Abstract
Dyrkede cardiomyocytter kan anvendes til at studere cardiomyocyte biologi anvendelse af teknikker, der er komplementære til in vivo-systemer. For eksempel, renhed og tilgængeligheden af in vitro-dyrkning giver fin kontrol over biokemiske analyser, levende billedbehandling og elektrofysiologi. Langsigtet kultur af cardiomyocytter giver adgang til yderligere eksperimentelle metoder, som ikke kan gennemføres i kortsigtede kulturer. For eksempel in vitro undersøgelse af dedifferentiering, cellecyklus genindrejse, og celledelingen har hidtil stort set været begrænset til rottecardiomyocytter, som synes at være mere robust i langsigtet kultur. Imidlertid er tilgængeligheden af en rig værktøjssæt af transgene mus linjer og veludviklede sygdomsmodeller gør muse systemer attraktive for kardial forskning. Selv om flere rapporter findes i voksne mus cardiomyocyte isolation, få undersøgelser viser deres langsigtede kultur. Præsenteret her er en trin-for-trin metode tilisolering og langtidsdyrkning af voksne mus cardiomyocytter. Først retrograd Langendorff-perfusion bruges til effektivt fordøje hjerte med proteaser, efterfulgt af gravitationssedimentation oprensning. Efter en periode med dedifferentiering efter isolering, cellerne gradvist vedhæfte til kulturen, og kan dyrkes i ugevis. Adenovirus cellelysat bruges til effektivt at transducere de isolerede cardiomyocytter. Disse metoder giver en enkel, men kraftfuld model-system til at studere hjerte-biologi.
Introduction
Dyrkede cardiomyocytter anvendes hyppigt til at overvåge celle adfærd i en velkontrolleret miljø in vitro. For eksempel kan morfologiske, elektriske, biokemiske, eller mekaniske celleegenskaber studeres på manipuleret substrater, 1,2 i definerede medier, og som reaktion på lægemidler med små molekyler, peptider, genregulering, 3 eller elektrisk stimulation. 4 cellulære indhold kan også styres ved hjælp af definerede co-kulturer. 5 Disse in vitro-forsøg er nyttige i store stof eller genetiske skærme og supplere in vivo-metoder for forskellige typer af undersøgelser, der involverer cardiomyocyte biologi.
Langsigtet kultur muliggør eksperimentelle muligheder, der kræver længere tid til at opnå fænotypisk forandring. En rettidig eksempel er voksne pattedyr cardiomyocyte spredning, hvor dedifferentiering, cellecyklus genindrejse, og celledeling typisk undersøgt over seVeral dage til uger. 6,7 Her den forlængede kultur tiden letter genetisk manipulation, 7,8 funktionel dedifferentiering (f.eks sarcomerisk demontering) 9 og potentielt transkriptionel dedifferentiering. 6 Efterfølgende cellecyklus genindrejse og celledeling kræver endnu længere kultur perioder at observere, især hvis flere runder af division er den eksperimentelle mål. Betydningen af cardiomyocyte celle-cyklus er centralt for flere nylige centrale videnskabelige værker i hjertet regenerering, hvor dedifferentieringen og proliferation af allerede eksisterende cardiomyocytter er blevet vist ansvarlig for hjerte regenerering i zebrafisk og neonatale mus. 10-12 Således muligheden at stimulere dedifferentiering og cellecyklus genindrejse i mammale voksne cardiomyocytter er fortsat et centralt spørgsmål i menneskets hjerte regenerering 13-15
I n vitro forsøg studerer cellecyklussen fra pattedyr cardiomyocytter har hovedsagelig anvendes rotte kilder på grund af deres relativt lette langtidsdyrkning sammenlignet med musemodeller. 16 imidlertid murine systemer tilbyder en rig ressource af velkarakteriserede transgene værktøjer og sygdomsmodeller, som er nyttige i både in vitro og in vivo protokoller. For eksempel har Cre-baserede afstamning sporing muliggjort identifikation af allerede eksisterende cardiomyocytter som en kilde til at regenerere myocardium i neonatale mus hjerte in vivo. 12 In vitro-undersøgelser af afstamning-sporet neonatale mus cardiomyocytter har aktiveret undersøgelse af interaktioner med stromale celler gennem co-kultur med fibroblaster. 5 Men på grund af dets udfordringer, eksisterer 17 få rapporter af isolering og langtidsdyrkning af voksne mus cardiomyocytter. 18,19
Isoleringen af levedygtige voksne mus cardiomyocytter til kortvarig kultur alene er kendt for at være en udfordrende opgave. Denne protocol giver trin-for-trin instruktioner om, hvordan man opnår levedygtige cardiomyocytter fra voksne mus, der kan bruges til både kortsigtede såvel som langsigtede undersøgelser. Cardiomyocytter isolerede ved hjælp af denne protokol kan effektivt transduceres med adenovirusvektorer 20,21 og dyrket i ugevis. Disse metoder giver et kraftfuldt system til at studere cardiomyocyte biologi in vitro.
De heri beskrevne metoder er baseret på en række elementer fra tidligere værker ved hjælp variationer af Langendorff retrograd perfusion. 18,22 Selvom flere protokoller er blevet offentliggjort på isolering af voksne mus cardiomyocytter for kortsigtet kultur og undersøgelse, 23-25 den fordel, denne protokol er evnen til at dyrke isolerede cardiomyocytter lang sigt. Dette vil være nyttigt i studiet af cellulære processer, der involverer ektopisk genekspression og kræver længere perioder, såsom i cellulære omprogrammering strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurerne her er blevet godkendt af Institutional Animal brug og Omsorgsudvalget ved University of California, San Francisco.
BEMÆRK: I korte træk, efter ekstraktion af hjertet fra muse brystkasse, er koronar retrograd perfusion bruges til effektivt at fordøje den ekstracellulære matrix med collagenase og protease XIV. Ventriklerne isoleres derefter, dissocieret mekanisk og filtreret til en enkelt cellesuspension. Gravitationssedimentation udføres for at isolere cardiomyocytter, som er adskilt fra stromaceller som fibroblaster og endotelceller ved deres høje tæthed. De oprensede cardiomyocytter kan dyrkes i ugevis laminin-coatede polystyren og transduceret med adenovirus genvektorer.
1. cardiomyocyte Isolation
- Forbered buffere, Kirurgisk Station og Perfusion Apparatur
- Forbered buffere og medier efter Table 1.
- Slå cirkulerende vandbad, som er indstillet input sådan temperatur, at produktionen af opvarmet vand jakke når en temperatur på 37 ° C.
- Ren perfusionssystem ved gennemskylning med 70% ethanol. Fjern derefter alle spor af ethanol fra systemet ved skylning med flere volumener sterilt vand.
- Indlæse perfusionssystemet med perfusion buffer (tabel 1). Første drænvand fra systemet, derefter skylles med 2 volumener perfusion buffer. Derefter udfylde det døde rum med perfusionsbuffer således at den indre kolonne i varmekappe fyldes med perfusion buffer, men den afgasning kammeret er tomt.
TIP: Sørg for ingen luftbobler er til stede i linjen under afgasning kammer. For at fjerne genstridige bobler, engagere alle stophaner og tillade pres for at opbygge inde linjen for et par sekunder. Slip derefter nederste stophane, så det høje tryk perfusion buffer til jet ud af stikkontakten; den hurtige strøm og turbulence vil hjælpe løsne bobler, der er fanget i nærheden af perfusion stikkontakt. - Forbered en sprøjte med nål, der skal anvendes til aorta kanyle. Vedhæfte en 18 G stump nål til en 1 ml sprøjte fyldt med perfusion buffer. Fjern luftbobler og løse den monterede sprøjte til den ene arm af dissekere miscroscope illuminator med lab tape.
TIP: Hvis du vil oprette en stump nål fra en skrå nål, transektere nålen akslen med bidetang. Så finpudse spidsen med en slibning sten indtil spidsen er flad.
BEMÆRK: For at reducere glidning af aorta fra nålen under kanylering, ru aksel kanylering nål under anvendelse af et barberblad. Fastgør nålen ved navet og øvre skakt, derefter så skraberen frem og tilbage vinkelret på den lange akse af nåleskaftet under rotation indtil flere riller er blevet skabt 1 cm fra spidsen af nåleskaftet. Skift til en ny skraber når klingen bliver sløv. - Placer en renpetriskål under dissektionsmikroskop at indeholde hjertet under kanylering. Placer illuminator arm sådan, at spidsen af kanylen er nær kanten af synsfeltet, men ikke obstruerer dissektion. Sikre spidsen af kanylen er under kanten af petriskålen.
BEMÆRK: For at immobilisere hjertet under dissektion, placere en lille (-5 - 7 cm, 2) ligge på 215 mikron mesh i petriskålen. Når hjertet er placeret på denne maske, vil det skabe friktion for at reducere glidning og rotation af hjertet under mekanisk manipulation. - Bind 2 suturer med løse dobbelt overhånd knob og nav af kanylen nål, der skal anvendes til fastgørelse af aorta.
- Heart Udvinding og Kanylering
- Administrere heparin (5 IU / g legemsvægt) via intraperitoneal injektion. Vente 20 minutter for at tillade den heparin at cirkulere til hjertet.
- Bedøver musen ved intraperitoneal injicereion 20% ethylcarbamat (2 mg ethylcarbamat / g legemsvægt). Observere nøje indtil musen er under dyb anæstesi (ca. 3 - 5 min).
BEMÆRK: Dybt anæstesi bekræftes af en mangel på både tå knivspids og hornhinden reflekser. Hvis musen ikke har nået dyb anæstesi med 8 - 10 min, derefter administrere en yderligere dosis af ethylcarbamat. Selvom de enkelte reaktioner på anæstesi vil variere mellem mus, manglende indtaste dyb anæstesi ved første dosering kan indikere nedbrudt ethylcarbamat, som kan udelukke dybe anæstesi selv efter gentagen dosering. At forhindre nedbrydning fremstilles en frisk opløsning af ethylcarbamat før hver brug. - Immobilisere mus til kirurgi platform ved at sikre hvert ben med kirurgisk tape. Desinficer snittet med en liberal beløb på 70% ethanol. Pat tør med en lab-tørre.
- Løft huden med væv pincet lige under brystbenet. Foretag en lateral incision med en lille saks, skæring throUH huden og abdomen.
- Brug hemostats til forsigtigt at løfte brystkassen via brystbenet. Brug små dissektion saks, forlænge snit i en V-form mod aksillerne. Skære igennem den første ribbe og punktere membranen på hver side.
- Fortsæt med at løfte brystkassen med hemostats og bruge små iris saks til helt transektere mellemgulvet. Pas på ikke at punktere hjerte.
- Tilbagetrække brystkassen rostrally hjælp vedhæftede hemostats og hurtigt, men omhyggeligt forlænge V-form indsnit ved at skære gennem brystkassen mod aksillerne på begge sider. Træk den midterste del af brystkassen fuldt ud og fastsætte de vedhæftede hemostats at holde på plads.
- Fjern hjertesækken hjælp fine pincet.
- Mens løfte forsigtigt hjertet hjælp buet pincet, transektere vener og arterier knyttet til hjertet. Anbring straks hjerte i iskold perfusionsbuffer at bremse muskelkontraktion.
- Placer hjerte i en petriskål underen dissektion mikroskop (sted på et lille stykke af 215 um mesh for at hjælpe immobilisere under dissektion). Trim eventuelt overskydende ikke-hjertevæv under anvendelse fine iris saks. Vær forsigtig, når skære nær aorta.
- Transekt aorta nær brachioencephalic arterie, og passe på ikke at lade bobler eller væv vragrester ind i åbningen.
- Fyld petriskål indeholdende hjertet med iskold perfusionsbuffer sådan, at væskeniveauet stiger over åbningen af kanylen. Skede aorta på kanylen, således at spidsen er lige distalt for aortaklappen.
TIP: For at reducere risikoen for luftemboli, let trykke sprøjten på kanylen før kanylering for at fjerne potentielle luftbobler, der kan udvikles i slutningen af kanylen. Derudover holder spidsen af kanylen og aorta under overfladen af opløsningen for at undgå at indføre bobler mens kappe aorta. - Skub en præ-bundet 7-0 silkesutur nedskaftet af kanylering nål og position lige over spidsen af nålen. Stram knuden med fine pincet. Gentag dette trin med en anden sutur placeres lige over den første.
BEMÆRK: Sørg for, at spidsen af nålen er stadig over aortaklappen før og efter tilspænding. - Tryk langsomt sprøjten for at skubbe 0,5 ml perfusionsbuffer gennem koronar vaskulatur.
BEMÆRK: Hvis kanylering lykkedes, vil blod visualiseres forlader koronar kar og samle ud af de dorsale vener og arterier.
VIGTIGT: Tiden fra åbningen af brysthulen (især punktere membranen) til indledende perfusion bør minimeres for at reducere hypoxisk eksponering og maksimere overlevelse og sundhed af de isolerede cardiomyocytter. Ideelt set bør denne gang være mindre end 5 min.
- Perfusion
BEMÆRK: retrograd perfusionApparatet kan hensigtsmæssigt anvendes i et rent miljø på en standard laboratoriebord eller anbringes i en laminær strømning for at maksimere sterilitet. Men efter perfusion er færdig, skal udføres arbejde under laminar strømning for at minimere forurening.- Forsigtigt, men fast hubben fjernes kanylen fra sprøjten (med sterile handsker) ved langsomt at dreje frem og tilbage. Mens trække kanylering nålen af sprøjten, langsomt skubbe perfusionsbuffer ind i nålenavet for at forhindre luftbobler under perfusion.
- Fjern recirkulerende fangst røret fra under perfusion udløbsporten og erstatte med en fangst affald bæger. Fastgør nålenavet til luer adapter, der er fastgjort til perfusion udløbsport (figur 1, 2) på vandkappen, mens pumpen kører med den laveste indstilling (15 RPM, ~ 6 ml / min).
TIP: Ved tilslutning nålenavet til luer adapter, tillade dryppende perfusion buffer at connet- til væsken i nålehubben for at undgå at indføre bobler. - Perfundere hjertet uden recirkulation indtil 8 ml perfusion buffer er blevet aspireret af tilløbsslangen.
BEMÆRK: Volumenet af perfusion buffer aspireret af indløbsslangen på dette trin forudsætter et dødt volumen på 7 ml for perfusionssystemet, hvilket giver i alt 15 ml perfusionsbuffer pumpes gennem hjertet. - Fjern indløbsrøret fra perfusion buffer. Så luften kan aspireres ved indløbet for mindre end det døde volumen af systemet.
BEMÆRK: luftmængde indsugning i dette trin skal justeres for at forhindre luft i at komme ind i koronar kar (se trin 1.3.7). - Placer indløbsrøret ind i digestionspuffer (tabel 1), lige over bunden af glasset. Feed langsomt og tillade indløbsrøret at suge nok volumen for at undgå overfyldning af røret.
- Visualiser og følg luftbobler mellemperfusionen buffer og fordøjelsen buffer som den bevæger sig gennem varmekappe. Observere niveauet af perfusion buffer i midten af varmekappe begynder at falde, når luftboblen når de-boblende kammer. Når digestionspuffer når de-boblende kammer, vil væskeniveauet i varmen jakke forblive stabil.
VIGTIGT: Hvis niveauet af perfusion buffer falder for lavt, skal du lukke stophanen stikkontakt og åbne ventilen stophane. Tillad niveauet at stige til et komfortabelt niveau (3 - 5 inches over udløbsporten). Derefter stoppe perfusionen pumpen og lukke udluftningsåbningen stophane. Åbn udløbsporten stophane og genstart perfusion pumpe. - Se opløsningen kommer ud fra hjertet. Som det sidste af perfusionsbuffer forlader hjertet og digestionspuffer begynder cirkulerer gennem hjertet, vil farveændring fra klar til lysebrun observeres på grund af tilstedeværelsen af collagenase.
- Perfundere hjertet med fordøjelsen buffertil ca. 10 - 15 min. Hjertet vil begynde ludende som kollagen nedbrydes og mister mekanisk støtte.
- Mekanisk Dissociation og oprensning
- Tag hjertet fra kanylen med pincet og sted i en tør petriskål. Hurtigt trimme ekstra ventrikel væv ved hjælp af fine iris saks. Overfør hjertekamrene til en frisk petriskål indeholdende perfusionsbuffer at vaske. Flyt petriskål til en steril hætte og overføre hjertekamrene til et frisk, tør petriskål.
- Indsamle 7,5 ml digestionspuffer fra varmen jakke og tilsæt 2,8 pi 1 M CaCl2, bland ved inversion. Tilsæt 2 - 3 ml digestionspuffer med CaCl2 til ventriklerne i petriskålen.
BEMÆRK: Koncentrationen af Ca 2+ hæves fra 300 til 700 uM - Hurtigt tritureres ventrikelvæv med fin pincet, så de fleste stykker er mindre end 1 mm3. Tilsæt forbliveing Ca2 + suppleret digestionspuffer fra trin 1.3.2 til de dissocierede ventrikler i petriskålen og bland ved forsigtig omrøring.
- Placer petriskål i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Ryst petriskål hver 2 min, indtil tilstrækkelige cardiomyocytter (se note nedenfor) er blevet løsladt fra vævet.
BEMÆRK: Længden af inkubation kan være nødvendigt at justere for at finjustere graden af fordøjelse efter behovene af eksperimentet. Generelt længere inkuberingstider øge udbytte og renhed, men kan reducere antallet af cellebinding og overlevelse. 5 - 10 min er i almindelighed tilstrækkelig til at opnå et højt udbytte (~ 5 - 10 x 10 5 celler pr hjertet). - Overfør petriskålen tilbage til en laminær strømning. Ved hjælp af en overførsel pipette skåret i en vinkel på 45 °, pipettér forsigtigt vævet til yderligere dissociere.
- Brug sterile handsker til at folde den 215 um mesh i en kegle og holde over en 50 ml konisk. pipetteden dissocierede væv suspensionen på masken og tillade filtratet løbe ned i 50 ml konisk. Brug 7,5 ml forvarmet stop-buffer (tabel 1) for at vaske cardiomyocytter fra petriskålen gennem masken, der kombinerer med den første filtrat.
BEMÆRK: Ca2 + hæves til endelig 1,1 mM, og endelig 2,5% FBS i stoppuffer neutraliserer proteaseaktivitet. - Overfør cellesuspensionen til en 15 ml konisk og henstår ved tyngdekraft i 15 min.
- Fjern forsigtigt supernatanten med en overførsel pipette sådan, at kun 50 - 100 ul løsning fortsat over cellerne. Der tilsættes 10 ml forvarmet, i ligevægt kulturmedier (tabel 1) og bland ved forsigtig inversion. Lad cardiomyocytter at bilægge ved hjælp af tyngdekraften i 15 min.
TIP: For at øge renheden Gentag trin 1.4.8 som ønsket. - Fjern forsigtigt supernatanten med en overførsel pipette, således at kun har 50 - 100 gi of løsning fortsat over cellerne.
2. cardiomyocyte Kultur
- Precoaten vævskultur-behandlet petriskåle med laminin (10 ug / ml) og opbevares ved 37 ° C i 2 timer før udpladning celler. Lige før udpladning, aspirere laminin løsning fra vævskulturpladen. Der vaskes én gang med MEM eller PBS, derefter aspireres restvæske at fjerne ikke-adsorberede laminin.
- Tilsæt så forvarmet, i ligevægt kulturmedier at opnå den ønskede celletæthed, bland ved forsigtig inversion. Plade ønsket koncentration af celler i dyrkningsbeholderen (typisk 5 - 20 x 10 4 celler / cm2). For at vurdere udbyttet af cardiomyocyte isolation, tælle celler via hæmacytometer eller test-plade ved at kontrollere tætheden under et mikroskop. En voksen mus hjerte giver typisk 0,5 - 1,0 x 10 6 celler på dette stadium af protokollen.
TIP: Hvis du bruger 96-brønds plader, bruge en 1000 pi micropipette med en spids skåret i en vinkel på 45 ° for at minimere celleskader grund forskydningskraft. Placér pipettespidsen, således at den rører bunden af brønden under udstødning af cellesuspension for at minimere introduktion af bobler. - Flyt celledyrkningsskål straks til et 37 ° C inkubator med 5% CO2 og 95% fugtighed. Skift medier efter behov for at forhindre forsuring: hvert 1 - 5 dage afhængig af celledensitet. Minimere håndtering af dyrkningsskålen i de første 3 - 6 dage til at lette fastgørelsen til cellekulturen overflade.
BEMÆRK: For at minimere celle forstyrrelser under medieændringer når cellerne har ikke fuldt monteret, udføre en halv media forandring. aspireres langsomt mediet samtidig holde pipettespidsen lige under overfladen af mediet. Tilsæt derefter langsomt yderligere medier ved at holde pipettespidsen lige over overfladen af mediet mod væggen i dyrkningsskålen. - For at vurdere levedygtigheden af cardiomyocytter, checkmorfologi under brightfield mikroskopi. Frisk isolerede cardiomyocytter opretholde en nogenlunde stavformet morfologi med skarpe, adskilte kanter under lysfelt belysning (figur 2).
BEMÆRK: Bekræft levedygtighed ved farvning af cellerne med trypanblåt. - For at vurdere renheden af cardiomyocyte isolation, kontrollere cellemorfologien at identificere cardiomyocytter. Farv kernerne med Hoescht 33342 at identificere totale celler.
BEMÆRK: cardiomyocytter kan identificeres fra ikke-cardiomyocytter ved deres karakteristiske morfologi (stav-formet) og størrelse (ca. 100 - 200 um i længden). Alternativt vil frisk isolerede cardiomyocytter farvet positive for cardiomyocyte-specifikke markører, såsom alfa-actinin 26 (figur 3C, D) eller kardiel troponin T. 27
3. gentransduktion med adenovirus
- Forbered adenovirus cellelysat hjælp af etableret metoder. 21 transducere cardiomyocytter ved anvendelse cellelysat fra adenovirus producentceller 10. På dag 0 eller dag 1 efter isolering, tilsættes der forsigtigt cellelysatet til medierne indeholdende cardiomyocytter.
BEMÆRK: En høj titer adenoviruspræparat vil opnå stærkt udtryk i ca. 48 - 72 timer. Juster infektionsmultiplicitet der passer det eksperimentelle design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vildtype voksen ICR (CD1) mus hjerte giver typisk 500.000 til 1 million cardiomyocytter fra en vellykket isolation. Umiddelbart efter isolering af cellerne opretholder en hovedsagelig stangformet udseende (figur 3A) med intakte sarkomerer og kan anvendes til funktionelle undersøgelser med cardiomyocyte kontraktilitet. En høj procentdel af stavformede cardiomyocytter (over 90%) er en indikation af effektiv perfusion og fordøjelse. Levedygtige cardiomyocytter vil være store (~ 100 - 200 um i længde) og synes at have en skarp ydre membran under brightfield belysning (figur 3A). Immunfarvning for cardiomyocyte-specifik sarcomerisk markører, såsom alfa-actinin, vil resultere i et særskilt sarcomerisk båndmønster (figur 3C). I forbindelse med morfologisk analyse og nuklear farvning med DAPI, kan immunfarvning anvendes til at vurdere renheden af de isolerede cardiomyocytter. Fibroblaster vil være lille og rund lige efter isolering, men vil hurtigt knytte og spredes tyndt på cellekultur plast, hvilket gør det muligt letkøbt forskel fra cardiomyocytter.
En lav procentdel af stavformede cardiomyocytter er en indikation af en mislykket isolation. Dette kan skyldes en manglende hurtigt kanyle aorta efter hjertet ekstraheres fra dyret. Ineffektiv perfusion, grundet luftembolisme eller ukorrekt kanylering for eksempel, kan også påvirke morfologien og levedygtighed cardiomyocytter.
Efter flere dage i kultur, kardiomyocytterne antager en afrundet morfologi (figur 3B). Indenfor 1 - 2 uger levende cardiomyocytter vedhæfte til substratet og begynde spredning (figur 3D, E). Døde celler kan identificeres ved trypanblåt inklusion. En vellykket isolation og kultur vil give cirka 50% lever cardiomyocytter efter 1 uge. Forurening med ikke-cardiomyocytter, såsom fibroblaster vil resultere i en høj procentdel af disse celler senere i kultur som følge af deres proliferative potentiale. Dette kan undgås ved at øge antallet af tyngdekraften aflejringer og / eller gennem præ-plating at øge renheden. 28
Transduktion med adenovirus kan anvendes til at opnå en stærk genekspression påbegyndt inden for 48 - 72 timer (figur 3E). Adenovirusserotype 5 er effektive til at transducere voksne mus cardiomyocytter in vitro på grund af den høje ekspression af coxsackie-adenovirus receptor, men kan afhænge af typen af anvendte medier. 20
Figur 1. cardiomyocyte Isolation Udstyr og instrumentering. (A) Kirurgiske instrumenter bruges til at udtrække musenhjerte og kanyle aorta, fra top til bund: hemostats, væv pincet, buede pincet, Dumont # 5 fine pincet, små dissekere saks, fine iris saks, fine squeeze saks (B) Langendorff perfusion systemet bruges til at fordøje musen hjerte. . Perfusion buffere aspireret gennem indløbsrøret (1) ved perfusion pumpe (2) og gennem pumpen udløbsrøret (3) ind i indløbsporten på den opvarmede vandkappe (4). Perfusionen buffere er opvarmet af det opvarmede vand jakke, som de bevæger sig gennem spiral glasrør, den afgasning kammeret, og derefter ud af kanylering nål fastgjort til perfusion udløbsport den (5), som er forbundet med en stophane. Den konisk rør nedenfor fanger perfusionen buffere, som er ny gennemgå indløbsrøret. Porten tryk (6), overholdelse port (7) og udluft (8) forbliver lukket under perfusion for at opretholde en konstant strømningshastighed. Vandkappen opvarmes af et cirkulerende vandbad ind gennem the jakke indløb (9) og udløb (10) porte. En ring stativ bruges til at holde det opvarmede vand jakke i en lodret position (røde klemmer, sort base under den lilla konisk rør rack). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk oversigt over Perfusion System. Vigtige dele af Perfusion Apparatus er mærket som anført i manuskriptet. Strømmen retning perfusion buffer er angivet med pile. Bemærk placeringen af aorta kanyle, bør hvis spids være synligt gennem den gennemsigtige aorta, sikrer den er placeret oven over aortaklappen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Isoleret voksne mus cardiomyocytter. Cardiomyocytter blev isoleret og podet på laminin-overtrukne plader med 96 brønde som beskrevet i protokollen heri. (A) Frisk isolerede cardiomyocytter, podet ved ca. 8.000 celler / cm2. Bemærk, at frisk isolerede, levedygtige cardiomyocytter vises ca. stang formet med skarpe kanter (hvid pilespids). Imidlertid cardiomyocytter der synes at have en diffus ydre membran under brightfield er døde. I de første flere dages kultur, cardiomyocytter antager en afrundet form (B). (C) Immunfarvning for alfa-actinin (grøn) afslører karakteristisk sarcomerisk banding i en cardiomyocyte på d1 post-isolation. Nuklear farvning (DAPI) vist i blåt. Top shows zoomet billede af skitseret region i nederste billede. (D) (E) Lysfelt og epifluorescerende billeder viser cardiomyocytter på dag 11 post-isolation transduceret med adenovirus, der bærer en GFP reporter under kontrol af en CMV-promotor ( en gave fra Robert Gerard på UT Southwestern). Celler blev podet ved ca. 18.000 celler / cm2 og blev transduceret på dag 0 under anvendelse af en infektionsmultiplicitet på ca. 800 plak-dannende enheder (PFU) per celle. Scale barer:. 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.
| Cardiomyocyte isolation puffer (CIB) | |||
| Tilsættes 900 ml ultrarent vand til et rent bægerglas under magtiske omrøring. | |||
| Tilføj bufferkomponenterne i tabellen som angivet. | |||
| Komponent | MW | Slutkoncentration (mM) | 1X (g / L) |
| NaCl | 58,44 | 120 | 7,013 |
| KCI | 74,55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 HPO4.7H 2 O | 268,07 | 0,33 | 0,088 |
| MgSO4 .7H 2 O | 246,48 | 0.5 | 0,123 |
| Taurin | 125,1 | 30 | 3,753 |
| BDM | 101,1 | 10 | 1.011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5,958 |
| Glucose | 180,16 | 22 | 3,964 |
| Justér pH with 5 M NaOH. | |||
| Juster lydstyrken til 1 l med ultrarent vand. | |||
| Sterilt filter m / 0,22 uM vakuumfilter. | |||
| Tilsæt 0,5 pi 0,1 U / ml insulin per liter cardiomyocyte isolation puffer. | |||
| perfusionsbuffer | |||
| Komponent | Final | Volumen (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4 M) | 0,4 mM | 0.2 | |
| Total | - | 200 | |
| spaltningsbuffer | |||
| Komponent | Final | Beløb | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1 M) | 300uM | 4,5 pi | |
| Protease XIV | 0,2 mg / ml | 3 mg | |
| collagenase II | 2,4 mg / ml | 36 mg | |
| Total | - | 15 ml | |
| stopbuffer | |||
| Komponent | Final | Volumen (ml) | |
| perfusionsbuffer | 95% | 14.25 | |
| CaCl2 (1 M) | 1,5 mM | 22.5 | |
| FBS | 5% | 0,75 | |
| Total | - | 15 ml | |
| dyrkningsmedier | |||
| Komponent | Final% | Volumen (ml) | |
| MEM medier | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0.2 | |
| Total | 100% | 100 ml | |
| Tillad dyrkningsmedier at ækvilibrere ved 37 ° C, 5% carbondioxid. | |||
Tabel 1: Løsninger og buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den generelle sundhed af de isolerede cardiomyocytter afhænger af flere vigtige aspekter af denne protokol. Første, tiden fra hjertet ekstraktion til perfusion er kritisk og bør udføres i 5 min eller mindre. Fjernelse af calcium hjælper til at dissociere celle-celle-interaktioner, men kan have en negativ indvirkning celle sundhed langsigtet. 29-32 Således finder vi det tilstrækkeligt at fjerne calcium under de første par minutter af perfusion af EGTA (ethylenglycol tetraeddikesyre) chelatering, 22 men hurtigt gendanne calcium under fordøjelse og efterfølgende trin.
Anvendelsen af protease XIV forbedrer fordøjelsen effektivitet sammenlignet med collagenase alene. Dette reducerer uoverensstemmelse skyldes collagenase batch variation, 18,24 og forøger renheden af cardiomyocytter ved at lette adskillelse under gravitationssedimentation. Ikke desto mindre, over-fordøjelse vil forhindre effektiv binding til kulturen substratet, så en fin balance is kræves for at optimere celle udbytte og renhed og samtidig opretholde cellebinding og levedygtighed. Således kan koncentrationen af proteaser og længden af fordøjelse tilpasses til de eksperimentelle mål. Generelt vil en mindre grad af fordøjelse forbedre fastgørelsen og overlevelse af cardiomyocytter. Anvendelse af trypsin er blevet rapporteret i nogle cardiomyocyte isolation protokoller. 18. Tilsætning af trypsin til protease cocktail anvendt her (collagenase og protease XIV) reducerer langsigtede levedygtighed af de cardiomyocytter i kultur, måske på grund af over-fordøjelse eller spaltning af essentiel overflade og / eller ekstracellulære matrixproteiner.
Inddragelsen af butandion monoxim (BDM) under isolation hæmmer hjertemuskulaturen sammentrækning, og dermed reducerer negative konsekvenser på grund af terminal kontraktur, energiforbrug, og calcium paradoks. 29,33 Men i vores erfaring, fjernelse af BDM før kultur fremskynder dedifferentiation og tillader cellerne at tilpasse sig kulturen i to dimensioner.
Det er vigtigt at bemærke, at langsigtede tilpasninger til 2-D kultur kan påvirke funktionelle aspekter af cardiomyocytter, såsom kontraktilitet. Således bør udføres kontraktilitet og elektrofysiologi eksperimenter snart efter isolering, når indfødte sarcomerisk organisation er stadig intakt. Som en in vitro eksperiment, cellerne i kultur er blottet for visse ydre påvirkninger stede in vivo, såsom humoral eller immun signalering. På den anden side kan defineres co-kulturer skal gennemføres for at undersøge samspillet mellem cardiomyocytter og andre celletyper. 5,34 Yderligere in vitro kultur kan anvendes til at studere cardiomyocyte adfærd med definerede molekylære signaler i dyrkningsmediet. Således bør de overordnede mål for forsøget nøje overvejes og afvejes mod de begrænsninger og fordele ved denne kultur system.
35 Det skal bemærkes, at FBS og andre animalske sera indeholder ukendte komponenter, der kan påvirke cellulær fysiologi . 36,37 trods den godt værdsat tilstedeværelse af vækstfaktorer i FBS, behøver 38 de cardiomyocyte kulturer præsenteres her ikke formere sig. Snarere, cellecyklus blok synes at være en vedvarende egenskab af voksne mus cardiomyocytter ex vivo, vedligeholdes fra deres cellecyklus exit i den perinatale periode med udvikling. 12,39 Denne egenskab er af stor interesse for området for hjerte-regenerativ medicin, hvor reversion af voksne pattedyr cardiomyocytter til en proliferativ fænotype har været en stærkt forfulgt mål. 3,26,40-42 Især er det i øjeblikket uklart, hvilken grad dedifferentiation er nødvendig for cardiomyocytter at genindtræde i cellecyklus, men contribution af dedifferentiering regenerering i lavere hvirveldyr er godt understøttet 43,44,10,11 Desuden dedifferentiering stigende grad observeret i cardiomyocyte spredning og hjerte regenerering i mammale systemer, i det mindste på det funktionelle plan, herunder myofibrillar demontering 6,12,9 derfor bør staten differentiering af cardiomyocytter i kultur nøje overvejes og afpasses efter behovene i de forskningsmål. Som sådan dyrkningsbetingelserne kan potentielt modificeres yderligere til at reducere serum koncentrationen anvendes definerede serum erstatninger eller serumfrie medier. F.eks voksne rottecardiomyocytter udviser organiserede sarkomerer blev dyrket på lang sigt uden serum, men vækstfaktorer, såsom fibroblastvækstfaktor, epidermal vækstfaktor og triiodthyronin blev anvendt i definerede medier. 45 Det er tænkeligt at lignende medieformuleringer eller potentielt andre formuleringer, såsom dem, tilpasset fra differentiation protokoller, 46 kan anvendes til at opretholde godt differentierede voksne mus cardiomyocytter i kultur, der viser stærkt organiserede sarcomerisk strukturer. Alternative formuleringer kan også udvikles til at opnå andre fænotyper (såsom stærkt de-opdelte cardiomyocytter) 6 afhængigt af behovene for eksperimentet, men det videre arbejde vil være påkrævet.
Rollen af fibroblaster er blevet impliceret i kontrollen af neonatal mus cardiomyocyte cellecyklus 5 og voksne mus cardiomyocyte differentiering (gennem hypertrofisk IL6 signalering) i langtidsdyrkning. 19 Derfor bør gøres rede væksten af fibroblaster i kultur i i forsøgsmodeller fortolkninger . Væksten af fibroblaster i kultur kan styres ved tilsætning af vækst begrænser forbindelser som cytosinarabinosid 19 (AraC) eller gennem præ-plating trin. 28 vil imidlertid AraC inhiberer også væksten af cardiomyocytter, så alternativDer bør anvendes til at bekæmpe væksten af fibroblaster i undersøgelser vedrørende cardiomyocyte cellecyklus. I protokollen beskrevet her, kan indledende cardiomyocyte renhed forøges ved at gentage tyngdekraften sedimentering trin (se 1.4.8).
Fremgangsmåderne heri tilvejebringer et in vitro-system, der kan bruges til at studere karakteren af et voksent pattedyr cardiomyocyte cellecyklus blokade. I modsætning til primære celler fra andre organismer, såsom rotte eller marsvin, primære muse cardiomyocyter tilbyder et væld af kraftfulde og velkarakteriserede genetiske værktøjer, såsom Cre-baserede afstamning opsporing knock-i modeller, 47, som kan anvendes til nemt identificere celler, der stammer fra allerede eksisterende cardiomyocytter. 12,48 Derudover har den primære voksne murine cardiomyocytter været udsat for de indfødte udviklingsmæssige forhold, der resulterer i cellecyklus blokade, i modsætning til cellelinjer og differentierede ES eller IPSC celler 46, som, på trods af deres convenience og tilpasningsevne til store narkotika skærme, 2 kan have begrænset anvendelighed i forsøg sondering karakter af voksne cardiomyocyte cellecyklus exit.
Denne protokol skitserer en pålidelig metode til at isolere og kultur voksne mus cardiomyocytter. Flere metoder har tidligere demonstreret isolering af voksne mus cardiomyocytter til kortvarig undersøgelse, men til dato findes få rapporter af den langsigtede kultur af voksen-mus cardiomyocytter. 18,19 Evnen til at opretholde voksen mus cardiomyocytter i kultur bør sætte den in vitro-undersøgelse af cardiomyocyte biologi under eksperimentelle betingelser kræver langsigtet undersøgelse. For eksempel kan genekspression manipuleres under anvendelse adenovirusvektorer, som typisk kræver et par dage for at opnå fuld ekspression. Efterfølgende fænotypiske ændringer og analyser kan kræve endnu længere tid, afhængigt af eksperimentelle mål. De metoder, der præsenteres her, tillader kulturen i voksne mus cardiomyocytes i flere uger. Det skulle give et kraftfuldt system til undersøgelse af forsigtige spørgsmål i cardiomyocyte biologi, såsom dem, der vedrører cellecyklusregulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af UCSF Program for Gennembrud Biomedical Research (finansieret delvist af Sandler Foundation), NIH Pathway til Independence Award (R00HL114738) og Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ blev understøttet af en postdoc stipendium fra NIH (T32HL007731). Forfatterne er alene ansvarlig for indholdet af dette arbejde, som ikke nødvendigvis repræsenterer officielle synspunkter NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
