Abstract
Культивированный кардиомиоциты могут быть использованы для изучения биологии кардиомиоцитов с использованием методов, которые дополняют друг друга систем в естественных условиях. Например, чистота и доступность культуры ин витро позволяет точно контролировать биохимические анализы, живой визуализации и электрофизиологии. Долгосрочная культура кардиомиоцитов предлагает доступ к дополнительным экспериментальным подходам, которые не могут быть завершены в краткосрочных культурах. Например, исследование в пробирке дедифференциации, клеточный цикл повторного входа, и деления клеток до сих пор в значительной степени ограничивается кардиомиоцитов крыс, которые , как представляется более устойчивым в долгосрочной культуре. Тем не менее, наличие богатого набора инструментов трансгенных линий мышей и хорошо развитых моделях болезни делают системы мыши привлекательными для сердца исследования. Хотя некоторые отчеты существуют взрослой мыши кардиомиоцитов изоляции, несколько исследований демонстрируют свою долгосрочную культуру. Представленный здесь, представляет собой способ шаг за шагом дляизоляция и долгосрочная культура взрослых кардиомиоцитов мыши. Во-первых, ретроградный Лангендорфа перфузия используется для эффективного переваривания сердца с протеазами, с последующей очисткой седиментации гравитационный. После периода дедифференциации После выделения клетки постепенно присоединять к культуре и могут быть выращены в течение нескольких недель. Аденовирусы лизат клеток используют для эффективного трансдукции обособленные кардиомиоциты. Эти методы обеспечивают простую, но мощную модель системы для изучения сердца биологии.
Introduction
Культивированный кардиомиоциты часто используются для контроля поведения клеток в хорошо контролируемой среде в пробирке. Например, морфологические, электрические, биохимические или клеточные механические свойства могут быть изучены на сконструированных подложках, 1,2 в определенных средах, и в ответ на небольшие молекулы препаратов, пептиды, регуляции экспрессии генов, 3 или электрической стимуляции. 4 Клеточное содержание может также управлять с помощью определенных сопутствующих культур. 5 Эти эксперименты в пробирке могут быть использованы в большом наркотиков или генетических экранов и дополнять в естественных условиях методы для различных видов исследований , связанных с кардиомиоцитов биологии.
Долгосрочный культура позволяет экспериментальные направления, которые требуют длительных периодов времени для достижения фенотипическое изменение. Своевременное примером является то, что у взрослых млекопитающих пролиферации кардиомиоцитов, где дедифференцировка, клеточный цикл повторного входа, и деление клеток, как правило, исследована более таковойVeral дней до нескольких недель. 6,7 Здесь продленного культура облегчает генетические манипуляции, 7,8 функциональный дедифференцировку (например, саркомера разборка) 9 и потенциально транскрипционный дедифференцировку. 6 После клеточного цикла повторного входа и деление клеток требует еще более длительных периодов культуры наблюдать, особенно если несколько раундов деления являются экспериментальной задачей. Важность клеточного цикла кардиомиоцитов занимает центральное место в нескольких последних ключевых научных работ в регенерации сердца, где дедифференцировка и распространение уже существующих кардиомиоцитов было показано отвечает за регенерацию сердца у данио рерио и неонатальных мышей. 10-12 Таким образом, возможность чтобы стимулировать дифференцировке и клеточного цикла повторного входа в млекопитающих взрослых кардиомиоцитов остается ключевой вопрос , в человеческом регенерации сердца 13-15
Я п пробирке эксперименты по изучению клеточного цикла кардио млекопитающихмиоциты имеют преимущественно используются источники крыс, из - за их относительной легкости долгосрочной культуры по сравнению с моделями мыши. 16 Тем не менее, мышиные системы предлагают богатый ресурс хорошо охарактеризованных трансгенных инструментов и моделей заболеваний, которые полезны в как в пробирке и в естественных условиях протоколы. Например, трассировка родословная Cre на основе позволила выявить ранее существовавших кардиомиоцитов в качестве источника регенерирующим миокард в сердца новорожденной мыши в естественных условиях. 12 В пробирке исследования линиджа обогреваемого неонатальных кардиомиоцитов мышей позволили изучение взаимодействий с стромальных клетки путем совместного культивирования с фибробластами. 5 Тем не менее, из - за своих проблем, 17 несколько отчетов существуют в изоляции и долгосрочной культуре взрослых кардиомиоцитов мышей. 18,19
Выделение жизнеспособных кардиомиоцитов взрослых мышей для одной только кратковременной культуры, как известно, является сложной задачей. Это protocол шаг за шагом инструкции о том, как достичь жизнеспособных кардиомиоцитов из взрослых мышей, которые могут быть использованы как для краткосрочных, так и долгосрочных исследований. Кардиомиоциты , выделенные с использованием этого протокола может быть эффективно трансдуцированных аденовирусных векторов 20,21 и культивировали в течение нескольких недель. Эти методы обеспечивают мощную систему для изучения кардиомиоцитов биологии в пробирке.
Методы , описанные здесь, основаны на нескольких элементов из предыдущих работ с использованием вариаций ретроградной перфузии Лангендорфа. 18,22 Хотя некоторые протоколы были опубликованы на изоляции взрослых кардиомиоцитов мыши для кратковременной культуры и исследования, 23-25 преимущество в этот протокол является способность к культуре изолированных кардиомиоцитов в долгосрочной перспективе. Это будет полезно при изучении клеточных процессов, связанных с эктопической экспрессии генов и требующих длительных периодов времени, например, в клеточных стратегий перепрограммирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные здесь, были утверждены по эксплуатации и уходу Комитета Institutional животных в Университете Калифорнии, Сан-Франциско.
Примечание: Если коротко, то после извлечения сердца из грудной клетки мыши, ишемическая ретроградной перфузии используется для эффективного переваривания внеклеточного матрикса с коллагеназы и протеаз XIV. Желудочки затем выделяют, механически диссоциированы и фильтруют в суспензии отдельных клеток. Гравитационный седиментации выполняется для изоляции кардиомиоциты, которые отделены друг от стромальных клеток, таких как фибробласты и эндотелиальные клетки путем их высокой плотности. Очищенные кардиомиоциты можно культивировать в течение нескольких недель на ламининовым покрытых полистиролом и трансдуцированных векторами гена аденовируса.
1. Выделение кардиомиоцитов
- Приготовьте буферами, Хирургический Station и перфузионные Apparatus
- Подготовка буферов и средств массовой информации в соответствии с таблле 1.
- Включите циркулирующей в водяной бане, установленной температуры таким образом, что входной вывод жакета нагретой воды достигает температуры 37 ° С.
- Чистая система перфузии путем промывки 70% -ным этанолом. Затем удалить все следы этанола из системы промыванием несколькими объемами стерильной воды.
- Нагружает систему перфузия перфузионного буфером (таблица 1). Первый слив воды из системы, а затем на одном уровне с 2 объемами буфера перфузионного. Затем заполнить мертвое пространство с перфузионной буфером таким образом, что внутренняя колонна тепловой рубашкой заполнен перфузионного буфером, но debubbling камера пуста.
СОВЕТ: Убедитесь , что пузырьки воздуха не присутствуют в строке ниже debubbling камеры. Чтобы удалить непокорных пузыри, задействовать все запорные краны и позволить давление, чтобы создать внутри линии в течение нескольких секунд. Затем отпустите нижний запорный кран, позволяя перфузионной буфер высокого давления для струи из выходного отверстия; быстрый поток и turbulencе поможет вытеснить пузырьки, которые пойманы вблизи выхода перфузионной. - Приготовьте шприц с иглой, чтобы использоваться для аортального пункции. Присоедините тупую иглу 18 G к 1 мл шприц, заполненный перфузионного буфером. Удалите пузырьки воздуха и закрепите узел шприца на одну руку рассекает miscroscope осветитель с лабораторной лентой.
СОВЕТ: Чтобы создать тупыми иглу из скошенной иглы, секут вал иглы с кусачками. Затем заточить наконечник с шлифовальной камнем, пока наконечник не является плоской.
Примечание: Чтобы уменьшить проскальзывание аорты от иглы во время пункции, шероховатым вал иглы катетеризации с помощью лезвия бритвы. Зафиксировать иглу с помощью втулки и верхнего вала, а затем увидел бритву взад и вперед перпендикулярно к продольной оси вала иглы при вращении, пока несколько канавок не было создано в 1 см от кончика вала иглы. Переход к новой бритвы, когда лезвие становится тусклой. - Поместите чистыйчашку Петри под микроскопом рассекает, чтобы содержать сердце во время пункции. Расположите осветитель руку таким образом, чтобы кончик канюли вблизи края поля зрения, но не препятствует рассечение. Убедитесь, что конец канюли находится ниже края чашки Петри.
Примечание: Чтобы помочь иммобилизации сердце во время вскрытия, поместите небольшой (~ 5 - 7 см 2) квадрат 215 микрон сетки в чашке Петри. Когда сердце помещается на этой сетке, она будет создавать трение, чтобы уменьшить скольжение и вращение сердца во время механических манипуляций. - Tie 2 швами с рыхлыми двойных простой узел вокруг втулки канюли иглы, которые будут использоваться для прикрепления аорты.
- Сердце Добыча и катетеризацию
- Администрирование гепарин (5 МЕ / г массы тела) с помощью внутрибрюшинной инъекции. Подождите 20 минут, чтобы позволить гепарин циркулировать к сердцу.
- Обезболить мышь внутрибрюшинной Injectион 20% -ным раствором карбамата (2 мг этилкарбамата / г массы тела). Соблюдайте внимательно, пока мышь не находится под глубоким наркозом (примерно 3 - 5 мин).
Примечание: Глубокий наркоз подтверждается отсутствием как пальца щепоткой и рефлексы роговицы. Если мышь не достигла глубокого наркоза при 8 - 10 мин, а затем вводить дополнительную дозу этилкарбамата. Хотя индивидуальные реакции на анестезии будет варьироваться от мышей, отказ ввести глубокого наркоза после первой дозы может свидетельствовать о деградировавших этилкарбамата, который может препятствовать глубокой анестезии даже после многократного дозирования. Для предотвращения деградации, готовят свежий раствор этилового карбамата перед каждым использованием. - Зафиксировать мышь к хирургии платформы, обеспечивая каждой конечности с хирургической лентой. Лечить области надреза с либеральным количеством 70% этанола. Пэт насухо лаб-вытирать.
- Подтяжка кожи пинцетом ткани чуть ниже грудины. Делают боковой разрез с маленькими ножницами, резка беспересадочныйтьфу кожу и живот.
- Используйте кровоостанавливающих, чтобы осторожно поднимите грудную клетку через грудины. Использование малых рассечение ножницами, расширить разрез в V-образную форму по направлению к подмышечной. Прорубленный первого ребра и проткнуть диафрагму с каждой стороны.
- Продолжайте поднимать грудную клетку с кровоостанавливающих и использовать маленькие ножницы радужной оболочки глаза, чтобы полностью секут диафрагму. Будьте осторожны, чтобы не проколоть сердце.
- Отвести грудную клетку ростральным с помощью прикрепленных кровоостанавливающих и быстро, но осторожно продлить разрез V-формы путем разрезания через грудную клетку по направлению к подмышечной с обеих сторон. Отвод средней части грудной клетки полностью и лег прикрепленные кровоостанавливающих, чтобы удерживать на месте.
- Удалить перикарда с использованием тонких щипцов.
- В то время как осторожно приподнимая сердце с помощью изогнутых щипцов, секут вены и артерии, прикрепленные к сердцу. Сразу же место в сердце ледяным буфером перфузионного, чтобы замедлить сокращение мышц.
- Поместите сердце в чашке Петри подрассечение микроскоп (место на небольшой кусок сетки 215 мкм, чтобы помочь иммобилизации во время вскрытия). Обрежьте излишек ткани несердечную помощью тонкой радужной оболочки глаза ножницами. Соблюдайте осторожность при резке вблизи аорты.
- Трансекте аорту вблизи brachioencephalic артерии, и заботиться, чтобы не позволить пузырьки или мусор ткани входить в отверстие.
- Наполните чашку Петри, содержащую сердце ледяным перфузионного буфером таким образом, что уровень жидкости поднимается над отверстием канюли. Оболочка аорту на канюлю таким образом, чтобы кончик чуть дистальнее аортального клапана.
Совет: Для того, чтобы уменьшить риск эмболии воздуха, слегка угнетают шприц на канюле перед катетеризацией для того , чтобы устранить возможные пузырьки воздуха , которые могут быть разработаны в конце полой иглы. Кроме того, держать кончик канюли и аортой под поверхностью раствора, чтобы избежать введения пузырьков в то время как в ножны аорту. - Оденьте предварительно привязанную 7-0 шелковым швом внизвал катетеризации иглы и положение непосредственно над кончиком иглы. Затяните узел с тонким пинцетом. Повторите этот шаг со вторым швом расположен чуть выше первого.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь , что кончик иглы все еще находится выше аортального клапана до и после затяжки. - Медленно нажать шприц для извлечения 0,5 мл перфузионного буфера через коронарных артерий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если канюляция прошла успешно, кровь будет визуализирована оставляя коронарных сосудов и аккумулирования из дорсальных вен и артерий.
ВАЖНО: Время от открытия грудной полости (в частности, прокалывая диафрагму) на начальный перфузию должна быть сведена к минимуму , чтобы уменьшить гипоксию экспозицию и увеличить выживаемость и здоровье изолированных кардиомиоцитов. В идеале, на этот раз должно быть меньше, чем за 5 минут.
- перфузия
ПРИМЕЧАНИЕ: ретроградная перфузияУстройство может быть удобно работать в чистой окружающей среде на стандартном лабораторном столе или поместить в колпаке с ламинарным потоком, чтобы максимизировать стерильность. Тем не менее, после того, как перфузия завершена, работа должна быть выполнена в соответствии с ламинарного потока, чтобы свести к минимуму загрязнение.- Аккуратно, но надежно удалить канюлю втулку из шприца (с использованием стерильных перчаток), медленно поворачивая назад и вперед. Вытягивая канюлю иглы от шприца, медленно выталкивать перфузионного буфер в ступице иглы, чтобы предотвратить пузырьков воздуха во время перфузии.
- Снимите трубку с рециркуляцией улов из-под выпускным отверстием перфузионной и заменить мензурку отходов на вылов. Присоединить иглодержатель к адаптеру Луер , который крепится к выходному отверстию перфузия (Рисунки 1, 2) на водяной рубашкой, в то время как насос работает на самом низком уровне (15 оборотов в минуту, ~ 6 мл / мин).
СОВЕТ: При подключении иглодержатель к адаптеру Луер, позволяют капать перфузия буфер конключении к жидкости в ступице иглы для того, чтобы избежать введения пузырьков. - Заливать сердце без рециркуляции до 8 мл перфузионного буфера не будут отсасывают с помощью наливного шланга.
Примечание: Объем перфузионного буфера отсасывают с помощью наливного шланга на этом этапе принимает мертвый объем 7 мл для перфузионной системы, что дает в общей сложности 15 мл перфузионного буфера прокачивается через сердце. - Извлеките впускную трубу из буфера перфузионного. Позволить воздуху аспирироваться воздухозаборником меньше, чем мертвого объема системы.
Примечание: Объем всасываемого воздуха на этом этапе должны быть скорректированы , чтобы предотвратить попадание воздуха внутрь коронарных артерий (этап 1.3.7). - Поместите входную трубку в пищеварительную буфер (таблица 1), как раз выше в нижней части трубки. Поток медленно и дайте впускную трубу отсосать достаточного объема, чтобы избежать переполнения трубки.
- Визуализируйте и следовать за пузырьком воздуха междубуфер перфузии и буфер переваривание, когда он проходит через тепловой рубашкой. Обратите внимание на уровень перфузионного буфера в центре тепловой рубашкой начинают падать после того, как пузырек воздуха достигает камеры де-барботажных. После того как буфер переваривание достигает камеры де-барботажных, уровень жидкости в тепловой рубашкой будет оставаться стабильным.
ВАЖНО: Если уровень перфузии буфера падает слишком низко, закройте выпускной кран и откройте выпускной кран. Разрешить уровень подняться до комфортного уровня (3 - 5 дюймов выше выходное отверстие). Затем остановите перфузионного насоса и закройте вентиль запорный кран. Откройте запорный кран на выходе порта и перезапустить перфузионного насоса. - Смотрите решение возникающих из сердца. По мере того как последний из буфера перфузионного покидает сердце и буфер пищеварение начинает циркулирующей через сердце, изменение цвета от прозрачного до светло-коричневого цвета будет наблюдаться из-за наличия коллагеназы.
- Заливать сердца с пищеварением буферомв течение приблизительно 10 - 15 мин. Сердце начнет сутулиться, как коллаген разрушается и теряет механическую поддержку.
- Механическая диссоциация и очистка
- Удалите сердце из канюли с пинцетом и поместить в сухой чашке Петри. Быстро подрезать экстра-желудочковой ткани с использованием тонких ножниц радужной оболочки глаза. Передача желудочки в свежую чашку Петри, содержащую перфузионной буфера для промывки. Перемещение чашку Петри в стерильную капот и передать желудочки на свежий, сухой чашке Петри.
- Сбор 7,5 мл буфера пищеварения от теплового пиджака и добавить 2,8 мкл 1 М CaCl 2, перемешать с помощью инверсии. Добавляют 2 - 3 мл буфера для переваривания с CaCl 2 в желудочки в чашке Петри.
Примечание: Концентрация Ca 2+ повышается от 300 до 700 мкм - Быстро растирают желудочковой ткани с тонким пинцетом, так что большинство частей меньше , чем 1 мм 3. Добавьте остаютсяИнг Са 2+ , дополненной буфером переваривание с шага 1.3.2 диссоциированных желудочков в чашке Петри и перемешать путем осторожного перемешивания.
- Поместите чашку Петри в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. Перемешивают чашку Петри каждые 2 мин, пока достаточное количество кардиомиоцитов (см примечание ниже) были выпущены из ткани.
Примечание: Длина инкубации может потребоваться скорректировать , чтобы точно настроить степень переваривания в соответствии с потребностями эксперимента. Как правило, более длительные периоды инкубации увеличить выход и чистоту, но может уменьшить скорость прикрепление клеток и выживаемости. 5 - 10 мин , как правило , достаточно для достижения высокого выхода (~ 5 - 10 х 10 5 клеток на сердце). - Переносят чашку Петри обратно в колпаке с ламинарным потоком. С помощью пипетки передачи срезаны под углом 45 °, осторожно пипеткой ткани для дальнейшего диссоциирует.
- Используйте стерильные перчатки, чтобы сложить сетку на 215 мкм в конус и удерживать более 50 мл коническую. пипеткаПриостановка диссоциированного ткани на сетку и позволить фильтрат стечь в 50 мл коническую. С помощью 7,5 мл подогретого стоп - буфера (таблица 1) , чтобы вымыть кардиомиоцитов из чашки Петри через сетку, совмещая с первого фильтрата.
Примечание: Са 2+ повышают до окончательного 1,1 мМ и конечная 2,5% FBS , в стоп - буфера нейтрализует активность протеаз. - Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую и дают осесть под действием силы тяжести в течение 15 мин.
- Осторожно удалите супернатант с пипетки передачи такой, что только 50 - 100 мкл раствора остается выше клеток. Добавьте 10 мл подогретого, уравновешенной культуральной среды (таблица 1) и перемешать с помощью осторожного переворачивания. Разрешить кардиомиоциты осесть под действием силы тяжести в течение 15 мин.
СОВЕТ: Для повышения чистоты, повторите шаг 1.4.8 по желанию. - Осторожно удалите супернатант с пипетки передачи таким образом, что только 50 - 100 мкл Oе решение остается выше клетками.
2. кардиомиоцитов Культура
- Предварительное покрытие тканевой культуры обработанных чашках Петри с ламинин (10 мкг / мл) и хранят при температуре 37 ° С в течение 2 ч до посева клеток. Непосредственно перед металлизированный, аспирация ламинин раствора из планшета для культуры ткани. Промывают один раз PBS или MEM, затем аспирата остаточной жидкости для удаления не адсорбированного ламинин.
- Добавьте достаточно подогретого, уравновешенной культуральной среды для достижения желаемой плотности клеток, перемешать с помощью осторожного переворачивания. Тарелка желаемой концентрации клеток в культуральном сосуде ( как правило , 5 - 20 х 10 4 клеток / см 2). Для того, чтобы оценить выход изоляции кардиомиоцитов, подсчитывать клетки через гематоцитометре или тест-пластины путем проверки плотности под микроскопом. Сердце взрослой мыши , как правило , обеспечивает 0,5 - 1,0 × 10 6 клеток на этой стадии протокола.
СОВЕТ: При использовании 96 - луночные планшеты, используют 1000 мкл micropipEtte с наконечником, срезанными под углом 45 °, чтобы свести к минимуму повреждение клеток из-за силы сдвига. Поместите наконечник пипетки таким образом, чтобы она касалась дна лунки во время выброса клеточной суспензии, с тем чтобы свести к минимуму введение пузырьков. - Перемещение клеток культуры блюдо быстро до 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 и 95% влажности. Изменение средств массовой информации по мере необходимости для предотвращения закисления: каждые 1 - 5 дней в зависимости от плотности клеток. Сведение к минимуму обработку чашки для культивирования в течение первых 3 - 6 дней, чтобы облегчить прикрепление к поверхности клеточной культуры.
Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму нарушения клеток во время смены носителя , когда клетки не полностью присоединены, выполнить изменение половину средств массовой информации. Медленно аспирация СМИ, сохраняя при этом кончик пипетки чуть ниже поверхности носителя. Затем медленно добавляют дополнительный носитель, держа наконечник пипетки прямо над поверхностью вплотную к стенке чашки для культивирования. - Для того, чтобы оценить жизнеспособность кардиомиоцитов, проверитьморфология под светлопольному микроскопии. Свежеизолированных кардиомиоциты поддерживать примерно палочковидные морфологию с острыми, четко выраженными краями под светлопольному подсветкой (рисунок 2).
Примечание: Подтвердить жизнеспособность путем окрашивания клеток с трипановым синим. - Для оценки чистоты выделения кардиомиоцитов, проверить морфологии клеток для выявления кардиомиоциты. Пятно ядра с Hoescht 33342, чтобы определить общее количество клеток.
Примечание: кардиомиоциты могут быть идентифицированы из некардиомиоциты по их характерной морфологии (палочковидные) и размер (примерно 100 - 200 мкм в длину). В качестве альтернативы свежевыделенные кардиомиоциты будет пятно положительным для кардиомиоцитов специфических маркеров, таких как альфа-актинин 26 (рис 3C, D) или сердечный тропонин Т. 27
3. Генная трансдукция с аденовируса
- Подготовить аденовируса клеточный лизат, используя установленную мethods. 21 трансдукции кардиомиоциты с использованием клеточного лизата от производителя аденовирус клеток 10. В день 0 или 1-й день после изоляции, осторожно добавьте лизата клеток в средах, содержащих кардиомиоциты.
Примечание: Препарат аденовирус с высоким титром достигнет сильное выражение приблизительно 48 - 72 ч. Отрегулируйте кратность инфекции в соответствии с дизайн эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дикого типа взрослых ICR (CD1) мыши сердца обычно дает от 500000 до 1 миллиона кардиомиоцитов из успешной изоляции. Сразу после выделения клетки поддерживают в основном в форме стержня , внешний вид (Фигура 3А) с неповрежденными саркомеров и могут быть использованы для функциональных исследований с участием кардиомиоцитов сократимость. Высокий процент палочковидных кардиомиоцитов (выше 90%) является показателем эффективного перфузией и пищеварения. Жизнеспособные кардиомиоциты будет большим (~ 100 - 200 мкм в длину) и , по всей видимости имеют резкую внешнюю мембрану под светлое освещение (рис 3А). Иммуногистохимическое кардиомиоцитов конкретных саркомерных маркеров, таких как альфа-актинин, приведет к отчетливым саркомерного рисунка полосы (рис 3C). В сочетании с морфологическим анализом и ядерного окрашивания DAPI, иммунное может быть использован для оценки чистоты выделенных кардиомиоцитов. ФиБробластей будет маленький и круглый сразу после изоляции, но быстро одевается и распространяться тонкий на клеточной культуре пластика, что позволяет легкое различие от кардиомиоцитов.
Низкий процент палочковидных кардиомиоцитов является признаком неудачной изоляции. Это может быть результатом неспособности быстро вводить иглу аорту после того, как сердце извлекается из животного. Неэффективное перфузия, из-за воздушной эмболии или неправильной пункции, например, могут также влиять на морфологию и жизнеспособность кардиомиоцитов.
После нескольких дней в культуре, кардиомиоциты приобретают округлую морфологию (фигура 3В). В течение 1 - 2 недель, живые кардиомиоциты прикрепляться к субстрату и начать распространение (рис 3D, E). Мертвые клетки могут быть идентифицированы с помощью трипанового синего включения. Успешная изоляция и культура даст примерно 50% живой кардиомиоциты через 1 неделю. Загрязнения некардиомиоциты, таких как фибробласты, обуславливают высокий процент этих клеток позже в культуре из-за их пролиферативного потенциала. Этого можно избежать путем увеличения числа тяжести седиментации и / или с помощью предварительной металлизации с целью повышения чистоты. 28
Трансдукция с аденовирус может быть использовано для достижения сильного экспрессии гена в течение 48 - 72 ч (рис 3e). Аденовируса серотипа 5 эффективен при трансдукции кардиомиоцитов взрослых мышей в пробирке из - за высокой экспрессии coxackie-аденовирус - рецептора, но может зависеть от типа используемого носителя. 20
Рисунок 1. кардиомиоцитов изоляции оборудования и приборов. (A) Хирургические инструменты , используемые для извлечения мышьсердца и вводить иглу в аорту, сверху вниз: кровоостанавливающих, пинцеты ткани, изогнутые щипцы, Дюмон # 5 тонких щипцов, маленькие рассечения ножницы, тонкие ирис ножницы, тонкие сжимания ножницы (B) Система перфузионного Langendorff используется , чтобы переварить сердце мыши. , Перфузионные буферы отсасывают через впускную трубку (1) с помощью перфузионного насоса (2) и через выходное отверстие насоса трубку (3), во впускное отверстие на кожухе с подогревом воды (4). Перфузионной буферы согревает рубашкой с подогревом воды, как они проходят через спиральный стеклянную трубку, в debubbling камеру, а затем из катетеризации иглы, прикрепленной к выпускному перфузия порту (5), который соединен с запорным краном. Коническая трубка ниже улавливает перфузионной буферы, которые повторно циркулировать через впускную трубу. Порт давления (6), порт податливость (7) и отверстие (8) остаются закрытыми в течение перфузией, чтобы поддерживать постоянную скорость потока. Куртка вода нагревается на водяной бане циркулирующей поступающий через йна входе электронной куртки (9) и выходной (10) портов. Кольцевой стенд используется для хранения куртку с подогревом воды в вертикальном положении (красные зажимы, черное основание ниже стойки фиолетовом коническую трубку). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схема Обзор перфузионной системы. Важные Части Perfusion аппарата маркированы , как указано в манускрипте. Направление потока перфузионной буфера обозначено стрелками. Обратите внимание на расположение аорты канюлю, кончик которого должен быть виден через полупрозрачную аорты, обеспечивая его помещают над аортального клапана. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Изолированные взрослой мыши кардиомиоциты. Кардиомиоциты были выделены и высевали Laminin покрытием 96 - луночные планшеты , как описано в протоколе в данном документе. (A) Свежевыделенные кардиомиоциты, высевают в количестве приблизительно 8000 клеток / см 2. Обратите внимание, что свежевыделенные, жизнеспособные кардиомиоциты появляются приблизительно стержнеобразные с острыми краями (белый стрелки). Тем не менее, кардиомиоциты, которые, как представляется, имеют диффузный внешнюю мембрану под светлого мертвы. В течение первых нескольких дней культивирования кардиомиоциты приобретают округлую форму (В). (С) иммуногистохимическое альфа-актинин (зеленый) обнаруживает характерное саркомера полосатость в качестве кардиомиоцитов на d1 после изоляции. Ядерное пятна (DAPI) показаны синим цветом. Верхняя часть показывает увеличенное изображение намеченных области в нижнем изображении. (D) (E) Светлое и эпифлуоресцентной изображения показывают кардиомиоцитов на 11 -й день после изоляции трансдуцированную аденовирус , несущий GFP репортер под контролем CMV - промотора ( подарок от Роберта Джерарда в Техасском). Клетки высевают в количестве примерно 18 000 клеток / см 2 и трансдуцировали на 0 -й день с использованием множественности инфекции приблизительно 800 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на клетку. Шкала баров:. 50 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Изоляция кардиомиоциты буфера (CIB) | |||
| Добавить 900 мл сверхчистой воды в чистый химический стакан под МАГнитного перемешивание. | |||
| Добавьте буферные компоненты в таблице, как указано. | |||
| Компонент | МВт | Конечная концентрация (мМ) | 1X (г / л) |
| NaCl | 58.44 | 120 | 7,013 |
| KCl | 74.55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 O 2 HPO4.7H | 268,07 | 0,33 | 0.088 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 246,48 | 0,5 | 0.123 |
| Таурин | 125,1 | 30 | 3,753 |
| БДМ | 101,1 | 10 | 1,011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5958 |
| глюкоза | 180,16 | 22 | 3,964 |
| Отрегулируйте рН остроумиеч 5 М NaOH. | |||
| Отрегулируйте громкость на 1 л сверхчистой воды. | |||
| Стерильный фильтр ж / 0,22 мкМ вакуум-фильтра. | |||
| Добавить 0,5 мкл 0,1 ед / мл инсулина на литр буфера изоляции кардиомиоцитов. | |||
| Перфузия буфер | |||
| Компонент | окончательный | Объем (мл) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4М) | 0,4 мМ | 0,2 | |
| Всего | - | 200 | |
| Пищеварение буфера | |||
| Компонент | окончательный | Количество | |
| CIB | - | 15 мл | |
| CaCl 2 (1M) | 300мкМ | 4,5 мкл | |
| Протеаза XIV | 0,2 мг / мл | 3 мг | |
| коллагеназы II | 2,4 мг / мл | 36 мг | |
| Всего | - | 15 мл | |
| Стоп буфер | |||
| Компонент | окончательный | Объем (мл) | |
| Перфузия буфер | 95% | 14.25 | |
| CaCl 2 (1M) | 1,5 мМ | 22,5 | |
| FBS | 5% | 0,75 | |
| Всего | - | 15 мл | |
| Питательные среды | |||
| Компонент | Окончательный% | Объем (мл) | |
| MEM СМИ | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0,2 | |
| Всего | 100% | 100 мл | |
| Разрешить питательные среды уравновешивают при температуре 37 ° С, 5% углекислого газа. | |||
Таблица 1: Растворы и буферными растворами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Общее состояние здоровья выделенных кардиомиоцитов зависит от нескольких важных аспектов этого протокола. Во-первых, время от добычи сердца до перфузии имеет решающее значение и должна быть выполнена в течение 5 мин или менее. Удаление кальция помогает отмежеваться межклеточных взаимодействий, но может негативно сказаться на здоровье клеток в долгосрочной перспективе. 29-32 Таким образом, мы считаем , что достаточно для удаления кальция в течение первых нескольких минут перфузии с помощью EGTA (этиленгликоль тетрауксусная кислота) комплексообразования, 22 , но быстро восстановить кальция в процессе пищеварения и последующих стадиях.
Использование протеазы XIV значительно повышает эффективность пищеварения по сравнению с коллагеназы в одиночку. Это уменьшает несоответствие из - за периодического действия изменчивости коллагеназы, 18,24 и увеличивает чистоту кардиомиоцитов путем облегчения разделения во время гравитационного осаждения. Тем не менее, чрезмерное пищеварения будет препятствовать эффективному прикрепление к субстрату культуры, поэтому тонкий баланс Iы требуется для оптимизации выхода клеток и чистоту при сохранении прикрепление клеток и жизнеспособность. Таким образом, концентрация протеаз и продолжительности переваривания могут быть изменены в соответствии с экспериментальным целей. В общем, меньшая степень переваривания повысит прикреплению и длительному выживанию кардиомиоцитов. Применение трипсина было сообщено в некоторых протоколах изоляции кардиомиоциты. 18 Тем не менее, добавление трипсина к коктейлю протеазы , используемой здесь (коллагеназы и протеазы XIV) снижает долгосрочную жизнеспособность кардиомиоцитов в культуре, возможно , из - за чрезмерной переваривания или расщепления существенной поверхности и / или белков внеклеточного матрикса.
Включение бутандион моноксима (БДМ) во время изоляции препятствует сердечной мышцы, и , таким образом , уменьшает негативные последствия из - за терминала контрактуры, расхода энергии, и парадокс кальция. 29,33 Тем не менее, в нашем опыте, удаление БДМ до культуры dedifferentiatio ускоряетN и позволяет клеткам адаптироваться к культуре в двух измерениях.
Важно отметить, что долгосрочные адаптации к 2-D культуры могут влиять на функциональные аспекты кардиомиоцитов, такие как сократимость. Таким образом, сократимость и электрофизиологические эксперименты должны проводиться вскоре после изоляции, когда родное саркомера организация до сих пор нетронутыми. Кроме того, как и в любом эксперименте ин витро, клетки в культуре, лишены некоторых несвойственных влияний , присутствующих в естественных условиях, таких как гуморального или иммунной сигнализации. С другой стороны, определенные сокультурах могут быть реализованы для изучения взаимодействия кардиомиоцитов и других типов клеток. 5,34 Кроме того, в пробирке культуре может быть использован для изучения поведения кардиомиоцитов с определенными молекулярными сигналами в культуральной среде. Таким образом, общие цели эксперимента должны быть тщательно продуманы и взвешены против ограничений и преимуществ этой системы культуры.
35 Следует отметить , что ФБС и других животных , полученных сывороток содержат неизвестные компоненты которые могут влиять на клеточной физиологии . 36,37 Несмотря на хорошо оценили наличие факторов роста в FBS, 38 кардиомиоциты культуры , представленные здесь , не размножаются. Скорее всего , блок клеточного цикла , как представляется, стойкое свойство взрослых кардиомиоцитов мышей ех естественных условиях, поддерживается от их выхода из клеточного цикла в перинатальном периоде развития. 12,39 Это свойство представляет большой интерес для области сердца регенеративной медицины, где реверсия взрослых кардиомиоцитов млекопитающих к пролиферативного фенотипа был в значительной степени преследовало цель. 3,26,40-42 Примечательно, что в настоящее время неясно , в какой степени дедифференцировка требуется для кардиомиоцитов , чтобы вновь войти в клеточный цикл, но contributioп дедифференциации к регенерации у низших позвоночных хорошо поддерживается 43,44,10,11 Кроме того, дедифференцировка все чаще наблюдается в пролиферации кардиомиоцитов и регенерации сердца в системах млекопитающих, по крайней мере , на функциональном уровне, в том числе миофибриллярного разборки 6,12,9 Таким образом, состояние дифференциации кардиомиоцитов в культуре должны быть тщательно продуманы и модулируется в соответствии с потребностями целей исследования. Таким образом, условия культивирования могут потенциально быть дополнительно модифицированы с целью уменьшения концентрации сыворотки, использование определенных заменителей сыворотки или не содержащей сыворотки среде. Например, взрослые кардиомиоцитах крысы , проявляющие организованные саркомеры культивировали долгосрочный без сыворотки, но факторы роста , такие как фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, и трийодтиронина использовались в средах определенного состава . 45 Вполне возможно , что подобные составы , средства массовой информации, или потенциально другое составы, такие, как те, которые адаптированы из differentiпротоколы Ation, 46 могут быть использованы для поддержания хорошо дифференцированных кардиомиоцитов взрослых мышей в культуре , которые отображают высокоорганизованных структур саркомера. Альтернативные препараты также могут быть разработаны для достижения других фенотипов (например, высоко - де-дифференцированных кардиомиоцитов) 6 в зависимости от потребностей эксперимента, но потребуется дальнейшая работа.
Роль фибробластов участвует в регуляции неонатальный кардиомиоцитов мыши клеточного цикла 5 и взрослых мышей кардиомиоцитов дифференцировки (через гипертрофической сигнализации IL6) в долгосрочной культуре. 19 Таким образом, рост фибробластов в культуре должны учитываться в экспериментальных интерпретаций , Рост фибробластов в культуре можно контролировать путем добавления роста , ограничивающего соединений , таких как цитозинарабинозидом 19 (AraC) или с помощью этапов предварительного покрытия. 28 Тем не менее, AraC будет также ингибировать рост кардиомиоцитов, так что альтернативаметоды должны быть использованы для контроля роста фибробластов в исследованиях, касающихся цикла кардиомиоцитов клеток. В протоколе, описанном здесь, первоначальная чистота кардиомиоцитов может быть повышена за счет повторения стадии седиментации (сила тяжести см 1.4.8).
Методы здесь , обеспечивают систему ин витро , который может быть использован для изучения природы взрослого блокады клеточного цикла кардиомиоцитов млекопитающих. В отличие от первичных клеток других организмов, таких как крысы или морской свинки, первичные кардиомиоциты мыши предлагают множество мощных и хорошо охарактеризованных генетических инструментов, таких как Cre основе родословная трассировки нокаута в модели, 47 , которые могут быть легко использованы для идентифицировать клетки , полученные из ранее существовавших кардиомиоцитов. 12,48 Кроме того, первичный взрослых мышиных кардиомиоциты подвергнутые нативных условиях развития , которые приводят к блокаде клеточного цикла, в отличие от клеточных линий и дифференцированные ES или Ipsc клетки 46 , которые, несмотря на их convenienCE и адаптируемость к большим экранам наркотиков, 2 могут иметь ограниченное применение в экспериментах зондирующих природу взрослых кардиомиоцитов выхода из клеточного цикла.
Этот протокол описывает надежный способ выделить и культивировать кардиомиоцитов взрослых мышей. Существует несколько методов ранее продемонстрировали выделение взрослых кардиомиоцитов мыши для краткосрочного обучения, но на сегодняшний день, мало сообщений существуют в долгосрочной культуре кардиомиоцитов взрослых мышей. 18,19 способность поддерживать кардиомиоцитов взрослых мышей в культуре должно позволить исследование в пробирке кардиомиоцитов биологии в экспериментальных условиях , требующих длительного обследования. Например, экспрессия гена можно манипулировать, используя аденовирусные векторы, которые обычно требуют несколько дней, чтобы достичь полного выражения. Последующие фенотипические изменения и анализ может потребовать даже более длительные периоды времени, в зависимости от экспериментальных целей. Методы, представленные здесь, позволяют культуру взрослой мыши cardiomyocytes в течение нескольких недель. Это должно обеспечить мощную систему для исследования осторожных вопросов в кардиомиоциты биологии, таких, как те, которые касаются регуляции клеточного цикла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот проект был профинансирован программой UCSF для прорыва биомедицинских исследований (финансируется частично за счет Sandler Foundation), НИЗ путь к независимости премии (R00HL114738), и Эдвард Mallinckrodt младший Foundation. JJ была поддержана докторантуру из NIH (T32HL007731). Авторы несут полную ответственность за содержание этой работы, которая не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
