Abstract
배양 심근 세포는 생체 내 시스템 보완 기술을 이용하여 심근 생물학을 연구 할 수있다. 예를 들어, 체외 문화의 순도 및 접근성은 생화학 적 분석, 라이브 이미징 및 전기 생리학 미세하게 제어 할 수 있습니다. 심근의 장기 문화는 단기 문화에서 완료 할 수 없습니다 추가 실험 방법에 대한 액세스를 제공합니다. 예를 들어, 탈분화 세포주기에 재진입하고, 세포 분열의 생체 외 연구는 지금까지 대부분의 장기 배양에서 더욱 강력한 것으로 보인다 래트 심근 세포로 제한되었다. 그러나, 유전자 변형 마우스 라인과 잘 발달 된 질병 모델의 풍부한 툴 세트의 가용성은 심장 연구를위한 마우스 시스템이 매력. 여러 보고서가 성인 마우스 심근 분리의 존재하지만, 몇몇 연구들은 장기 문화를 보여줍니다. 여기에 제시된 상기 단계별 방법성인 마우스 심근 세포의 분리 및 장기 문화. 첫째, 역행을 Langendorff 관류 효율적으로 중력 침강 정제 다음 프로테아제와 마음을 소화하는 데 사용됩니다. 탈분화 다음 격리 기간 후에, 세포 배양에 서서히 부착 주 동안 배양 할 수있다. 아데노 바이러스 세포 용 해물을 효율적으로 단리 심근 세포를 형질 도입하기 위해 사용된다. 이러한 방법은 심근 생물학을 연구 할 수있는 간단하지만 강력한 모델 시스템을 제공한다.
Introduction
배양 심근 세포는 종종 시험 관내에서 잘 제어 된 환경에서 세포의 동작을 모니터링하기 위해 사용된다. 예를 들어, 형태학 전기, 생화학 적, 기계적 세포 특성은, 한정 배지에서 1, 2, 및 소분자 약물, 펩티드, 유전자 조절, 3 또는 전기적 자극에 응답하여 설계된 기판 상에 조사 될 수있다. (4) 휴대 콘텐츠 수 도 정의 공동 배양을 이용하여 제어 될 수있다. (5)이 체외 실험 큰 약물 또는 유전자 스크린에 유용하며 심근 생물학 관련 연구의 여러 유형에 대한 생체 내 방법으로 보완.
장기 문화 표현형 변화를 달성하기 위해 시간의 기간 연장이 필요한 실험 길 수 있습니다. 적시 예는 탈분화 세포주기에 재진입하고, 세포 분열이 전형적 위에 조사된다 SE 성인 포유류 심근 세포 증식이다주에 veral 일. 여기서 6,7, 연장 된 배양 시간은 유전자 조작, 7,8- 기능 탈분화 (예 sarcomeric 분해) 9 잠재적 전사 탈분화을 용이하게한다.도 6 이후의 세포주기 재진입 및 세포 분열이 더 긴 배양 기간이 필요 분열의 여러 라운드 실험의 목표입니다, 특히, 관찰. 심근 세포주기의 중요성은 기존의 심근 세포의 탈분화 및 확산은 제브라 피쉬와 신생아 생쥐의 심장 재생을위한 책임 나타났다 심장 재생, 몇 가지 최근 주요 과학 작품의 중심이다. 10 ~ 12 따라서, 가능성 포유 동물 성인 심근에 탈분화 세포주기 재입국 자극하는 것은 인간의 마음 재생 13-15에서 핵심적인 질문을 유지
I N 포유류 심장의 세포주기를 연구 시험 관내 실험근세포 주로 기인 마우스 모델에 비해 장기간 배양의 상대적인 용이성, 래트 소스를 사용했다. (16) 그러나, 뮤린 시스템이 모두 시험 관내 및 생체 내에서 유용하다 잘 특성화 트랜스 제닉 도구 및 질병 모델의 풍부한 자원을 알려 프로토콜. 예를 들어, Cre 호텔 기반 혈통 추적은 생체 내에서 신생아 마우스 마음에 심근 재생의 근원으로 기존의 심근의 식별을 사용할 수있다. 계통 추적 신생아 마우스 심근의 12 시험관 연구를 간질과의 상호 작용의 시험을 활성화 한 섬유 아세포와 공동 배양을 통해 세포. 5 단, 그 문제로 인해, 17 몇보고 성인 마우스 심근 세포의 분리 및 장기간 배양으로 존재한다. 18,19
단독 단기 배양 가능한 성인 쥐 심근 세포의 분리는 어려운 작업으로 알려져있다. 이 protoc올 단기간뿐만 아니라 장기간의 연구 모두에 사용될 수 성체 마우스의 생존 심근을 달성하는 방법을 단계별로 설명합니다. 이 프로토콜을 이용하여 분리 심근 효율적 아데노 바이러스 벡터 (20, 21)에 대한 주 배양으로 형질 도입 될 수있다. 이러한 방법은 체외에서 심근 생물학을 연구 할 수있는 강력한 시스템을 제공한다.
여기에 설명 된 방법은 랑겐 돌프 역 행성 관류의 변화를 사용하여 이전 작품에서 여러 요소를 기준으로합니다. 18, 22 여러 프로토콜이 단기 문화 연구, 23-25 장점의 대한 성인 마우스 심근 세포의 분리에 게시되었지만 이 프로토콜은 문화 능력 고립 된 심근 장기입니다. 이것은 이소성 유전자 발현과 관련된 셀룰러 프로그래밍 전략 같이 장시간을 필요로하는 세포 과정의 연구에 유용 할 것이다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 절차는 캘리포니아 대학에서 기관 동물 사용 및 관리위원회, 샌프란 시스코에 의해 승인되었습니다.
참고 : 간단히 마우스의 가슴에서 심장을 추출 후, 관상 동맥 역 행성 관류 효율적으로 콜라게나 제와 단백질 분해 효소 XIV와 세포 외 기질을 소화하는 데 사용됩니다. 심실은 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 여과, 분리된다. 중력 침강은 높은 밀도 섬유 아 세포와 내피 세포 등의 기질 세포에서 분리 된 심근 세포를 분리하기 위해 수행된다. 정제 된 심근 라미닌 - 코팅 폴리스티렌 주 동안 배양 및 아데노 바이러스 유전자 벡터로 형질 도입 될 수있다.
1. 심근 격리
- 버퍼, 외과 역 관류 장치를 준비
- 탭에 따라 버퍼와 미디어를 준비제작 : 1.
- 물 목욕을 순환을 켜고 가열 된 물 재킷의 출력은 37 ℃의 온도에 도달하도록 입력 온도를 설정합니다.
- 70 % 에탄올로 세척하여 청소 관류 시스템. 그런 다음 멸균 여러 볼륨으로 세척하여 시스템에서 에탄올의 모든 흔적을 제거합니다.
- 관류 버퍼 (표 1)과 재관류 시스템을로드합니다. 먼저 배수 물이 시스템에서, 다음 관류 버퍼의 2 권으로 세척하십시오. 그런 다음 열 재킷의 내부 열 관류 버퍼 가득되도록 관류 버퍼 죽은 공간을 채우기하지만 거품 제거 챔버는 비어 있습니다.
TIP : 기포가 거품 제거 챔버 아래 라인에 존재하지 않는 확인하십시오. , 완강히 저항하는 거품을 제거 모든 마개 참여와 압력이 몇 초 동안 라인 내부에 구축 할 수 있도록합니다. 이어서 출구에서 제트 고압 관류 완충액 있도록 하부 콕 해제; 빠른 흐름과 turbulenc전자는 관류 출구 근처에 잡힌 거품을 제거하는 데 도움이됩니다. - 바늘과 주사기를 준비 대동맥 삽관 사용한다. 관류 버퍼 가득 한 ML의 주사기에 18 G 무딘 바늘을 연결합니다. 공기 방울을 제거하고 랩 테이프로 해부 miscroscope 조명의 한 팔에 주사기 어셈블리를 고정합니다.
TIP : 경 사진 바늘에서 무딘 엔드 바늘을 작성하려면, 전선 절단기와 바늘 샤프트를 가로로 쪼개다. 끝이 평평 때까지 샌딩 돌 끝을 연마.
주 : 삽관시 바늘에서 대동맥의 미끄러짐을 감소 면도날을 사용하여 캐 뉼러 바늘의 축을 거칠게. 여러 홈이 니들 샤프트의 끝 1cm 이내 때까지 회전하는 동안 상기 허브와 상부 샤프트 바늘을 고정하고 앞뒤로 수직 바늘 축의 장축 면도기를 보았다. 날이 무딘 될 때 새로운 면도기로 전환합니다. - 깨끗한 배치해부 현미경 아래 페트리 접시 삽관시 중심부를 포함합니다. 캐뉼라의 선단이 뷰잉 영역의 가장자리 근처 이도록 일루미네이터 아암 놓고 있지만 절개를 방해하지. 정맥의 끝이 배양 접시의 가장자리 아래에 있는지 확인하십시오.
참고 : - 페트리 접시에 215 마이크론 메쉬의 정사각형 작은 (7cm 2 ~ 5)를 놓고 해부하는 동안 마음을 고정 도움이됩니다. 마음이 메시에 배치 될 때, 슬라이딩 및 기계 조작시 중심부의 회전 줄이기 위해 마찰을 만듭니다. - 대동맥의 고정에 사용되는 캐 뉼러 바늘의 중심 주위 이른바 더블 돌린 매듭이 봉합 넥타이.
- 심장 추출 및 캐 뉼러
- 복강 내 주사를 통해 헤파린 (5 IU / g 체중)을 투여. 헤파린은 심장으로 순환 할 수 있도록 20 분을 기다립니다.
- 복강 내 분사하여 마우스를 마취20 % 에틸 카르 바 메이트 (2 mg의 에틸 카바 메이트 / g 체중)의 이온. (- 5 분 정도 3) 마우스가 깊은 마취가 될 때까지 면밀히 관찰한다.
참고 : 깊은 마취가 발가락 핀치와 각막 반사 모두의 부족에 의해 확인된다. 마우스 (8)에 의해 깊은 마취에 도달하지 않은 경우 - 10 분 후, 에틸 카바 메이트의 추가 용량을 투여. 마취에 대한 개별 응답은 쥐 사이 다를 수 있지만, 실패 후에도 반복 투여 깊은 마취를 배제 할 수있다 저하 에틸 카르 바 메이트를 나타낼 수 있습니다 첫 번째 투여시 깊은 마취를 입력합니다. 저하를 방지하기 위해 각 사용하기 전에 에틸 카바 메이트의 새로운 솔루션을 준비합니다. - 외과 테이프 각 사지를 고정하여 수술 플랫폼에 마우스를 고정. 70 % 에탄올의 자유 양 절개 영역을 소독. 팻은 실험실 와이프와 건조.
- 바로 흉골 아래 조직 집게로 피부를 들어 올립니다. 죽 절단, 작은 가위로 횡 절개를합니다피부와 복부를 우.
- 부드럽게 흉골을 통해 흉곽을 들어 올려 지혈제를 사용합니다. 작은 절개 가위를 사용하여 겨드랑이 향해 V 자형으로 절개를 연장한다. 첫 번째 늑골을 잘라 양쪽의 다이아 프램에 구멍.
- 지혈제와 흉곽을 들어 올려 완전히 다이어프램을 가로로 쪼개다 작은 홍채 가위를 계속 사용합니다. 심장을 찔린 않도록주의하십시오.
- rostrally를 신속하고 지혈을 사용 흉곽 후퇴하지만 신중 양쪽 겨드랑이쪽으로 흉곽으로 절단하여 V 자 형상의 절개를 연장한다. 완전히 흉곽의 중앙 부분을 철회하고 대신에 개최 첨부 지혈을 누워.
- 미세 집게를 사용하여 심낭을 제거합니다.
- 부드럽게 곡선 집게를 사용하여 마음을 들어 올리는 동안, 심장에 부착 된 정맥과 동맥을 가로로 쪼개다. 즉시 근육 수축을 천천히 얼음처럼 차가운 관류 버퍼에 마음을 놓습니다.
- 배양 접시 아래에 마음을 놓고해부 현미경 (215 μm의 메쉬의 작은 조각에 장소는 해부 동안 고정 도움). 미세 홍채 가위를 사용하여 과량의 비 심장 조직을 낸다. 대동맥 근처 절단시주의하십시오.
- brachioencephalic 동맥 근처의 대동맥을 가로로 쪼개다, 거품 또는 조직 파편이 개통을 입력 할 수 않도록주의하십시오.
- 액체 레벨이 캐 뉼러의 개방 이상으로 상승하도록 차가운 얼음 관류 버퍼 마음을 포함하는 배양 접시를 입력합니다. 선단이 대동맥판 단지 말단되도록 캐 뉼러 상 대동맥 시스.
팁 : 약간 뉼러 끝에 개발 수있는 잠재적 인 기포를 제거하기 위해 이전에 정맥 삽관의 주사기 우울 공기 색전증의 위험을 감소시킨다. 또한 대동맥 외장 중에 기포를 도입 않도록 용액의 표면 아래에 캐뉼라의 선단 및 대동맥을 유지한다. - 아래 미리 묶어 7-0 실크 봉합사를 밀어단, 바늘 끝 위 삽관 바늘 위치의 축. 미세 집게로 매듭을 조입니다. 단지 첫 위에 배치 번째 봉합이 단계를 반복합니다.
참고 : 바늘의 끝이 전에 체결 한 후 대동맥 판막 이상 아직 확인합니다. - 천천히 관상 동맥 혈관을 통해 관류 버퍼의 0.5 ml의 배출 주사기를 우울.
참고 : 삽관에 성공하면 혈액이 관상 동맥 혈관을 떠나 지느러미 정맥과 동맥에서 풀링 가시화 될 것이다.
중요 사항 : (특히, 격막 천공) 관류하는 것은 최초 저산소 노출을 감소시키고 절연 심근의 생존 상태를 최대화하도록 최소화되어야 흉강의 개구로부터 시간. 이상적으로,이 시간은 5 분 미만이어야합니다.
- 관류
참고 : 역 행성 관류장치는 편리 표준 실험실 벤치에 깨끗한 환경에서 동작이나 불임을 최대화하기 위해 층류 후드에 배치 될 수있다. 관류가 완료된 후에 그러나 작업은 오염을 최소화하기 위해 층류 하에서 수행되어야한다.- 부드럽지만 확실히 천천히 앞뒤로 비틀 (멸균 장갑을 사용) 주사기의 캐 뉼러 허브를 제거합니다. 주사기 오프 삽관 바늘을 당기는 동안 천천히 재관류 동안 공기 방울을 방지하기 위해 바늘 허브 관류 완충액 토출.
- 관류 출구 아래에서 재순환 캐치 튜브를 제거하고 폐기물 캐치 비커로 교체합니다. 관류 배출구에 고정 루어 어댑터에 바늘 허브를 연결 (도 1, 2)가 워터 자켓에, 펌프가 최저 설정으로 실행되는 동안 (15 RPM을 ~ 6 ml / 분).
팁 : 루어 어댑터 바늘 허브를 연결하는 경우, 적하 관류 완충액 사기 허용거품을 도입하지 않도록하기 위해서는 바늘 허브의 액체로의 연결을. - 관류 버퍼의 8 ml의 입구 호스로 흡입 될 때까지 재순환하지 않고 마음을 관류.
주 :이 단계에서 급수 호스로 흡입 관류 버퍼의 부피는 중심부를 통해 펌핑 관류 완충액 15㎖의 총 제공 관류 시스템 7 ㎖가 데드 볼륨을 가정한다. - 재관류 버퍼에서 도입 관을 제거한다. 허용 공기 시스템의 불감 부피보다 적은 입구로 흡입된다.
주 :이 단계에서 흡입 공기량이 관상 혈관한다 (단계 1.3.7 참조)에 유입 된 공기를 방지하도록 조정되어야한다. - 단, 튜브의 바닥 위에 분해 완충액 (표 1)에 유입 튜브를 놓는다. 천천히 공급 및 주입 관이 관 넘침 방지하기에 충분한 양을 흡인 할 수있다.
- 시각화 사이의 기포를 수행재관류 버퍼는 열 재킷을 통해 이동함에 따라 소화 버퍼. 가열 재킷의 중심에 관류 버퍼의 레벨을 관찰하면 기포가 디 버블 링 챔버에 도달하면 삭제하기 시작한다. 소화 버퍼 디 버블 링 챔버에 도달하면 열 재킷 내의 액체의 레벨은 안정을 유지한다.
중요 : 관류 버퍼의 레벨이 너무 낮게 떨어지면, 출구 마개를 닫고 벤트 꼭지를 엽니 다. (- 출구 위 5인치 3) 레벨이 편안한 수준으로 상승 할 수 있습니다. 그 다음, 관류 펌프가 정지하고 배기 콕을 닫는다. 출구 포트 꼭지를 열고 관류 펌프를 다시 시작합니다. - 마음에서 나오는 솔루션을보십시오. 관류 버퍼의 마지막 마음을 떠나 소화 버퍼가 마음을 통해 순환 시작으로, 밝은 갈색 명확에서 색상 변경으로 인해 콜라게나 제의 존재로 관찰됩니다.
- 소화 버퍼 마음을 관류15 분 - 약 10. 콜라겐이 분해 될 때 마음이 삐딱를 시작하고 기계적인 지원을 잃는다.
- 기계 해리 및 정제
- 건조 페트리 접시에 집게와 장소 정맥에서 심장을 제거합니다. 신속하게 잘 홍채 가위를 사용하여 여분의 심실 조직을 잘라. 씻어 새로운 배양 접시 포함 관류 버퍼에 심실을 전송합니다. 멸균 후드에 페트리 접시를 이동하고 신선한, 건조 페트리 접시에 심실을 전송합니다.
- 반전에 의해 혼합, 열 재킷에서 소화 버퍼의 7.5 ml의 수집 및 1 M 염화칼슘 (2)의 2.8 μl를 추가합니다. 페트리 접시에 심실에 염화칼슘 2 소화 버퍼의 3 ㎖ - 2를 추가합니다.
참고 : 칼슘의 농도는 300 ~ 700 μM에서 발생 - 대부분의 조각을 1 mm보다 작 3되도록 빠르게 미세 집게 심실 조직 씹다. (가) 남아 추가페트리 접시에 해리 심실 단계 1.3.2에서 칼슘 보충 소화 버퍼를 보내고 부드러운 교반 혼합한다.
- 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. 충분한 심근가 (아래 참고 참조) 조직에서 분리 될 때까지 배양 접시마다 2 분 선동.
주 : 배양 길이가 필요할 수 실험의 필요에 따라 미세 조정 분해의 정도를 조정한다. 일반적으로, 더 긴 배양 시간은 수율과 순도를 증가하지만, 세포 부착 및 생존율을 감소시킬 수있다. 5-10 분 높은 수율을 달성하기 위해 일반적으로 충분하다 (~ 5-10 × 105 세포 당 심장). - 층류 후드로 다시 배양 접시를 전송합니다. 또한 해리 조직을 피펫 부드럽게, 45 ° 각도로 잘라 전송 피펫을 사용.
- 콘에 215 μm의 메쉬 배 및 50 ml의 원뿔을 통해 개최 멸균 장갑을 사용합니다. 피펫해리 조직 메쉬 상에 정지하고 여과 액이 50 ml의 원뿔로 배출 할 수 있습니다. 첫 번째 여과 액과 결합, 메쉬를 통해 배양 접시에서 심근 세포를 씻어 미리 예열 정지 버퍼 (표 1) 7.5 ml를 사용합니다.
주 : 칼슘 최종 1.1 mm의 상승과 정지 버퍼의 최종 2.5 %의 FBS가 프로테아제 활성을 중화시킨다. - 15 ML 원뿔에 세포 현탁액을 전송하고 15 분 동안 중력에 의해 정착 할 수 있습니다.
- 용액 100 ㎕의 세포 이상으로 유지 - 조심스럽게 50이되도록 전송 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 미리 예열, 평형 문화 미디어 (표 1) 10 ㎖를 추가하고 부드러운 반전으로 섞는다. 심근가 15 분 동안 중력에 의해 해결하도록 허용합니다.
팁 : 원하는 단계 1.4.8를 반복 순도를 증가합니다. - 100 μL 오 - 조심스럽게 전송 피펫 등 만 50 뜨는을 제거F 용액을 세포 위에 남아있다.
2. 심근 문화
- 프리 코트 조직 세포 전에 도금을 2 시간 동안 37 ° C에서 라미닌 (10 μg의 / mL) 및 저장소와 배양 접시를 배양 처리. 직전 도금 조직 배양 접시에서 라미닌 용액을 흡인한다. MEM 또는 PBS로 한번 세척 한 후 비 흡착 라미닌을 제거하는 잔류 액체를 대기음.
- 원하는 세포 밀도를 달성 부드러운 반전에 의해 혼합 충분한 사전 예열, 평형 문화 매체를 추가합니다. (- 20 × 104 세포 / ㎠ 통상 5) 플레이트는 배양 용기 내로 세포의 농도를 원하는. 심근 분리의 수율을 평가하기 위해, 현미경으로 검사하여 농도 hemacytometer 또는 테스트 플레이트를 통해 세포를 계산. 프로토콜의이 단계에서 1.0 × 10 6 세포 - 성인 마우스의 심장은 일반적으로 0.5를 제공합니다.
TIP : 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 1,000 μL의 micropip를 사용45 ° 각도로 잘라 끝두기가 힘을 전단에 의한 세포 손상을 최소화합니다. 이 거품의 도입을 최소화하기 위하여 세포 현탁액의 토출 동안 웰의 바닥을 터치되도록 피펫 팁을 놓는다. - 5 % CO 2와 95 %의 습도가 37 ° C를 인큐베이터에 신속하게 세포 배양 접시를 이동합니다. 산성화를 방지하기 위해 필요에 따라 미디어를 변경 : 모든 1~5일는 세포 밀도에 따라 달라집니다. 세포 배양 표면에 부착을 촉진 6 일 - 제 3 동안 배양 접시의 처리를 최소화한다.
참고 : 세포가 완전히 부착되지 않은 경우, 미디어 변경하는 동안 세포 교란을 최소화 반 미디어 변경을 수행합니다. 단지 미디어의 표면 아래에 피펫 팁을 유지하면서 천천히 미디어를 대기음. 그런 다음 천천히 그냥 배양 접시의 벽에 미디어의 표면 위의 피펫 팁을 유지하여 추가 미디어를 추가합니다. - 심근의 생존 능력을 평가하기 위해, 확인브라이트 현미경 아래에있는 형태. 갓 격리 된 심근는 시야 조명에서 선명하고 뚜렷한 가장자리와 대략 막대 모양의 형태를 (그림 2)을 유지한다.
참고 : 트리 판 블루로 세포를 염색하여 생존을 확인합니다. - 심근 분리의 순도를 평가하기 위하여, 심근 세포를 식별하는 세포 형태를 확인한다. 총 세포를 식별 할 Hoescht 33342로 핵을 얼룩.
참고 : 심근가 자신의 특성 형태 (막대 모양) 및 크기에 따라 비 심근에서 확인할 수 있습니다 (약 100 - 길이가 200 μm의). 또한, 갓 고립 된 심근 세포는 알파 - 티닌 (26) (그림 3C, D) 또는 심장 트로포 닌 T. (27) 심근 특이 적 마커에 대한 긍정적 인 얼룩됩니다
아데노 바이러스 3. 유전자 형질 도입
- 설립 m를 사용하여 아데노 바이러스 세포 용 해물을 준비ethods.도 21은 아데노 바이러스 생산 세포를 10 세포 용 해물을 사용하여 심근 세포를 형질 도입. 분리 후 일 0 일 1 일, 신중 심근 세포를 포함하는 미디어에 세포 용 해물을 추가한다.
주 : 높은 역가의 아데노 바이러스 제제는 약 48 강한 표현을 달성 - 72 시간. 실험 설계에 맞게 감염의 다중성을 조정합니다.
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Representative Results
야생 형 성인 ICR (CD1) 마우스 마음은 일반적으로 성공적인 분리에서 50 만 1 심근 세포를 얻을 수 있습니다. 즉시 분리 후, 세포 손상 근섬유 분절와 거의 막대 형상의 외관 (도 3a)를 유지하고, 심근 수축력을 포함하는 기능성 연구에 사용될 수있다. 막대 모양의 심근 (90 % 이상)의 높은 비율은 효과적인 관류과 소화의 표시입니다. 실행 가능한 심근 큰 것입니다 (~ 100-200 길이 μm의)와 브라이트 조명 (그림 3A)에서 날카로운 외막을 가지고있는 것 같습니다. 알파 - 티닌과 같은 심근 별 sarcomeric 마커에 대한 면역 염색, 별개 sarcomeric 줄무늬 패턴 (그림 3C)가 발생합니다. DAPI로 형태소 분석 및 핵 염색과 함께, 면역 염색은 절연 심근의 순도를 평가하기 위해 사용될 수있다. Fibroblasts은 차단 후 작은 둥근 수 있지만 빠르게 따라서 심근에서 손쉬운 구별을 가능하게 부착 및 세포 배양 플라스틱에 얇은 확산됩니다.
막대 모양 심근의 낮은 비율은 실패 분리의 표시입니다. 이 심장은 동물에서 추출 된 후 신속하게 대동맥을 cannulate하기 위해 실패가 발생할 수 있습니다. 비효율적 인 관류는 공기 색전증 또는 예를 들어 잘못된 삽관으로 인해, 또한 심근 세포의 형태 및 생존 능력에 영향을 미칠 수 있습니다.
배양 며칠 후 심근 둥근 형태 (도 3B)을 가정한다. 1 내에서 - 이주, 라이브 심근는 기판에 부착하고 (그림 3D, E)을 확산 시작합니다. 죽은 세포는 트리 판 블루를 포함하여 식별 될 수있다. 성공적인 고립과 문화가 살아있는 심장 약 50 %를 얻을 것입니다일주 후 근육 세포. 이러한 인해 증식 전위 이상 배양이 세포의 비율이 높은 섬유 아세포가 발생할 것 같은 비 심근 세포에 의한 오염. 이는 순도를 증가시키기 위해 및 / 또는 예비 도금을 통해 중력 sedimentations의 수를 증가시킴으로써 회피 할 수있다. (28)
72 시간 (도 3E) - 아데노 바이러스 형질 도입 (48) 내에 강한 유전자 발현을 달성 할 수있다. 아데노 바이러스 혈청 형 5 인해 coxackie 아데노 바이러스 수용체의 높은 발현을 시험 관내 성인 쥐 심근 세포를 형질 도입에 효율적이지만, 사용되는 용지의 유형에 의존 할 수있다. (20)
그림 1. 심근 격리 장비 및 계측. (A) 수술 장비는 마우스를 추출하는 데 사용마음과 위에서 아래로, 대동맥을 cannulate : 지혈, 조직 겸자, 곡선 집게, 뒤몽 # 5 미세 집게, 작은 해부 가위, 미세 홍채 가위, 미세 스퀴즈 가위 (B) 마우스 마음을 소화하는 데 사용되는 랑겐 돌프 관류 시스템. . 관류 버퍼 관류 펌프에 의해 유입 관 (1)을 통해 흡입된다 (2) 및 가열 된 워터 재킷의 입구 포트에 펌프 배출 튜브 (3) 내지 (4). 관류 버퍼들은 나선형 유리관의 거품 제거 챔버를 통해 이동으로 온수 재킷으로 가온 한 다음, 마개가 접속되는 관류 출구 포트 (5)에 부착 된 캐 뉼러 바늘의 아웃된다. 원추형 튜브 아래 입구 튜브를 통해 재순환되는 관류 버퍼를 잡는다. 압력 포트 (6), 컴플라이언스 포트 (7) 및 (8)에 일정 유량을 유지하기 위해 관류 동안 닫혀 벤트. 워터 재킷을 순환하는 물 배스 번째 통해 입력하여 가열전자 자켓 입구 (9)와 출구 (10) 포트. 링 스탠드는 수직 위치에서 가열 된 물 자켓 (빨간색 클램프, 보라색 원뿔 튜브 랙 아래에 검은 색베이스)를 보유하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 관류 시스템의 도식 개요. 원고에서 언급 관류 장치의 중요한 부분이 표시되어. 관류 완충액의 흐름 방향은 화살표로 표시된다. 대동맥 정맥의 위치를주의의 끝이 대동맥 판막 위에 배치됩니다 보장 반투명 대동맥을 통해 볼 수 있어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 성인 마우스 심근를입니다. 심근 의정서 여기에 설명 된대로 라미닌 - 코팅 된 96 웰 플레이트에 절연 및 시드 하였다. / cm 2에서 약 8,000 셀 시드 (A) 갓 격리 심근. 갓 격리, 가능한 심근 약 나타 날카로운 모서리 (흰색 화살표)로 막대 모양의합니다. 그러나 시야에서 확산 외막을 가지고있는 것 같습니다 심근는 죽은입니다. 문화의 처음 몇 일 동안, 심근는 둥근 모양 (B). (C) 알파 - 티닌 (녹색)에 대한 면역 염색 D1 후 격리에서 심근의 특성 sarcomeric 밴딩을 계시를 가정합니다. 파란색으로 표시 핵 얼룩 (DAPI). 최고의 쇼는 아래 이미지에 설명 된 지역의 이미지를 확대. (D) (E) 브라이트와 epifluorescent 이미지가 아데노 바이러스는 CMV 프로모터의 제어하에 GFP 기자를 들고와 형질 하루 11 후 격리에서 심근을 (표시 UT 사우스 웨스턴 로버트 제라드의 선물). 세포는 약 18,000 세포 / cm 2 시딩하고, 세포 당 약 800 플라크 형성 단위 (PFU)의 감염 다중도를 사용하여 0 일째에 형질 도입 하였다. 스케일 바 :. 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 심근 분리 완충액 (CIB) | |||
| 잡지에서 깨끗한 비커에 초순수의 900 ML을 추가네틱 교반. | |||
| 나타낸 바와 같이, 테이블의 버퍼 성분을 추가한다. | |||
| 구성 요소 | MW | 최종 용액에 농축 (㎜) | 1X (g / L) |
| 염화나트륨 | 58.44 | (120) | 7.013 |
| KCl을 | 74.55 | 5.4 | 0.403 |
| 나 2 HPO4.7H 2 O | 268.07 | 0.33 | 0.088 |
| 황산 4 · 7H 2 O | 246.48 | 0.5 | 0.123 |
| 타우린 | 125.1 | (30) | 3.753 |
| BDM | 101.1 | (10) | 1.011 |
| HEPES | 238.3 | (25) | 5.958 |
| 포도당 | 180.16 | (22) | 3.964 |
| 산도 재치를 조정시간 5 M의 NaOH. | |||
| 초순수 1 L에 볼륨을 조정합니다. | |||
| 무균 필터 w / 0.22 μM 진공 필터. | |||
| 심근 분리 버퍼의 리터 당 0.1 U / ㎖ 인슐린의 0.5 μl를 추가합니다. | |||
| 관류 버퍼 | |||
| 구성 요소 | 결정적인 | 양 (㎖) | |
| CIB | - | (200) | |
| EGTA (0.4M) | 0.4 밀리미터 | 0.2 | |
| 합계 | - | (200) | |
| 소화 버퍼 | |||
| 구성 요소 | 결정적인 | 양 | |
| CIB | - | 15 ml의 | |
| CaCl2를 (1M) | (300)μM | 4.5 μL | |
| 단백질 분해 효소 XIV | 0.2 ㎎ / ㎖ | 3 mg의 | |
| 콜라게나 제 II | 2.4 ㎎ / ㎖ | 36 mg의 | |
| 합계 | - | 15 ml의 | |
| 정지 버퍼 | |||
| 구성 요소 | 결정적인 | 양 (㎖) | |
| 관류 버퍼 | 95 % | 14.25 | |
| CaCl2를 (1M) | 1.5 밀리미터 | 22.5 | |
| FBS | 5 % | 0.75 | |
| 합계 | - | 15 ml의 | |
| 문화 미디어 | |||
| 구성 요소 | 마지막 % | 양 (㎖) | |
| MEM 미디어 | 90 % | (90) | |
| FBS | 10 % | (10) | |
| Primocin | 0.2 % | 0.2 | |
| 합계 | 100 % | 100 ㎖ | |
| 배양 배지는 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 평형을 허용한다. | |||
표 1 : 솔루션 및 버퍼.
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Discussion
격리 된 심근의 전반적인 건강이 프로토콜의 몇 가지 중요한 측면에 따라 달라집니다. 먼저, 심장 재관류로 추출로부터 시간이 중요하며, 5 분 이하로 수행되어야한다. 칼슘의 제거가 세포 - 세포 상호 작용을 해리하는 데 도움이되지만 부정적 셀 상태 장기에 영향을 미칠 수있다. 29-32을 따라서, 우리는 충분한 EGTA 의해 관류의 최초 몇 분 동안 칼슘을 제거 (에틸렌 글리콜 테트라 산) 킬레이트를 찾을 22 그러나 빨리 소화 및 후속 단계에서 칼슘을 복원 할 수 있습니다.
단백질 분해 효소 XIV의 사용은 크게 혼자 콜라게나 제에 비해 소화 효율을 향상시킨다. 이 때문에 콜라게나 배치 가변성 18,24 불일치를 감소 중력 침강 동안 분리를 용이하게함으로써 심근 세포의 순도를 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 과도하게 소화 배양 기판에 효율적으로 부착, 그래서 좋은 밸런스 난을 방지 할 수 있습니다세포 부착과 생존을 유지하면서 세포 수율과 순도를 최적화하는 데 필요한 s의. 따라서, 프로테아제 소화 길이의 농도는 실험 목적에 맞게 변경 될 수있다. 일반적으로, 소화의 적은 정도는 심근 세포의 부착과 생존을 향상시킬 것입니다. 트립신의 사용은 일부 심근 분리 프로토콜에보고되어있다. (18) 그러나, 여기서 사용되는 프로테아제 칵테일 트립신 첨가 (콜라게나 제와 프로테아제 XIV)는 아마도 인해 과도한 분해 또는 절단에 문화의 심근 세포의 장기간 생존 능력을 감소 필수적인 표면 및 / 또는 외 기질 단백질.
격리하는 동안 부탄 monoxime (BDM)의 포함은 심장 근육 수축을 억제하고, 따라서 인해 터미널 구축, 에너지 소비 및 칼슘 패러독스에 부정적인 영향을 줄일 수 있습니다. 29,33을하지만, 우리의 경험에서, BDM의 제거는 이전에 문화 dedifferentiatio을 신속하게n 및이 세포가 두 가지 차원에서 문화에 적응 할 수 있습니다.
그러한 수축와 심근 세포의 기능적 측면에 영향을 줄 수있는, 2-D 배양에 그 장기 적응하는 것이 중요하다. 따라서, 수축 및 전기 생리학 실험은 곧 기본 sarcomeric 조직이 아직 그대로 분리 후에 수행해야합니다. 또한, 모든 시험 관내 실험에서와 같이, 문화의 세포는 체액 또는 면역 신호 등 생체에 존재하는 어떤 외부 영향의 결여이다. 한편, 정의 된 공동 배양 심근 세포 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 연구하기 위해 구현 될 수있다. 5,34 추가적으로, 시험 관내 배양에서 배지에 정의 분자 신호에 심근 동작을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 이에 따라, 실험의 전반적인 목적은 신중하게 고려 이러한 배양 시스템의 한계 및 장점 비교 검토한다.
35 FBS 및 다른 동물 유래의 혈청 세포 생리학에 영향을 미칠 수있는 미지의 성분을 포함하고 있음을주의해야한다 . (36, 37) FBS에서 성장 인자의 잘 이해할 존재에도 불구하고, 여기에 제시된 38 심근 문화 확산하지 않습니다. 오히려, 세포주기 블록은 생체 개발의 주 산기 기간 동안 자신의 세포주기 출구에서 유지했다. 12,39이 속성은 심장 재생 의학의 분야에 큰 관심의 성인 마우스 심근의 영구적 인 특성 것 같다 증식 표현형 성인 포유류 심근의 복귀는 3,26,40-42이 특히 심근 세포가이 세포주기를 재 입력 할 필요가 어느 정도 탈분화 현재 명확하지 않다. 심하게 추구 목표였다하지만 contributio했다낮은 척추 동물의 재생에 탈분화의 n은 잘 탈분화 점점 근원 섬유 분해 6,12,9 포함 해 최소 기능 수준에서 포유류 시스템에서 심근 증식과 심장 재생에서 관찰되고, 또한 43,44,10,11 지원됩니다 따라서, 배양 심근 세포의 분화 상태를주의 깊게 연구 목적의 요구에 따라 고려 변조한다. 이와 같이, 배양 조건은 잠재적으로 더 혈청 농도, 사용 정의 혈청 대체물 또는 혈청이없는 배지를 줄이기 위해 수정 될 수있다. 예를 들어, 조직 근섬유 분절을 나타내는 성인 쥐 심근 혈청없이 배양 장기 있었지만, 이러한 섬유 아세포 성장 인자, 표피 성장 인자 및 트리 요오 도티 로닌 같은 성장 인자 한정 배지에 사용되었다. 45 그것은 생각할 그와 유사한 매체 제형, 또는 잠재적으로 다른 이러한 differenti에서 적응 것과 같은 제형ATION 프로토콜은 46 고도로 조직화 sarcomeric 구조를 표시 배양에서 잘 분화 성인 쥐 심근 세포를 유지하기 위해 사용될 수있다. 다른 제형은 실험의 필요에 따라 (예 고도로 분화 된 심근 드와 같은) 다른 표현형 6을 달성하기 위해 개발 될 수 있지만, 추가적인 작업이 요구 될 것이다.
섬유 아 세포의 역할은 장기적인 문화 신생아 마우스 심근 세포주기 (5)와 (비대 IL6 신호를 통해) 성인 마우스 심근 분화의 조절에 관여하고있다. 19 따라서, 문화에 섬유 아세포의 성장이 실험 해석에 고려되어야한다 . 배양 섬유 아세포의 성장이 전도금 단계를 시토신 아라 비노 시드 (19) (AraC) 또는 유사 화합물을 제한 성장의 첨가에 의해 제어 될 수있다. (28) 그러나, AraC는 또한 대안 심근의 성장을 억제 할방법은 심근 세포주기에 관한 연구에서 섬유 아세포의 성장을 제어하는데 사용한다. 여기에 설명 된 프로토콜의 초기 심근 순도는 중력 침강 단계 (1.4.8 참조) 반복함으로써 향상 될 수있다.
상기 방법은 본원 성인 포유류 심근 세포주기 봉쇄의 특성을 연구하기 위해 사용될 수있는 시험 관내 시스템을 제공한다. 쥐 또는 기니 돼지와 같은 다른 생물에서 일차 전지는 대조적으로, 기본 마우스 심근는 Cre 호텔 기반의 계보가 노크에서 모델을 추적하는 등 강력하고 잘 특징 유전자 도구의 재산을 제공, 47 쉽게에 사용할 수있는 기존 심근 유래의 세포를 확인한다. 또한, 기본 성인 쥐 심근 세포는 세포주기 봉쇄 될 네이티브 발달 조건에 적용되었다 12,48을 세포주 및 분화 ES 또는 IPSC 셀 (46)과는 달리 그들의 모든 편의 불구하고, 이는많은 약물 스크린에 CE 및 적응성 2 성인 심근 세포주기 출구의 특성을 프로빙 실험 제한된 유용성을 가질 수있다.
이 프로토콜은 신뢰할 수있는 분리하는 방법과 문화 성인 마우스 심근를 설명합니다. 여러 가지 방법 이전에 단기 연구를위한 성인 마우스 심근 세포의 분리를 증명하고있다,하지만 지금까지 몇 보고서는 성인 마우스 심근의 장기 문화의 존재합니다. (18, 19) 문화를 활성화해야합니다 성인 마우스 심근를 유지하는 기능을 장기 시험을 필요로하는 실험 조건 하에서 심근 세포 생물학의 시험 관내 연구. 예를 들어, 유전자 발현은 통상적으로 전체 발현을 달성하기 위해 몇 일을 필요로 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 조작 될 수있다. 이후 표현형의 변화 및 분석 실험 목표에 따라 시간이 더 긴 기간을 필요로 할 수있다. 여기에 제시된 방법은 성인 마우스 cardiom의 문화를 수몇 주 동안 yocytes. 이는 세포주기 조절에 관한 것과 심근 생물학 신중한 질문의 조사를위한 강력한 시스템을 제공한다.
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Acknowledgments
이 프로젝트는합니다 (샌들러 재단에 의해 부분적으로 재정 지원) 혁신적인 생물 의학 연구에 대한 UCSF 프로그램, 독립 수상에 NIH 통로 (R00HL114738), 그리고 에드워드 말린 크로 트 주니어 재단의 지원을 받았다. JJ는 NIH (T32HL007731)에서 박사 친교에 의해 지원되었다. 저자는 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다이 작품의 내용에 대한 책임은 전적으로 귀하에게 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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