الحقنة (باستخدام القفازات المعقمة) من قبل التواء ببطء ذهابا وإيابا. في حين سحب الإبرة إقناء؛ إدخال القنية الخروج من المحاقن، وإخراج ببطء عازلة نضح في محور إبرة لمنع فقاعات الهواء خلال نضح.
    2. إزالة أنبوب إعادة تدوير الصيد من دون منفذ ميناء نضح واستبدالها مع كوب الصيد النفايات. تعلق المحور الإبرة إلى محول LUER التي يتم إصلاحها إلى ميناء نضح منفذ (الشكلان 1 و 2) على سترة المياه، بينما يتم تشغيل المضخة في وضع أدنى (15 دورة في الدقيقة، ~ 6 مل / دقيقة).
      تلميح: عند ربط محور الإبرة إلى محول LUER، تسمح المخزن المؤقت نضح يقطر الى Connect إلى السائل في محور إبرة من أجل تجنب إدخال فقاعات.
    3. يروي القلب دون إعادة تدوير حتى يتم يستنشق 8 مل من العازلة نضح بواسطة خرطوم مدخل.
      ملاحظة: حجم العازلة نضح يستنشق عن طريق خرطوم مدخل في هذه الخطوة تفترض حجم القتلى من 7 مل لنظام نضح، أي ما مجموعه 15 مل من العازلة نضح من خلال ضخ القلب.
    4. إزالة أنبوب مدخل من المخزن المؤقت الارواء. سماح للهواء أن يستنشق عن طريق مدخل لمدة تقل عن حجم القتلى من النظام.
      ملاحظة: حجم الهواء يستنشق في هذه الخطوة يجب تعديلها لمنع الهواء من الدخول إلى الأوعية الدموية التاجية (راجع الخطوة 1.3.7).
    5. وضع أنبوب مدخل في المخزن المؤقت الهضم (الجدول 1)، وذلك فوق الجزء السفلي من الأنبوب. إطعام ببطء والسماح للأنبوب مدخل إلى نضح ما يكفي من حجم لتجنب الملئ الأنبوب.
    6. تصور واتبع فقاعة الهواء بينالمخزن المؤقت نضح وعازلة الهضم كما أنه ينتقل عن طريق سترة الحرارة. مراقبة مستوى من العازلة نضح في مركز سترة الحرارة تبدأ في الانخفاض مرة واحدة فقاعة الهواء تصل إلى غرفة-محتدما دي. عندما يصل المخزن المؤقت الهضم غرفة-محتدما دي، فإن مستوى السائل في سترة الحرارة تبقى ثابتة.
      هام: إذا كان مستوى العازلة نضح قطرات منخفضة جدا، إغلاق محبس مخرج وفتح محبس تنفيس. السماح لمستوى ليرتفع إلى مستوى مريح (3-5 بوصات فوق ميناء منفذ). ثم، ووقف ضخ نضح وإغلاق محبس تنفيس. فتح محبس الميناء منفذا وإعادة تشغيل مضخة نضح.
    7. مشاهدة حل الخارجة من القلب. كما آخر من المنطقة العازلة نضح يترك القلب ويبدأ المخزن المؤقت الهضم من خلال تعميم القلب، وتغير اللون من الواضح إلى البني الفاتح وسيراعى بسبب وجود كولاجيناز.
    8. يروي القلب مع العازلة الهضمما يقرب من 10-15 دقيقة. ستبدأ قلب التراخي كما هو تدهور الكولاجين ويفقد الدعم الميكانيكي.
  4. التفكك الميكانيكية وتنقية
    1. إزالة القلب من قنية مع ملقط ومكان في طبق بتري الجاف. تقليم بسرعة الأنسجة خارج البطين باستخدام مقص القزحية الجميلة. نقل البطينين إلى طبق بتري تحتوي العازلة نضح جديدة لغسل. نقل طبق بتري إلى غطاء العقيمة ونقل البطينين إلى ذلك، طبق بتري الجاف النقي.
    2. جمع 7.5 مل من العازلة الهضم من سترة الحرارة وإضافة 2.8 ميكرولتر من 1 M CaCl 2، مزيج من قبل انقلاب. إضافة 2-3 مل من العازلة الهضم مع CaCl 2 إلى البطينين في طبق بتري.
      ملاحظة: إن تركيز الكالسيوم 2+ يتم رفع 300-700 ميكرومتر
    3. يسحن بسرعة الأنسجة البطين مع ملقط غرامة، بحيث أن معظم القطع هي أصغر من 1 مم 3. إضافة البقاءجي عازلة الهضم الكالسيوم 2+ تستكمل من الخطوة 1.3.2 إلى البطينين فصلها في طبق بتري ومزيج من قبل الإثارة لطيف.
    4. وضع طبق بتري في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تحريض على طبق بتري كل دقيقة 2 حتى تم الإفراج العضلية الكافية (انظر الملاحظة أدناه) من الأنسجة.
      ملاحظة: طول الحضانة قد تحتاج إلى تعديل لضبط درجة الهضم وفقا لاحتياجات التجربة. عموما، مرات حضانة أطول زيادة المحصول والنقاء، ولكن يمكن أن يقلل من معدل مرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة. 5-10 دقائق كافية بشكل عام لتحقيق عائد مرتفع (~ 5-10 × 10 5 خلايا في القلب).
    5. نقل طبق بتري إلى غطاء تدفق الصفحي. باستخدام ماصة نقل قطع بزاوية 45 درجة، وبلطف ماصة الأنسجة لزيادة فصل.
    6. استخدام قفازات معقمة لاضعاف شبكة 215 ميكرون في مخروط وعقد أكثر من 50 مل المخروطية. ماصةتعليق الأنسجة نأت على شبكة والسماح الترشيح لتصب في مخروطي 50 مل. استخدام 7.5 مل من قبل تحسنت وقفة العازلة (الجدول 1) لغسل العضلية من طبق بتري خلال شبكة، مع الجمع بين الترشيح الأول.
      ملاحظة: يتم رفع الكالسيوم 2+ إلى النهائي 1.1 ملم والنهائي 2.5٪ FBS في المخزن المؤقت توقف تحييد نشاط الأنزيم البروتيني.
    7. نقل تعليق خلية إلى مخروطي 15 مل، والسماح لتسوية عن طريق الجاذبية لمدة 15 دقيقة.
    8. إزالة بعناية طاف مع ماصة نقل هذه أن فقط 50-100 ميكرولتر من الحل لا يزال أعلى من الخلايا. إضافة 10 مل من قبل تحسنت، وسائل الإعلام ثقافة معايرتها (الجدول 1) وتخلط بواسطة قلب لطيف. السماح للالعضلية لتسوية عن طريق الجاذبية لمدة 15 دقيقة.
      TIP: زيادة نقاء، كرر الخطوة 1.4.8 كما تريد.
    9. إزالة بعناية طاف مع ماصة نقل من هذا القبيل أن فقط 50 - ميكرولتر 100 سيبقى و حل فوق الخلايا.

2. Cardiomyocyte الثقافة

  1. قبل معطف زراعة الأنسجة معاملتها أطباق بتري مع laminin (10 ميكروغرام / مل) وتخزينها في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل خلايا الطلاء. فقط قبل الطلاء، ونضح الحل laminin من لوحة زراعة الأنسجة. يغسل مرة واحدة مع MEM أو برنامج تلفزيوني، ثم نضح السائل المتبقي لإزالة laminin غير كثف.
  2. إضافة ما يكفي من قبل تحسنت، وسائل الإعلام ثقافة معايرتها لتحقيق كثافة الخلية المطلوبة، مزيج من قبل انعكاس لطيف. لوحة المرجوة تركيز الخلايا في سفينة الثقافة (عادة 5-20 × 10 4 خلية / سم 2). لتقييم العائد من العزلة cardiomyocyte، عد الخلايا عن طريق عدادة الكريات أو اختبار لوحة عن طريق فحص كثافة تحت المجهر. قلب فأر بالغ يوفر عادة 0،5-1،0 × 10 6 خلايا في هذه المرحلة من البروتوكول.
    تلميح: إذا كنت تستخدم 96 لوحات جيدا، استخدام micropip 1000 ميكرولترETTE مع طرف قطع بزاوية 45 درجة للحد من تلف الخلايا المقرر أن القص قوة. مكان غيض ماصة بحيث أنه لمس قاع البئر خلال طرد تعليق خلية من أجل تقليل مقدمة من الفقاعات.
  3. نقل طبق زراعة الخلايا على وجه السرعة إلى 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة. تغيير وسائل الإعلام حسب الحاجة لمنع تحمض: كل 1-5 أيام اعتمادا على كثافة الخلية. تقليل التعامل مع الطبق الثقافة خلال أول 3-6 أيام لتسهيل المرفق إلى سطح خلية ثقافة.
    ملاحظة: لتقليل اضطرابات الخلية خلال التغييرات وسائل الاعلام عندما الخلايا لا تعلق تماما، إجراء تغيير نصف وسائل الإعلام. ببطء ونضح وسائل الإعلام مع الحفاظ على معلومات سرية ماصة تحت السطح من وسائل الإعلام. ثم إضافة ببطء وسائط إضافية عن طريق الحفاظ على طرف ماصة فقط فوق سطح وسائل الإعلام ضد جدار صحن الثقافة.
  4. لتقييم جدوى العضلية، وتحققالتشكل تحت المجهر brightfield. حديثا العضلية المعزولة الحفاظ على التشكل تقريبا على شكل قضيب مع حواف حادة واضحة تحت إضاءة brightfield (الشكل 2).
    ملاحظة: تأكيد جدوى من تلطيخ الخلايا مع الأزرق التريبان.
  5. لتقييم نقاء العزلة cardiomyocyte، والتحقق من التشكل خلية لتحديد العضلية. وصمة عار على النوى مع Hoescht 33342 لتحديد مجموع الخلايا.
    ملاحظة: يمكن تحديد العضلية من غير العضلية عن طريق التشكل المميزة ل(قضيب شكل) وحجم (حوالي 100-200 ميكرون في الطول). بدلا من ذلك، سوف العضلية المعزولة حديثا وصمة عار إيجابي لعلامات-cardiomyocyte محددة، مثل ألفا actinin 26 (الشكل 3C، D) أو القلب تروبونين تي 27

3. تنبيغ الجينات مع اتش

  1. إعداد المحللة خلية اتش باستخدام م أنشأتethods 21 تنبيغ والعضلية باستخدام المحللة خلية من خلايا منتجة اتش 10. في يوم 0 أو 1 يوم بعد العزلة، إضافة بعناية المحللة الخلية إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على العضلية.
    ملاحظة: سوف إعداد اتش ارتفاع عيار تحقيق تعبير قوي في حوالي 48-72 ساعة. ضبط وافر من العدوى لتتناسب مع التصميم التجريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وهناك نوع الكبار البرية مجلس النواب (CD1) الماوس القلب ينتج عادة 500000 إلى 1000000 العضلية من العزلة الناجحة. مباشرة بعد العزلة، والحفاظ على الخلايا مظهر معظمها على شكل قضيب (الشكل 3A) مع ساركومير سليمة، ويمكن استخدامها للدراسات الفنية التي تنطوي على cardiomyocyte انقباض. وهناك نسبة عالية من العضلية على شكل قضيب (فوق 90٪) وهذا مؤشر التروية والهضم الفعال. سوف العضلية قابلة للحياة أن تكون كبيرة (~ 100-200 ميكرون في الطول) ويبدو أن لديهم الغشاء الخارجي حاد تحت brightfield الإضاءة (الشكل 3A). المناعية للعلامات الساركومير-cardiomyocyte محددة، مثل ألفا actinin، سيؤدي إلى نمط النطاقات الساركومير متميزة (الشكل 3C). بالتزامن مع التحليل الصرفي وتلطيخ النووي مع دابي، المناعية يمكن استخدامها لتقييم نقاء العضلية معزولة. Fibrأقاليم سوف تكون صغيرة ومستديرة بعد العزلة، ولكن سوف نعلق بسرعة وتنتشر رقيقة على البلاستيك زراعة الخلايا، مما يمكن تمييز سطحي من العضلية.

هناك نسبة ضئيلة من العضلية على شكل قضيب وهذا مؤشر على عزلة ناجحة. وهذا يمكن أن تنجم عن عدم يقني؛ يدخل القنية بسرعة الشريان الأورطي بعد يتم استخراج قلب من الحيوان. نضح غير فعالة، وذلك بسبب انسداد الهواء أو إقناء؛ إدخال القنية غير صحيح على سبيل المثال، يمكن أيضا أن تؤثر على التشكل وجدوى العضلية.

بعد عدة أيام في الثقافة، تفترض العضلية التشكل مدورة (الشكل 3B). ضمن 1-2 أسابيع، العضلية الحية نعلق على الركيزة وتبدأ نشر (الشكل 3D، E). الخلايا الميتة يمكن تحديدها من خلال إدراج التريبان الأزرق. وهناك العزلة وثقافة ناجحة تسفر عن ما يقرب من 50٪ القلب الحيmyocytes بعد 1 أسبوع. التلوث غير العضلية، مثل الخلايا الليفية سوف يؤدي إلى ارتفاع نسبة هذه الخلايا في وقت لاحق في الثقافة نظرا لإمكانية التكاثري بهم. ويمكن تجنب ذلك عن طريق زيادة عدد من الترسبات الجاذبية و / أو من خلال ما قبل الطلاء لزيادة نقاء 28

تنبيغ مع اتش يمكن استخدامها لتحقيق التعبير الجيني قوي داخل 48-72 ساعة (الشكل 3E). اتش المصلي 5 فعال في transducing العضلية الماوس الكبار في المختبر بسبب التعبير عالية من مستقبلات coxackie اتش، ولكن قد يعتمد على نوع وسائل الإعلام المستخدمة. 20

شكل 1
الشكل 1. Cardiomyocyte المعدات عزل والأجهزة. (A) الأدوات الجراحية المستخدمة لاستخراج الماوسالقلب ويقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي، من أعلى إلى أسفل: المرقأة، ملقط الأنسجة، ملقط منحنية، دومون # 5 ملقط غرامة، مقص تشريح الصغيرة، القزحية الجميلة مقص، مقص ضغط الدقيقة (ب) نظام نضح Langendorff تستخدم لهضم قلب فأر. . ويستنشق مخازن نضح من خلال أنبوب مدخل (1) بواسطة مضخة نضح (2) وذلك من خلال أنبوب مضخة منفذ (3) في مدخل الميناء على سترة المياه الساخنة (4). وارتفعت درجة حرارة مخازن نضح من سترة المياه ساخنة أثناء سفرهم من خلال أنبوب حلزوني من الزجاج، وغرفة debubbling، ومن ثم الخروج من الإبرة إقناء؛ إدخال القنية التابعة لميناء نضح مخرج (5)، وهي متصلة بواسطة محبس. أنبوب مخروطي أدرك أقل من مخازن التروية، والتي يتم إعادة تعميمه من خلال أنبوب مدخل. ميناء الضغط (6)، ميناء الامتثال (7)، وتنفيس (8) تبقى مغلقة خلال نضح من أجل الحفاظ على معدل تدفق ثابت. يتم تسخين سترة المياه عن طريق حمام مائي تعميم يدخلون من خلال ال ه سترة مدخل (9) ومخرج (10) والموانئ. ويستخدم موقف حلقة لعقد سترة ساخنة المياه في وضع عمودي (المشابك الحمراء، قاعدة سوداء تحت الأرجواني رف أنبوب مخروطي). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تخطيطي لمحة عامة عن نظام الإرواء. وإعتبر أجزاء مهمة من جهاز نضح على النحو المشار إليه في المخطوطة. يشار اتجاه تدفق العازلة نضح بها السهام. لاحظ تمركز قنية الشريان الأبهر، وينبغي أن يكون طرف منها وضوحا من خلال الشريان الأورطي شفافة، وضمان يتم وضعها فوق الصمام الأبهري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (3)
الشكل 3. عزل الكبار ماوس العضلية. وهل العضلية معزولة والمصنفة على Laminin المغلفة-96 لوحات جيدا كما هو موضح في هنا البروتوكول. (A) العضلية المعزولة حديثا، المصنفة في حوالي 8000 خلية / سم 2. لاحظ أن المعزولة حديثا، العضلية قابلة للحياة ويبدو أن ما يقرب من قضيب على شكل مع حواف حادة (رأس السهم الأبيض). ومع ذلك، العضلية التي تظهر لديهم الغشاء الخارجي منتشر تحت brightfield لقوا حتفهم. خلال الأيام القليلة الأولى من الثقافة، تفترض العضلية شكل مستدير (B). (C) المناعية لألفا actinin (الأخضر) يكشف النطاقات الساركومير مميزة في cardiomyocyte في D1 بعد العزلة. وصمة عار النووية (دابي) التي تظهر باللون الأزرق. التكبير أعلى يظهر صورة من المنطقة المبينة في الصورة السفلى. (D) (E) Brightfield وصور epifluorescent تظهر العضلية في يوم 11 بعد العزلة transduced مع اتش يحمل مراسل GFP تحت سيطرة المروج CMV ( هدية من روبرت جيرارد في يوتا جنوب غرب). وكانت المصنفة الخلايا في حوالي 18000 خلية / سم 2 وكانت transduced يوم 0 باستخدام عدد وافر من إصابة ما يقرب من 800 وحدة تشكيل اللويحات (PFU) في كل خلية. أشرطة النطاق: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عازلة Cardiomyocyte العزلة (CIB)
إضافة 900 مل من الماء عالى النقاء إلى دورق نظيفة تحت ماجالتحريك الوراثي.
إضافة مكونات عازلة في الجدول كما هو محدد.
مكون ميغاواط النهائي اضرب (ملم) 1X (ز / لتر)
كلوريد الصوديوم 58.44 120 7.013
بوكل 74.55 5.4 0.403
نا 2 HPO4.7H 2 O 268.07 0.33 0.088
MgSO 4 .7H 2 O 246.48 0.5 0.123
التورين 125.1 30 3.753
BDM 101.1 10 1.011
HEPES 238.3 25 5،958
جلوكوز 180.16 22 3،964
ضبط درجة الحموضة خفة دمح 5 م هيدروكسيد الصوديوم.
ضبط مستوى الصوت إلى 1 L مع الماء عالى النقاء.
تصفية العقيمة ث / 0.22 ميكرومتر مرشح فراغ.
إضافة 0.5 ميكرولتر من 0.1 U / الانسولين مل لكل لتر من العازلة cardiomyocyte العزلة.
عازلة نضح
مكون نهائي الحجم (مل)
البنك التجاري الدولي - 200
EGTA (0.4M) 0.4 ملم 0.2
مجموع - 200
عازلة الهضم
مكون نهائي كمية
البنك التجاري الدولي - 15 مل
CaCl2 (1M) 300ميكرومتر 4.5 ميكرولتر
البروتيني الرابع عشر 0.2 ملغ / مل 3 ملغ
كولاجيناز الثاني 2.4 ملغ / مل 36 ملغ
مجموع - 15 مل
عازلة توقف
مكون نهائي الحجم (مل)
عازلة نضح 95٪ 14.25
CaCl2 (1M) 1.5 ملم 22.5
FBS 5٪ 0.75
مجموع - 15 مل
اعلام ثقافي
مكون نهائي ٪ الحجم (مل)
وسائل الإعلام MEM 90٪ 90
FBS 10٪ 10
Primocin 0.2٪ 0.2
مجموع 100٪ 100 مل
السماح لوسائل الإعلام والثقافة لكي تتوازن عند 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

الجدول 1: حلول والمخازن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الصحة العامة للالعضلية معزولة تعتمد على عدة جوانب هامة من هذا البروتوكول. أولا، الوقت من استخراج القلب لنضح أمر بالغ الأهمية ويجب أن يتم تنفيذ في 5 دقائق أو أقل. إزالة الكالسيوم يساعد على فصل التفاعلات خلية خلية، ولكن يمكن أن تؤثر سلبا على صحة الخلايا على المدى الطويل. 29-32 وهكذا، نجد أنها كافية لإزالة الكالسيوم خلال الدقائق القليلة الأولى من نضح بواسطة EGTA (جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic) عملية إزالة معدن ثقيل، 22 ولكن سرعان ما استعادة الكالسيوم أثناء عملية الهضم والخطوات اللاحقة.

استخدام البروتيني الرابع عشر يحسن كثيرا من كفاءة الهضم مقارنة كولاجيناز وحدها. وهذا يقلل من التضارب بسبب كولاجيناز تقلب دفعة، 18،24، ويزيد من نقاء العضلية من خلال تسهيل الانفصال خلال الترسيب الجاذبية. ومع ذلك، والإفراط في الهضم ومنع مرفق فعال لالركيزة الثقافة، لذلك أنا توازن دقيقق اللازمة لتحسين العائد الخلية ونقاء مع الحفاظ على مرفق الخلية وقدرتها على البقاء. وهكذا، فإن تركيز البروتياز وطول الهضم ويمكن تعديلها لتتناسب مع أهداف التجريبية. بشكل عام، وعلى درجة أقل من الهضم تعزيز المرفق وبقاء العضلية. تم الإبلاغ عن استخدام التربسين في بعض البروتوكولات cardiomyocyte العزلة. 18 ومع ذلك، إضافة التربسين إلى كوكتيل البروتيني المستخدمة هنا (كولاجيناز والرابع عشر البروتيني) يقلل من البقاء على المدى الطويل من العضلية في الثقافة، وربما يرجع ذلك إلى الإفراط في الهضم أو الانقسام من سطح الأساسي و / أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية.

إدراج monoxime butanedione (بي دي إم) خلال العزلة يمنع تقلص العضلات القلبية، وبالتالي يقلل من الآثار السلبية بسبب انكماش المحطة، استهلاك الطاقة، والمفارقة الكالسيوم. 29،33 ومع ذلك، في تجربتنا، وإزالة BDM قبل ثقافة تسرع dedifferentiatio ن وتمكن خلايا الجسم على التكيف مع الثقافة في بعدين.

من المهم أن نلاحظ أن التعديلات على المدى الطويل لثقافة 2-D قد يؤثر على الجوانب الفنية للالعضلية، مثل انقباض. وبالتالي، يجب أن يتم تنفيذ انقباض والكهربية التجارب بعد العزلة، عندما تنظيم الساركومير الأم لا تزال على حالها في وقت قريب. وعلاوة على ذلك، كما هو الحال مع أي تجربة في المختبر، والخلايا في ثقافة خالية من بعض التأثيرات خارجي الموجودة في الجسم الحي، مثل الإشارات الخلطية أو المناعية. من ناحية أخرى، يمكن أن تنفذ تعريف المشترك الثقافات لدراسة التفاعلات بين العضلية وأنواع الخلايا الأخرى. 5،34 بالإضافة إلى ذلك، في الثقافة المختبر يمكن استخدامها لدراسة السلوك cardiomyocyte مع الإشارات الجزيئية المحددة في وسائل الإعلام والثقافة. وهكذا، فإن الأهداف العامة للتجربة ينبغي النظر بعناية وزنه ضد القيود ومزايا هذا النظام الثقافة.

معشوقة = "jove_content"> وصف بروتوكول هنا يستخدم 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لتحسين قابلية الخلايا العضلية الأولية في الثقافة. 35 وتجدر الإشارة إلى أن FBS وغيرها من الأمصال المشتقة من الحيوانات تحتوي على مكونات غير معروفة يمكن أن تؤثر على وظائف الخلية . 36،37 وعلى الرغم من وجود تقدير جيد من عوامل النمو في FBS، 38 الثقافات cardiomyocyte المعروضة هنا لا تتكاثر. بدلا من ذلك، كتلة دورة الخلية ويبدو أن خاصية المستمرة العضلية الماوس الكبار خارج الحي، حافظت من خروج دورة الخلية أثناء فترة ما حول الولادة التنمية. 12،39 هذه الخاصية هي من مصلحة كبرى في مجال الطب التجديدي القلب، حيث وكان الارتداد العضلية الثدييات الكبار إلى النمط الظاهري التكاثري هدف متابعتها بشكل كبير. 3،26،40-42 والجدير بالذكر، أنه من غير الواضح حاليا ما فقد التمايز درجة مطلوبة من أجل العضلية لإعادة إدخال دورة الخلية، ولكن contributioن من فقد التمايز إلى تجديد في الفقاريات الدنيا ويدعم كذلك 43،44،10،11 وعلاوة على ذلك، يتزايد احظ فقد التمايز في انتشار cardiomyocyte وتجديد القلب في نظم الثدييات، على الأقل على المستوى الوظيفي، بما في ذلك التفكيك myofibrillar 6،12،9 وهكذا، فإن حالة من التفريق بين العضلية في ثقافة يجب أن تدرس بعناية والتضمين وفقا لاحتياجات أهداف البحث. على هذا النحو، فإن الظروف الثقافة يمكن أن يحتمل مزيد من التعديل للحد من تركيز مصل الدم، واستخدام المعرفة بدائل الدم أو وسائل الإعلام خالية من المصل. على سبيل المثال، كانت العضلية الفئران الكبار اظهار ساركومير تنظيم مثقف على المدى الطويل دون المصل، ولكن استخدمت عوامل النمو مثل عامل نمو الخلايا الليفية، عامل نمو البشرة، وثلاثي يودوثيرونين في وسائل الاعلام محددة. 45 فمن المتصور أن الصياغات إعلامية مماثلة، أو يحتمل أن البعض تركيبات مثل تلك مقتبسة من differentiبروتوكولات أوجه، 46 يمكن استخدامها للحفاظ على العضلية الماوس الكبار متباينة بشكل جيد في الثقافة التي تعرض الهياكل الساركومير درجة عالية من التنظيم. ويمكن أيضا أن وضعت صياغات بديلة لتحقيق الظواهر الأخرى (مثل العضلية دي-متباينة للغاية) 6 اعتمادا على احتياجات التجربة، ولكن سوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل.

وقد تورط دور الخلايا الليفية في السيطرة على الأطفال حديثي الولادة الماوس cardiomyocyte خلية دورة 5 والفأر الكبار cardiomyocyte التمايز (من خلال إشارات IL6 الضخامي) في الثقافة على المدى الطويل. 19 ومن هنا ينبغي أخذها في الاعتبار نمو الخلايا الليفية في ثقافة لفي التفسيرات التجريبية . يمكن السيطرة على نمو الخلايا الليفية في ثقافة بإضافة النمو تقيد المركبات مثل السيتوزين الأرابينوزيد 19 (أراك) أو من خلال الخطوات قبل الطلاء. 28 ومع ذلك، سوف أراك تمنع أيضا نمو الخلايا العضلية، بديل لذلكوينبغي أن تستخدم أساليب للسيطرة على نمو الخلايا الليفية في الدراسات المتعلقة دورة الخلية cardiomyocyte. في بروتوكول الموصوفة هنا، والنقاء cardiomyocyte الأولي يمكن أن تتعزز من خلال تكرار الخطوة خطورة الترسيب (انظر 1.4.8).

الطرق توفر هذه الوثيقة نظام في المختبر والتي يمكن استخدامها لدراسة طبيعة الحصار دورة الخلية cardiomyocyte الثدييات الكبار. وعلى النقيض من الخلايا الأولية من الكائنات الحية الأخرى، مثل الفئران أو خنزير غينيا، العضلية الماوس الأولية تقدم ثروة من الأدوات الجينية القوية وتتميز بشكل جيد، مثل النسب استنادا لجنة المساواة العرقية تتبع نماذج تدق في، 47 والتي يمكن استخدامها بسهولة ل تحديد الخلايا المشتقة من العضلية الموجودة مسبقا. 12،48 بالإضافة إلى ذلك، قد تعرضوا الكبار الأساسي العضلية الفئران للشروط التنموية المحلية التي تنتج في الحصار دورة الخلية، على عكس خطوط الخلايا وفاق متباينة أو خلايا IPSC 46 التي، على الرغم مريحه لهمم، والقدرة على التكيف مع شاشات كبيرة للمخدرات، قد يكون 2 فائدة محدودة في التجارب التي تحقق في طبيعة cardiomyocyte الكبار خروج دورة الخلية.

ويحدد هذا البروتوكول طريقة موثوق بها لعزل والثقافة العضلية الماوس الكبار. وقد أظهرت العديد من الطرق سابقا عزلة العضلية الماوس الكبار للدراسة على المدى القصير، ولكن حتى الآن، وجود عدد قليل من التقارير من الثقافة على المدى الطويل العضلية الكبار الفأر. 18،19 القدرة على الحفاظ على العضلية الماوس الكبار في الثقافة يجب تمكين الدراسة في المختبر البيولوجيا cardiomyocyte تحت ظروف تجريبية تتطلب عناية طويلة الأمد. على سبيل المثال، التعبير الجيني يمكن التلاعب بها باستخدام ناقلات اتش، والتي تتطلب عادة بضعة أيام لتحقيق التعبير الكامل. قد تتطلب تغييرات المظهري اللاحقة وتحليل فترات أطول من الوقت اعتمادا على أهداف تجريبية. الأساليب المقدمة هنا تسمح للثقافة cardiom الماوس الكبارyocytes لعدة أسابيع. هذا ينبغي أن توفر نظام قوي للتحقيق في المسائل الحكيمة في علم الأحياء cardiomyocyte، مثل تلك المتعلقة تنظيم دورة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية الاختراق (ممولة جزئيا من قبل مؤسسة ساندلر)، والمعاهد الوطنية للصحة الطريق إلى جائزة الاستقلال (R00HL114738)، ومؤسسة إدوارد مالينكرودت الابن. وأيد JJ من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من المعاهد الوطنية للصحة (T32HL007731). الكتاب هي وحدها المسؤولة عن محتويات هذه الأعمال، التي لا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Heated water jacket Radnoti 158831
Circulating heated water bath, Isotemp Fisher Scientific 3013
Laboratory pump Watson-Marlow 323
Hemostats Exelta 63042-090
Tissue forceps VWR 470128034
Dumont #7 curved forceps FST 91197-00
Dumont #5 fine forceps FST 11251-20
Small dissection scissors VWR 470128034
Extra fine bonn scissors FST 14084-08
Fine spring scissors FST 91500-09
Name Company Catalog Number Comments
Materials
NaCl Sigma S9888
KCl Sigma P9541
Na2HPO4.7H2O Fisher S25837
MgSO4.7H2O Fisher S25414
Taurine Sigma 86329
Butane dione monoxime (BDM) Sigma B0753
HEPES Fisher  BP310100
Glucose Sigma G-7021
Insulin Novo Nordisk 393153
EGTA Amresco 0732-288
Protease, type XIV Sigma P5147
Collagenase II Worthington LS004176
MEM Corning 15-010-CV
FBS, heat inactivated JRS 43613
Primocin Invitrogen NC9141851
Ethyl Carbamate Alfa Aesar AAA44804-18
215 micron mesh Component supply U-CMN-215-A
20 G blunt ended needle Becton Dickinson 305183
20 G beveled needle Becton Dickinson 305176
Lab tape VWR 89097-990
Surgical tape 3M 1527-0
Silk suture, 7-0 Teleflex 15B051000
Mouse anti-alpha-actinin antibody Sigma A7811
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody Thermo Fisher A21121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  2. Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
  3. Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
  4. Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
  5. Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  6. Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
  7. Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
  8. Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
  9. Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
  10. Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  11. Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  12. Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  13. Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
  14. Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
  15. Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
  16. Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
  17. Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
  18. Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
  19. Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
  20. Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
  21. Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
  22. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
  23. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
  24. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
  25. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
  26. Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  27. Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
  28. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
  29. Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
  30. Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
  31. Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
  32. Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
  33. Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
  34. Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
  35. Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
  36. Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
  37. Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
  38. Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
  39. Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
  40. Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
  41. Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
  42. Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
  43. Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
  44. Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
  45. Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
  46. Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
  48. Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 114، العزلة cardiomyocyte، والثقافة، وطريقة، التنبيغ، والكبار، والماوس
العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N.… More

Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), e54012, doi:10.3791/54012 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter