Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt, einschließlich der Vereinigten Staaten , wo es mehr als 780.000 Todesfälle entfallen jährlich. 1 Koronargefäßverkalkung und Aortaverkalkung sind Markenzeichen von atherosklerotischen Erkrankungen und dienen als starke Prädiktoren für kardiovaskuläre Ereignisse. 2- Intima - Verkalkung, im Zusammenhang mit Atherosklerose und medial (auch bekannt als Mönckeberg) Verkalkung, im Zusammenhang mit chronischer Nierenerkrankung und Diabetes 5 intimale Verkalkung tritt bei der Festlegung der Lipidakkumulation und Makrophagen. 4 Zwei Arten von Gefäßverkalkungen wurden bei Erwachsenen berichtet Infiltration in die Gefäßwand. 5,6 Medial Wand Verkalkung erfolgt unabhängig von Intima Verkalkung, lokalisiert zu Elastinfasern oder glatte Muskelzellen, und ist nicht mit Lipidablagerung oder Makrophagen - Infiltration verbunden. 5,7,8 Untersuchungen über die molekularen Mechanismen derGefäßverkalkung haben auf zellbasierten und Tiermodellsysteme verlassen. Nagermodelle für atherocalcific Krankheit gehören Mäuse einen Mangel an entweder Apolipoprotein E (ApoE) 9,10 oder Low-Density - Lipoprotein - Rezeptor (LDLR) 11 zugeführt , eine fettreiche Diät, während Modelle für mediale Verkalkung gehören Mäuse mit Matrix - Gla - Protein (MGP) -Mangel 12 oder Ratten , die Urämie entweder in der Nähe von insgesamt Nephrektomie (die 5/6. Nephrektomie - Modell) oder durch Bestrahlen mit einem High-Adenin - Diät zu entwickeln. 13

Hier wird das Modell der medialen Gefäßverkalkung im Zusammenhang mit MGP Mangel konzentriert sich auf. MGP ist ein extrazelluläres Protein , das Arterienverkalkung hemmt. 12 Mutationen im MGP - Gens in Keutel Syndrom, eine seltene Krankheit beim Menschen gekennzeichnet durch diffuse Knorpelverkalkung neben brachytelephalangy, Hörverlust und periphere Pulmonalstenose identifiziert worden. 14-18 Obwohl nicht oft beobachtet, 19konzentrischer Verkalkungs mehrerer Arterien wurde in Keutel Syndrom beschrieben. 20 Gemeinsame Polymorphismen im menschlichen MGP - Gens sind mit einem erhöhten Risiko für koronare Arterienverkalkung zugeordnet, 21-23 während höhere Blutspiegel von nicht - carboxyliertem, biologisch inaktive MGP kardiovaskuläre Mortalität vorherzusagen. 24 Im Gegensatz zum Menschen mit Keutel Syndrom, MGP-defiziente Mäuse eine schwere vaskuläre Phänotyp bei zwei Wochen alte spontan weit verbreitet , bestehend aus Startarterienverkalkung entwickeln und 6-8 Wochen nach der Geburt aufgrund Aortenruptur sterben. 12

Im Gegensatz zu ApoE - / - und LDLR - / - Mäuse gefüttert eine fettreiche Diät, die mit zugehörigen Makrophagen-induzierte Entzündung der Intima Gefäßverkalkung entwickeln, MGP - / -. Mäuse in Abwesenheit von Makrophagen - Infiltration medial Gefäßverkalkung entwickeln 11,25 Obwohl diese Ergebnisse legen nahe, verschiedene zugrunde liegende Reize für intimal und mediale Verkalkung ist es eine Überlappung in den Signalisierungsmechanismen , die beide Formen der Verkalkung vermitteln. 26 Multiple Signalwege identifiziert wurden, die zu Gefäßverkalkung einschließlich entzündlicher Mediatoren, wie Tumornekrosefaktor-α und IL-1 und pro-osteogenen Faktoren tragen Diese signal~~POS=TRUNC erhöhen die Expression der Transkriptionsfaktoren , wie beispielsweise Notch, Wnt und bone morphogenetic protein (BMP) signalisiert. 27,28 runt bezogenen Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) und osterix, die wiederum die Expression von Knochen-verwandte Proteine ​​erhöhen ( . zB Osteocalcin, Sclerostin und alkalische Phosphatase) in den Gefäßen , die Verkalkung vermitteln 28-30 Wir und andere haben gezeigt , dass die Gefäßverkalkung in ApoE beobachtet - / - und LDLR - / - Mäuse eine fettreiche Ernährung und die spontane gefüttert Gefäß beobachtet Verkalkung in MGP - / - Mäuse hängen alle von Knochen - morphogenetischen Protein (BMP) signaling, und es ist dieser Weg, der hier konzentriert. 11,25,31 BMPs sind potente osteogenen Faktoren für die Knochenbildung erforderlich ist, und sind dafür bekannt , eine erhöhte Expression in humanen Atherosklerose zu zeigen. 32-34 In vitro Studien haben impliziert BMP - Signalgebung bei der Regulierung die Expression von osteogenen Faktoren wie Runx2. 35-37 Überexpression des BMP - Liganden, BMP-2, beschleunigt die Entwicklung von Gefäßverkalkung in ApoE-defiziente Mäuse eine fettreiche Diät gefüttert. 38 darüber hinaus die Verwendung von spezifischen BMP - signal~~POS=TRUNC Inhibitoren, als LDN-193189 (LDN) 39,40 und / oder ALK3-Fc verhindert die Entwicklung von Gefäßverkalkungen in beiden LDLR - / - Mäuse eine fettreiche Ernährung und MGP-defizienten Mäusen gefüttert 11,25.

Vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) bei der Entwicklung von Gefäßverkalkung eine kritische Rolle spielen. 30,41,42 der medialen Gefäßverkalkung , die in MGP-defizienten Mäusen entwickelt ist Eigenschaftedurch eine transdifferentiation von VSMCs zu einem osteogenen Phänotyp gekennzeichnet. Der Verlust der MGP führt zu einer verminderten Expression von VSMC Markern einschließlich myocardin und alpha Glattmuskelaktin, mit einer damit einhergehenden Anstieg der osteogenen Marker wie Runx2 und Osteopontin. Diese Veränderungen stimmen mit der Entwicklung von Gefäßverkalkung. 25,43,44

Aorten - Verkalkung und Entzündung bei Mäusen typischerweise beurteilt werden für frühe Verkalkung histochemischen Techniken wie alkalische Phosphatase - Aktivität unter Verwendung von und die osteogene Aktivität, von Kossa und Alizarin - Rot - Färbung für späte Verkalkung, und immunhistochemische Protokolle , die Makrophagen - Proteinmarker Ziel (z. B. CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 jedoch erfordern diese Standard - Bildgebungstechniken Verarbeitung von Aorten Gewebe in Querschnitten, die zeitaufwendig und unvollständig aufgrund Probenahme Vorspannung und sind begrenzt in ihrer Fähigkeit, Entzündung und calcificat zu quantifizierenIons in der gesamten Aorta. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung und ganzen Aorten und mittleren Arterienverkalkung und Makrophagen - Akkumulation quantifizieren Verwendung Nah-Infrarot - Fluoreszenz (NIR) molekulare Bildgebung ex vivo. Auch ein Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären Aorten VSMCs von Mäusen zur Verfügung gestellt ist und die Induktion der Verkalkung von murinen und humanen VSMCs in vitro , um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Gefäßverkalkung zu bestimmen. Diese Techniken bieten die Ermittler mit in vivo und in vitro - Methoden für atherocalcific Krankheit zu studieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle Studien mit Mäusen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Gehäuse und alle Verfahren an Mäusen in dieser Studie beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Komitees vom Massachusetts General Hospital (Unterausschuss für Forschung Animal Care) zugelassen. Alle Verfahren wurden mit Sorgfalt durchgeführt Leiden zu minimieren.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging von Whole Aorten
    Hinweis: a . Bisphosphonat-derived, Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Bildgebung Sonde verwendet werden , können durch Bindung an Hydroxyapatit osteogene Aktivität in den Gefäßen zu markieren 46,47 A Cathepsin-aktivierte Fluoreszenz - Imaging - Sonde kann für Makrophagen proteolytischen und elastolytische Aktivität als Marker dienen in das Gefäßsystem. 9 die gleichzeitige Verwendung beider Fluoreszenzsonden zu ermöglichen, ist es wichtig ,zu verwenden, Sonden, die spektral verschieden sind. Die Notation Kalzium NIR wird die Verkalkung spezifische Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Sonde und Cathepsin NIR, um anzuzeigen, die Cathepsin tätigkeitsspezifischen Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Sonde, um anzuzeigen, verwendet werden.
    1. Bereiten Sie die Lösungen von Calcium NIR und Cathepsin NIR. mit 24 nmol Kalzium NIR oder Cathepsin NIR und leicht schütteln Wie pro Protokolle des Herstellers 1,2 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in das Fläschchen hinzuzufügen.
      Anmerkung: Nach Angaben des Herstellers, einmal mit PBS rekonstituiert, bleiben die Calcium NIR und Cathepsin NIR Lösungen für 14 Tage stabil, wenn sie im Dunkeln bei 2-8 ° C gelagert.
  2. Isolation und Verkalkung von Murine Aortic VSMCs
    1. Aortic Aufschlußlösung:
      1. Eine frische Lösung (~ 3-5 ml pro Aorta geerntet) mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), enthaltend 175 U / ml Typ-2-Kollagenase und 1,25 U / ml Elastase. Sterilisieren Sie die Lösung with ein 0,22 um Vakuum-driven-Filtersystem und halten Sie die Lösung auf Eis bis zum Gebrauch.
    2. Zellmedien:
      1. Supplement 500 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Erwärmen die Medien auf 37 ° C vor der Verwendung.
    3. Verkalkungen Medium:
      1. Verkalkungen Medien A (NAPHOS, in Maus-Zelllinien verwendet werden):
        1. Ergänzung 100-500 ml DMEM (Volumen nach Bedarf) mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Natriumphosphat, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Erwärmen die Medien auf 37 ° C vor der Verwendung.

          ODER
      2. Verkalkungen Medien B (βGP / asc / DEX, verwendet entweder Maus oder menschlichen Zelllinien):
        1. Ergänzung 100-500 ml DMEM (Volumen nach Bedarf) mit 10% fötalem Rinderserum, 10 mM β-Glycerophosphat Dinatriumsalz, 50 ug / ml L-Ascorbinsäure, 10nM Dexamethason, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Erwärmen die Medien auf 37 ° C vor der Verwendung.

2. Schwanzveneninjektion

  1. Vor dem Schwanz Injektion, erwärmen Sie die Mäuse unter einer milden Wärmelampe für 5 min.
  2. Begrenze die Maus in einem Rohr Nagetier Halter. Desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer.
  3. Nutzen Sie eine 30 G-Nadel für Schwanzveneninjektion. Schwanzvenen sind seitlich angeordnet.
    1. Anwenden eines sanften Betrag der Vorwärtsdruck auf die Spritze, wenn die Nadel in die Schwanzvene vorgeschoben wird. Die Vene wird zugegriffen, wenn der Widerstand der Injektion nicht mehr vorhanden ist.
    2. Spritzen mit einem Volumen von 100 ul Calcium-NIR und / oder 100 & mgr; l von Cathepsin NIR mit einer konstanten Rate. Am Ende der Einspritzung nach einer 5 Sekunden Pause, ziehen Sie die Nadel.
  4. Ernten Sie die Aorten (siehe Abschnitt 3) 3-24 Stunden nach der Injektion.

3. Maus Dissection

  • Euthanize Maus mit 200 mg / kg intraperitoneal mit Pentobarbital-Injektion.
  • Legen Sie das Tier liegt auf dem Rücken der Dissektion Bord und zu stabilisieren, indem jeder Pfote auf dem Brett Taping. Mit einem Binokular und eine kleine Schere, machen einen Einschnitt Mittellinie vom Unterbauch auf den oberen Brustkorb verläuft.
  • Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette zurück und das Peritoneum zu entfernen, die Bauchorgane enthüllt. Entfernen Sie die Magen-Darm-Organe, dabei nicht die Aorta transect.
  • Machen Sie einen seitlichen Einschnitt in der vorderen Membran und weiterhin den Schnitt über den Bauch. Mit Dissektion Schere, lassen Sie die ribcage, indem es durch die Seiten der Rippen schneiden und das weiche Gewebe verwachsen dem oberen Teil des Brustbeins zu entfernen. Entfernen Sie den Brustkorb und enthüllt die Lunge.
  • Lassen Sie das Herz an Ort und Stelle nach dem (zu Hilfe bei der Identifizierung und der proximalen Aorta seziert) und vorsichtig in die Lunge zu entfernen. Entfernen Sie den Thymus, Luftröhre, Speiseröhre und mit Sorgfalt, ensuring, dass die Aorta intakt bleibt.
  • Mit gerade feinen Pinzette und Mikro-Präparierscheren, entfernen Sie das weiche Gewebe der Aorta aus dem Becken Gabelung zu den Aortenbogen umgibt, achten Sie dabei besonders , wenn die peri-Aorten - Fett (Abbildung 1A) zu entfernen. Entfernen Sie die restlichen Fett und Weichgewebe , die großen Zweige des Aortenbogen umgebenden (dh brachiocephalic, A. carotis communis und subclavia, 1B).
    Hinweis: Es ist wichtig, das Fett aus der Aorta zu entfernen, weil Fett das Hintergrundsignal erhöhen kann, wenn Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt wird.
  • Entfernen Sie das Herz aus der Brusthöhle, vorsichtig von der proximalen Aorta Abnehmen und entsorgen. TRANSECT die distale Aorta an der iliakalen Bifurkation. Verwendung eines Insulin-Nadel injizieren normaler Kochsalzlösung in die Aorta vom Aortenbogen verbleibenden Blutzellen auszuwaschen. Nehmen Sie die Aorta zusammen mit den Aortenbogen Gefäße, sie vollständig zu entfernenaus dem Körper.
  • Legen Sie die Aorta in normaler Kochsalzlösung auf Eis, bis sie bereit für die Bildgebung.
  • 4. Aorten Imaging

    1. Bild Aorten ex vivo unmittelbar nach der Ernte durch Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Reflexions Bildgebung. 25
      1. Stellen Sie die Fluoreszenz - Imager an den entsprechenden mehrkanaligen Wellenlängen Fluoreszenzsignalintensitäten aus den Aorten von Calcium NIR und Cathepsin NIR-injizierten Mäusen zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben. 25 nach Angaben des Herstellers, Calcium NIR mit von ~ 650-678 nm Licht angeregt werden , eine maximale Emission im ~ 680-700 nm-Bereich. Cathepsin NIR kann durch ~ 745-750 nm Licht mit einer maximalen Emission bei ~ 770 nm angeregt werden.

    5. Isolierung von primären Murine Aortic glatten Gefäßmuskelzellen

    1. Die Schritte 3,1-3,7, wie oben beschrieben.
    2. Legen Sie die Aorten in kaltem HBSS, bis die Dissektionen abgeschlossen sind. Schneiden Sie vorsichtig jede rem wegaining periaortalen Fett und Weichgewebe, nur die Aorta zu verlassen.
    3. Unter einer sterilen Gewebekultur Kapuze, übertragen Sie die Aorten auf die Aortic Aufschlußlösung in 35 mm x 10 mm Gewebekulturschalen. Platz in einem Inkubator bei 37 ° C für 30 min unter leichtem intermittierenden rocking. Nach der Verdauung zeigen die Aorten eine gestreckte oder ausgefransten Aussehen.
    4. Mit dem Präpariermikroskop und einer sterilen Pinzette entfernen Sie die äußere Adventitialschicht der Aorta, während die Mittelschicht intakt zu halten. Eine Technik für die Adventitia zu entfernen, ist die äußere Schicht der Aorta an einem Ende abzulösen und entfernen Sie sie von der darunter liegenden Mittelschicht wie eine Socke wieder abgezogen werden konnte und entfernt.
    5. Sobald die Adventitialschicht entfernt wurde, legen Sie die restlichen Aorta in eine neue Gewebekulturschale mit Zellkulturmedien und lagern bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2-4 Std.
    6. Unter einer sterilen Haube und mit sterilen 3 mm Mikro-Dissektion Schere, schneiden Sie die Aorta in 1-2 mm breitRinge.
    7. Zeigen diese Ringe in einer neuen Gewebekulturschale mit Aortic Aufschlußlösung und Inkubation bei 37 ° C unter sanftem intermittierende für 120 min rocking. Pipette, um die Lösung nach oben und unten mehrere Male während dieser Inkubation Zellen erneut zu suspendieren.
    8. 5 ml warmem Zellkulturmedium zu der Aufschlußlösung und in ein 15 ml konischen Röhrchen.
    9. Zentrifuge das Röhrchen 5 min bei 200 x g.
    10. Anzusaugen , die Medien und resuspendieren Zellen in dem gewünschten Volumen von Zellkulturmedien (beispielsweise 5 ml).
    11. Platte die gesamte Menge von isolierten Zellen aus jeder Aorta in eine 25 cm 2 Zellkulturflasche und inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2. Propagieren Zellen unter Verwendung von Standardtechniken, wie zuvor beschrieben. 25,48 In den ersten 7-10 Tagen Inkubation verändern die Medien jeden 72-96 Stunden. Da die Zellen Konfluenz nähern, wieder aufzufüllen Medien häufiger (alle 48 h).
      Hinweis: Es kann viele Wochen dauern, um eine ausreichende qua wachsenntity von Zellen.
    12. Sobald konfluent, passage Zellen mit Trypsin , das auf 37 ° C erwärmt.
      1. In 0,5-1,0 ml Trypsin zu jeder Kulturflasche und Inkubation für 3-5 min; sanft tippen Sie auf die Seite des Kolbens alle 30-60 sec nach Bedarf Zellen von der Oberfläche zu lösen.
      2. Sobald die Zellen vom Boden des Kolbens zu lösen, 10 ml Zellmedium zu den Zellen in Trypsin. Zentrifugieren der Zellen bei 200 xg für 5 min. Aspirieren die Medien und Trypsin aus dem Zellpellet. Resuspendieren der Zellen in der gewünschten Menge an frischen Zellmedien (beispielsweise 5-10 ml) aufnehmen und in einen neuen Kolben (mit einigen zu einer Kammer Träger übertragen Zellen).
    13. Bei der ersten Passage von Zellen, bestätigen die glatte Muskelzelllinie mit Standardtechniken Immunzytochemie, wie zuvor beschrieben, 49 unter Verwendung eines Antikörpers gegen α-smooth muscle actin.

    6. Inducing Verkalkung von Cultured glatten MuskulaturZellen

    1. Platten Zellen von 5,12 in einer 6-Well-Format erhalten. Hinweis: Ab 1 x 10 5 Zellen / Well in einem Gesamtvolumen von 2,0 ml Zellmedium pro Well empfohlen.
    2. Lassen Sie Zellen in Kalzifizierung Medien A oder B für mindestens 7 Tage in einer 6-Well-Plattenformat zu wachsen. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2.
    3. Ändern Zellmedien alle 48 Stunden.

    7. Beurteilung der VSMC Verkalkungen Mit der von Kossa Färbemethode

    . Hinweis: Der von Kossa Verfahren zum Messen extrazellulären Matrix Kalzifizierung von Geweben oder kultivierten Zellen beruht auf der Substitution des Phosphat-gebundenen Calciumionen mit Silberionen 50 In Gegenwart von Licht und organischen Verbindungen, die Silberionen reduziert und als metallisches visualisiert Silber. Jegliches nicht umgesetztes Silber wird durch Behandlung mit Natriumthiosulfat entfernt 50 Das Protokoll für die von Kossa - Färbung ist wie folgt.:

    1. Absaugen Medien von Zelle culture Platten.
    2. Fix-Zellen, indem sie in 1 ml 10% iges Formalin bei Raumtemperatur für 20 min platziert.
    3. Entfernen Sie die Formalin und waschen Sie die fixierten Zellen mit destilliertem Wasser für 5 min.
    4. Inkubieren Zellen in 1 ml 5% Silbernitratlösung unter einem 60-100-W-Glühlampe für 1-2 Std.
    5. Saugen Sie das Silbernitratlösung und Waschen mit destilliertem Wasser für 5 min.
    6. Entfernen nicht umgesetzten Silber durch die Zellen in 1 ml von 5% Natriumthiosulfat Plazieren (w / v) Lösung in destilliertem Wasser für 5 min.
    7. Spülen Zellen mit destilliertem Wasser für 5 min. Wiederholen Sie wäscht 3x. Die von Kossa-Färbung ist für die Bildgebung mit Standard-invertierte Lichtmikroskopie bereit.
    8. Optionaler Schritt: Gegenfärbung mit 1 ml Kernechtrot für 5 min. Folgen Sie dieser mit drei Waschungen mit destilliertem Wasser (jeweils 5 min).

    ODER

    8. Beurteilung der VSMC Verkalkungen mit Near-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging

    Anmerkung: Ähnliche seiner FähigkeitVerkalkungen innerhalb Maus Aorten, Calcium NIR bindet leicht calcific mineral abgeschieden durch gezüchtete Zellen zu identifizieren. Unter Verwendung dieser Technik Fluoreszenzmikroskopie und Plattenleser mit langen Wellenlängenfiltern Bild kann und in vitro Kalzifizierung quantifizieren, respectively. Die langwellige Emission des Calcium NIR ermöglicht die gleichzeitige Nutzung der niedrigeren Wellenlänge emittierenden Fluorophore andere Merkmale zu erkennen. Das Protokoll für Calcium NIR-Färbung ist wie folgt:

    1. Wie in Abschnitt 1.1.1 beschrieben, mit 24 nmol Kalzium NIR 1,2 ml 1x PBS in das Fläschchen hinzuzufügen.
    2. Man verdünnt das Calcium NIR Lager 1: 100 in den entsprechenden Verkalkung oder Kontrollmedien.
    3. Absaugen Zellmedien aus Kulturplatten und ersetzen mit dem Calcium-Kulturmedien-NIR enthält.
    4. Inkubieren der Kulturplatten mit Calcium NIR Medien über Nacht bei 37 ° C.
    5. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit PBS.
      Hinweis: An dieser Stelledas ursprüngliche Kulturmedium kann in die Vertiefungen gegeben werden, und die Zellen können lebende abgebildet werden. Andernfalls gehen Sie auf die folgenden Schritte aus.
    6. Fix-Zellen, indem sie in 1 ml 10% iges Formalin bei Raumtemperatur für 20 min platziert.
    7. Entfernen Sie die Formalin und waschen Sie die fixierten Zellen mit destilliertem Wasser für 5 min. Wiederholen Sie wäscht 3x.
    8. Optionaler Schritt:. Führen Sie Immunfluoreszenzanfärbung oder andere Gegenfarben für Proteine ​​von Interesse 8,9
    9. Bild oder detektieren die Calcium NIR stain geeignete Fluoreszenzanregungswellenlängen und Emissionsfiltern (~ 680-700 nm) (zB NIR Calcium kann durch 650-678 nm Licht angeregt werden).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Aortic Kalzifizierung in MGP - / - und Wildtyp - Mäusen wurde unter Verwendung von Imaging von Calcium NIR Fluoreszenz gemessen. Kein Calcium NIR - Signal wurde in den Aorten von Wildtyp - Mäusen, was das Fehlen von Verkalkungen (Abbildung 2) nachgewiesen. Ein starkes Kalzium NIR-Signal wurde in den Aorten von MGP-defizienten Mäusen nachgewiesen, die mit fortgeschrittenen Gefäßverkalkung im Einklang steht. Gewebeschnitte von Aorten von Wildtyp und MGP - / - Mäuse wurden gefärbt mit Alizarin Rot 25 (3A - B), die umfangreiche Gefäßverkalkung in MGP-defiziente Mäuse ohne in Wildtyp - Mäusen nachgewiesen Verkalkung beobachtet bestätigt. Um festzustellen , ob die mit MGP - Mangel assoziiert Gefäßverkalkung ist abhängig von BMP - Signalisierung, MGP - / - Mäuse wurden mit LDN behandelt, ALK3-Fc oder Fahrzeug ab Tag 1 des Lebens. Diese Mäuse wurden mit Calcium NIR am Tag injiziert 27 undAorten wurden am folgenden Tag geerntet. Pharmakologische Hemmung der BMP - Signalgebung aortic Verkalkungs mit Calcium NIR (Abbildung 2) detektiert reduziert. Ähnlich wie bei den Ergebnissen mit Calcium NIR, den Aorten von LDN- und ALK3-Fc-behandelten MGP - / - Mäusen hatten Alizarin Rot - Färbung für Calcium reduziert , im Vergleich zu mit Vehikel behandelten MGP - / - Mäuse (3B - D). Diese Ergebnisse zeigen an, dass BMP - Signalgebung für die Gefäßverkalkung erforderlich ist in MGP beobachtet - / - Mäusen.

    LDLR - / - Mäuse gefüttert eine fettreiche Ernährung sowohl Makrophagen - Entzündung und Verkalkung der Wand arteriellen entwickeln 11 Simultaneous Schwanzveneninjektion von calcific und Cathepsin spezifische NIR - Sonden in MGP -. / - Mäusen durchgeführt wurde , wenn die Gefäßverkalkung von MGP , um zu bestimmen -deficiency mit Makrophagen - Akkumulation 25 zugeordnet LDLR -. / - Mäuse verfütterteine fettreiche Ernährung und Wildtyp-Mäuse wurden als positive und negative Kontrollen verwendet wurden. Aorten von Wildtyp - Mäusen zeigten praktisch keine Calcium NIR oder Cathepsin NIR - Signal, wie (4A) erwartet. Co-lokalisierten Kalzium NIR und Cathepsin NIR Signale, die den Aortenbogen Region begünstigt wurden in der LDLR beobachtet - / - Mäuse, eine starke Assoziation zwischen Makrophageninfiltration und Gefäßverkalkungen in diesem Modell der Intima Atherosklerose anzeigt. / - - Obwohl eine diffuse und starke Calcium - NIR - Signal in den Aorten von MGP beobachtet wurde Mäusen war das Cathepsin NIR - Signal nicht verschieden von der Wildtyp - Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Gefäßverkalkung in MGP Defizienz in Abwesenheit von Makrophagenakkumulation auftritt. Um zu bestätigen , weiter diese Erkenntnisse, Aorten von Wildtyp, MGP - / - und das LDLR - / - Mäuse wurden geerntet, geschnitten und gefärbt mit einem Antikörper , der spezifisch für den Makrophagen - Marker MAC-2 ( - / - Mäuse zeigten reichlich MAC-2 - Färbung; es gab keine nachweisbare MAC-2 - Färbung in den Aorten von MGP - / - Mäuse, die Abwesenheit von vaskulären Makrophagen anzeigt.

    Um Gefäßverkalkung in vitro, Aorten - VSMCs wurden isoliert aus Wildtyp und MGP Modell - / - Mäuse und kultiviert in hochphosphathaltigen Medien, unter Verwendung der oben beschriebenen Protokoll. Um die Rolle von MGP in Modulieren Kalzifizierung von kultivierten VSMCs, ein Adenovirus exprimieren MGP (Ad.MGP) bestimmen , wurde verwendet MGP wiederherzustellen in aortic VSMCs von MGP - / - Mäusen. MGP-defizienten VSMCs mit einem Adenovirus infiziert exprimierenden grün fluoreszierendes Protein (Ad.GFP) wurden als Kontrolle verwendet. Darüber hinaus die Wirkung des Entfernens von MGP Expression von VSMCs auf nachfolgende Verkalkung, Aorten-VSMCs von Wildtyp-Mäusen zu bestimmen, wurden mit siRNA gegen MGP (siMGP) gerichtet behandelt oder siRNA-Steuerung (sisc). Kalzifizierung wurde 7 Tage lang durch das Wachstum der Zellen in Kalzifizierung Medien A in kultivierten VSMCs induziert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und gefärbt für Kalzium, die von Kossa-Methode. Restaurierung von MGP mit Ad.MGP reduziert Verkalkung von MGP - / - VSMCs im Vergleich zu Kontroll - Adenovirus-behandelten Zellen (5A - B, E). Die Behandlung von Wildtyp - Aorten - VSMCs mit siMGP, was zu> 95% Zuschlag von MGP Ausdruck, um 25 Verkalkung im Vergleich zu sisc behandelten Zellen (5C - D, F). Diese Ergebnisse zeigen , dass diese in vitro - Modell der VSMC Verkalkung ahmt die Befunde in MGP-defizienten Mäusen und zeigt , dass MGP Verkalkung von gezüchteten VSMCs moduliert.

    Eine alternative Methode Verkalkung von kultivierten VSMCs ist mit Calcium NIR zu detektieren. Gefäßverkalkung in v Zur Modellierung ITRO, menschliche VSMCs Koronararterie wurden gekauft und kultiviert für 21 Tage in Kalzifizierung Medien B. Nach der Behandlungszeit wurde Verkalkung identifiziert das Kalzium NIR - Methode und die Kulturen wurden mit einem benutzerdefinierten grün fluoreszierenden Kollagen Sonde 51 und Hoechst - Farbstoff counterstained (1 & mgr; g / ml für 5 min nach der Fixierung in 10% Formalin) (Abbildung 6). VSMC Kerne wurden mit Hoechst blaue Fluoreszenz durch konfokale Mikroskopie (6A) beobachtet. Eine repräsentative optische Abschnitt zeigt Calcium NIR-gefärbten calcific Mineral in der Kollagenmatrix durch die VSMCs (6B) hergestellt. Dreidimensionale Rekonstruktionen von optischen z-Stapel veranschaulichen die in Kultur geschaffen Schichten wie die VSMCs auf dem Boden der Vertiefung eine Kollagenmatrix herzustellen , bei dem das abgeschiedene calcific mineral eingeschlossen wird (6C - D).

    re 1 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    Abb . 1: Repräsentative Dissection eines Aorta aus einer Wildtyp - Maus (A) Ein Bild von der Brust- und Bauch zur gemeinsamen Beckenarterie Gabelung erstreckt Aorta wird nach dem Entfernen der darüber liegenden Organe und peri-Aorten - Fett dargestellt. (B) Eine konzentrierte Blick auf den Aortenbogen mit dem brachiocephalic, links A. carotis communis und linken Schlüsselbeinarterien. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2: Gefäßverkalkung in MGP - / - Mäusen ist abhängig von BMP - Signal MGP - / - Mäuse wurden mit intraperitoneale behandelt (ip) Injektionen von entweder fünf. zeugs, LDN-193189 (LDN, 2,5 mg / kg / Tag) oder ALK3-Fc (2 mg / kg jeden zweiten Tag) und Wildtyp-Mäusen wurden beginnend am Tag 1 des Lebens bis zum Tag 28 mit ip-Injektionen von Fahrzeug behandelt . Am Tag 27 wurden die Mäuse mit Calcium NIR über die Schwanzvene injiziert. Aorten wurden am Tag 28 geerntet und mit Nahinfrarot-Fluoreszenz abgebildet. Bilder sind bei gleicher Vergrößerung in allen vier Platten mit der Skalenleiste anzeigt 3 mm. Wildtyp - Maus Aorten hat zeigen Kalzium NIR - Signal nicht während Aorten von MGP - / - Mäuse eine starke Calcium NIR - Signal hatte. Im Vergleich zu Vehikel-behandelten MGP - / - Mäuse, die Aorten von MGP - / - Mäusen , behandelt mit entweder LDN oder ALK3-Fc zeigten Calcium NIR Signale erheblich reduziert. Diese Zahl wird von Referenz genommen 25. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    3 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Abbildung 3: Pharmakologische Hemmung der BMP - Signalgebung Verhindert Aortic Kalzifikation in MGP-defizienten Mäusen Wildtyp - Mäuse wurden mit ip Injektionen von Vehikel - behandelten (A) und MGP - / - Mäuse wurden entweder mit ip Injektionen von Vehikel - behandelten (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / Tag) oder ALK3-Fc (D, 2 mg / kg jeden zweiten Tag) , beginnend am Tag 1 des Lebens bis zum Tag 28. Die Aorten wurden geerntet, geschnitten und gefärbt für Calcium mit Alizarin rot. Die Bilder wurden bei gleicher Vergrößerung in allen vier Platten mit dem Maßstab genommen anzeigt 400 & mgr; m. Ähnlich den Calcium - NIR - Signale in Figur 2 veranschaulicht , die Alizarin - Rot - Färbung eine schwere Belastung der Verkalkung in den Aorten der mit Vehikel behandelten MGP - / - Mäusen. Kalzifizierung verringert wird in den Aorten von LDN- und ALK3-Fc-behandelten MGP - / - Mäusen. Diese Zahl wird genommen ausReferenz 25. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    . Abbildung 4: Simultane Bestimmung von Aortic Kalzifizierung und Makrophagen - Infiltration mit Calcium NIR und Cathepsin NIR (A) Wildtyp, MGP - / - und das LDLR - / - Mäuse eine fettreiche Diät gefüttert wurden mit Calcium NIR und Cathepsin NIR injiziert über Schwanzveneninjektion. Aorten wurden 24 Stunden später geerntet und mit Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung beurteilt. Die Bilder sind bei gleicher Vergrößerung mit der Skalenleiste anzeigt, 3 mm. Wildtyp-Mäuse zeigen praktisch keine Aorten Verkalkung oder Makrophagen-Präsenz. Die Aorten von LDLR - / - Mäuse haben umfangreiche Verkalkung , die mit Makrophagen - Akkumulation co-lokalisiert. Im Gegensatz dazu MGP - / - Mäusen haben aortic Verkalkung , die bei Abwesenheit von Makrophagen - Infiltration erfolgt. (B) Aorten von Wildtyp geerntet wurden, MGP - / - und das LDLR - / - Mäuse gefüttert eine fettreiche Ernährung. Diese Aorten wurden geschnitten und gefärbt für Makrophagen, die mit einem Antikörper, der spezifisch für MAC-2. Die Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Die luminale Fläche ist nach rechts in jeder Tafel. Bilder wurden bei gleicher Vergrößerung in allen drei Tafeln mit der Skalenleiste aufgenommen anzeigt 100 um. Ähnlich wie bei den Ergebnissen in (A), gab es keine Anzeichen von Makrophagenakkumulation in den Aorten von MGP - / - Mäusen. Diese Figur ist eine modifizierte Version einer Figur aus Referenz 25. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    .jpg "/>
    . Abbildung 5: - / - MGP schützt Cultured VSMCs von Verkalkungen Cultured aortic VSMCs wurden aus MGP isoliert Mäusen und infiziert mit Adenovirus entweder GFP (A) oder MGP (B) exprimieren. Aortic VSMCs isoliert von Wildtyp - Mäusen wurden entweder mit Kontrolle transfiziert verschlüsselten siRNA (C) oder siRNA Targeting MGP (D). Die Zellen wurden für 7 Tage in Kalzifizierung Medien A gezüchtet und anschließend fixiert und mit von Kossa. (- D A) mit der Maßstabsleiste anzeigt 200 um Bilder wurden bei gleicher Vergrößerung in allen vier Platten gemacht. Seriensichtfelder wurden für Calcium - Färbung fotografiert und quantifiziert Bild J Software nach Untergrundsubtraktion (E und F), mit Fehlerbalken anzeigt , SEM. Diese Figur ist eine modifizierte Version einer Figur aus Referenz 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 6
    Abbildung 6:. Calcium NIR Identifiziert Verkalkungen in Verbindung mit der extrazellulären Matrix in vitro (A) Menschliche Koronararterie VSMCs kultiviert in Kalzifizierung Medien B für 21 Tage durch Kernfärbung mit Hoechst - Farbstoff identifiziert wurden. (B) ein optischer Abschnitt durch konfokale Mikroskopie von Calcium NIR - Färbung (rot) , erhalten in Kombination mit einem grün fluoreszierenden Sonde zeigt Kollagen calcific mineral ganzen Kollagenmatrix. Bilder A - B wurden bei gleicher Vergrößerung mit dem Maßstab genommen angibt , 10 & mgr; m. (C und D) Dreidimensionale Rekonstruktionen zeigen das Einschließen von calcific mineral innerhalb ter Kollagenmatrix. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Arterienverkalkung ist ein wichtiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen bei Menschen und kann direkt an der Pathogenese von kardiovaskulären Ereignissen beitragen. 1,5,52 Intimale Kalkablagerung in den dünnen faserigen Kappen von atherosklerotischen Erkrankungen vorgeschlagen lokalen biomechanischen Stress zu erhöhen und dazu beitragen, Plaque - Bruch. 53,54 Medial Verkalkung Auswirkungen der klinischen Ergebnisse durch arterielle Steifigkeit zu erhöhen, was Herzhypertrophie induzieren kann und die Herzfunktion 55 Daher beeinflussen., die molekularen Mechanismen zu verstehen , die Gefäßverkalkung zu Grunde liegen werden wichtige Einsichten in die menschliche Krankheit zur Verfügung stellen und möglicherweise neue Targets identifizieren Therapie.

    Hier wird ein Verfahren zur Detektion aortic Verkalkung und Makrophagenakkumulation in murinen Modellen von Atherosklerose und Gefäßverkalkung Verwendung NIRF Bildgebung beschrieben. 9 ist es entscheidend , um genau die NIR injizierenF Mittel in die Schwanzvene. Dies ist eine Technik , die signifikante Praxis erfordert , bevor Beherrschung erreicht wird. 56 Außerdem ist es wichtig , alle der peri-Aorten - Fett aus der Aorta zu entfernen, da dieses Fett ein autofluoreszierendes Signal bei der gleichen Wellenlänge wie das Calcium NIR verursachen und Cathepsin NIR-Signale. Die Verwendung von NIRF Mittel hat viele wichtige Vorteile gegenüber Standard-histologischen Methoden der Gefäßverkalkung und Entzündung zu beurteilen. Im Gegensatz zu herkömmlichen histologischen Techniken erlauben diese Agenten die Quantifizierung der gesamten aortic Verkalkung und Makrophageninfiltration. Darüber hinaus bieten sie eine empfindlichere Verfahren für die Entwicklung von Aorten Verkalkung als histologische Anfärbung assoziiert frühe Veränderungen erfassen und daher mechanistische Einblicke in früheren Stadien der Erkrankung bieten. 9 Seiten des frühen Calcium NIR - Signals mit Markern der Knochenbildung assoziiert erhöht einschließlich alkalische Phosphatase-Aktivität als well als Runx2 und Osteopontin Genexpression. Darüber hinaus ermöglicht die gleichzeitige Verwendung von spektral verschiedenen Sonden zur Verkalkung und Cathepsin Aktivität Quantifizierung und Assoziation des räumlich - zeitlichen Verlauf beider atheromatous und calcific Krankheit. 9

    Die Ermittlung der räumlichen und zeitlichen Eigenschaften der Gefäßverkalkung und Entzündungen hilft bei unserem Verständnis der zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen von Gefäßerkrankungen. Zum Beispiel wurde die Verwendung von NIRF Mittel gezeigt , dass in Modellen der Intima Verkalkung (ApoE - / - und LDLR - / - Mäuse auf einer fettreichen Diät), vaskulärer Verkalkung co-lokalisiert auf Seiten der Makrophagenakkumulation (Abbildung 4) und dass Verkalkung folgt die Akkumulation von Makrophagen zeitlich. 9,11 Interessanterweise keine Makrophagen - Akkumulation mit Cathepsin NIR wurde in der medialen Gefäßverkalkung in MGP-defizienten Mäusen gefunden nachgewiesen. 25 Thus, die aus Experimenten NIRF Mittel verwendet wird, kann gefolgert werden, dass, obwohl Makrophagenakkumulation mit vaskulären Intima Verkalkung assoziiert ist, ist es nicht für vaskuläre medial Verkalkungs erforderlich.

    Ähnlich zu seiner Rolle bei der Bildgebung und Gefäßerkrankungen studiert hat NIRF Bildgebung wurde zu studieren Aortenvitien verwendet. 47 Aortenvitien von lipidbeladenen Makrophagen und calcific Läsionen auf dem Ventil markiert und zeigt ähnliche zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und genetischen Determinanten wie Atherosklerose Faltblatt Funktionsstörungen von. 57-59 aortic verursacht Ventil Verkalkung und ist die Hauptursache für die klinische Aortenstenose bei älteren Menschen. Die einzige Behandlung derzeit für symptomatische Aortenklappenstenose ist Klappenersatz. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der Aortenklappe Krankheit ist notwendig, um die späten Phase der klinischen Komplikationen der progressiven Aortenklappe Verkalkung zu verhindern. Verwendung von NIRF - Agenten als molekulare Bildgebung Werkzeuge in Tiermodellen stellt eine empfindliche Methode zur Beurteilung der Aortenklappe Krankheit in seinen frühesten Stadien. 60

    Standardtechniken Koronararterie Plaques haben sich auf die Schwere der Stenose, doch die Mehrheit der akuten Koronarsyndroms von Bruch von nicht-strömungsbegrenzenden Plaques führen zu visualisieren. 6 Biologische Prozesse innerhalb Plaques, wie Entzündungen, dienen als bessere Prädiktoren für Plaque - Bruch als den Grad der Stenose. 61 als herkömmliche Abbildungstechniken gegenüber stellt NIRF Bildgebung Gelegenheit Zellaktivität (dh Makrophagen proteolytische Aktivität mit einer Matrix - Metalloproteinase (MMP) aktivierbare Mittel, proteolytische und elastolytischen Aktivität mit Cathepsin NIR und osteogene Aktivität zu messen , mit Calcium NIR). 9. Dieses Verfahren stellt daher gleichzeitige funktionelle und anatomischer Beurteilung der Herz - Kreislauferkrankungen. NIRF Bildgebung nutzt excitation Wellenlängen im 650-900 nm - Bereich, die den Vorteil einer erhöhten Gewebepenetration im Vergleich zu Licht mit einer niedrigeren Wellenlänge, so dass dadurch eine größere Tiefe Beurteilung der Krankheitsläsionen. 60 gibt auch autofluoreszierenden Hintergrundsignal von Gefäßgewebe in naher reduziert wird -Infrarot Wellenlängenbereich. Obwohl dieses Protokoll auf der Verwendung von NIRF Bildgebung fokussiert ex vivo stellt NIRF Bildgebung auch eine nützliche Plattform für Längs molekularen Bildgebung in vivo. 9 NIRF Bildgebung, wenn sie mit Intravitalmikroskopie kombiniert, zukünftige diagnostische Anwendungen bei Menschen haben können. 61 jedoch eine Beschränkung längs der Bildgebung Calcium NIR ist , dass das Bisphosphonat-abgeleitete Sonde kann sich den physiologischen Prozess der Verkalkung zu verändern. 62

    Kardiovaskuläre Verkalkungen ist ein aktiv geregelt Prozess, der die transdifferentiation von VSMCs zu einem osteogenen Phänotyp beinhaltet. 25,41,42 63 veröffentlicht und hat eine ausreichende Anzahl von Zellen pro murine Aorta erreicht in vitro - Studien (5) durchführen. Eine alternative methode für VSMC Isolation beinhaltet keine enzymatische Verdauung, sondern die direkte Kultur explantierter Aortenringen; Diese Technik wurde berichtet , weniger Zellen als die Technik unter Verwendung von enzymatischem Verdau zu ergeben. 63,64

    Zwei verschiedene Verkalkungs Medien, entweder mit βGP / Asc / DEX 65,66 oder NAPHOS, 25,43 beschrieben , die verwendet werden können , Verkalkung von VSMCs zu induzieren. Beide Arten von Medien verwendet wurden murine VSMCs mit gleichwertigen Erfolg zu verkalken. Während die Verkalkung Medien βGP / Asc enthält / DEX verwendet wurde , menschliche VSMCs (Abbildung 6) zu verkalken, hat die Medien mit NAPHOS nicht in verkalkende menschlichen VSMCs in unserer Erfahrung wirksam. Außerdem 21-28 Tagen Kultur von menschlichen VSMCs in Kalzifikation Medien B erforderlich sein kann, vor Verkalkung festgestellt wird. Verkalkung von Wildtyp - VSMCs in vitro erhöht wurde , wenn die Expressionsniveaus von MGP mit siRNA reduziert wurden und calcificatiauf in MGP reduziert - / - VSMCs bei MGP Ausdruck restauriert wurde (Abbildung 5). Diese Befunde sind konsistent mit der aortischen Verkalkung beobachtet in MGP - / - Mäusen und deuten darauf hin , dass dieses in vitro - Verfahren zur VSMC Verkalkungs dient als nützliches Modell in vivo Verkalkung. Es ist wichtig zu beachten Sie jedoch, dass es Einschränkungen in der Rückschlüsse auf intakten Blutgefäßen aus kultivierten VSMCs Zeichnung. Kultivierte VSMCs können ihre in vivo Kontraktionseigenschaften, insbesondere bei höheren Passagen verlieren, zusätzlich zu den Veränderungen in der Gen - Expressionsmuster zu entwickeln, Morphologie und Steifigkeit. 67-70 VSMCs kultiviert Medien in verkalkende zu einer Osteoblastlinie vor Verkalkung differenzieren, aber nicht weisen eine chondrozytische Zwischen die häufig in vivo beobachtet wird. 71 ist es daher wichtig , dass mechanistische Schlussfolgerungen aus kultivierten Zellen gezogen in in vivo - Systemen validiert werden. Aufe mögliche Methode , um diese Einschränkung zu überwinden , ist VSMCs in ihre in - vivo - Zustand unter Verwendung einer kultivierten intakten Gefäßring zu studieren. 70

    Zwei verschiedene Methoden zum Erfassen Kalzifizierung von kultivierten VSMCs präsentiert, die von Kossa - Verfahren (Figur 5) und Calcium - NIR - Färbung (Abbildung 6). Obwohl häufig zur Verkalkung zu bewerten verwendet, wird der von Kossa - Verfahren ein wenig durch seinen verringerten Spezifität für Calcium Kristalle beschränkt. 50 Calcium NIR Verkalkungs spezifisch sein empfunden und ist besonders vorteilhaft, dass sie mit zusätzlichen spektral unterschiedlichen fluoreszierenden zur gleichzeitigen Färbung ermöglicht Mittel. 9 Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls Calcium NIR mit zusätzlichem molekularen Sonden verwendet wichtige Einblicke in die Mechanismen der Verkalkung bereitstellen und kann die schnelle Beurteilung von kleinen Molekülinhibitoren von VSMC Kalzifizierung in einem Hochdurchsatz Weise ermöglichen, identify mögliche neue Therapien für Gefäßverkalkung.

    Zusammengefasst ist kardiovaskulären Kalzifizierung ein wichtiger Risikofaktor für und potenziellen Beitrag zur klinischen Erkrankung. Kenntnisse über die Mechanismen von kardiovaskulären Verkalkung und atherosklerotischen Erkrankungen beruht auf tierischen und zellbasierte Modelle. Methoden zur Bewertung Kalzifizierung in in vivo, ex vivo und in vitro Modellen sind kritisch unser Verständnis von kardiovaskulären Erkrankungen zu fördern.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103, (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114, (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291, (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47, (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3, (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119, (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116, (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14, (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31, (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96, (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21, (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24, (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142, (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48, (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9, (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17, (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6, (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55, (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65, (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10, (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4, (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25, (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109, (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97, (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107, (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91, (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23, (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586, (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20, (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283, (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199, (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18, (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19, (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104, (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110, (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89, (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67, (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19, (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115, (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56, (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350, (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99, (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12, (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39, (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312, (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368, (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90, (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108, (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101, (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59, (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308, (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49, (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104, (6), 710-711 (2009).
    Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter