Introduction
心血管疾患は、それが毎年78万を超える死者を占める米国をはじめ、世界における罹患率および死亡率の主要な原因である。1冠動脈石灰化と大動脈石灰化は、アテローム性動脈硬化症の特徴であると心血管イベントのような強力な予測因子を提供します。2- 、内膜石灰化アテローム性動脈硬化症と関連しており、内側には、慢性腎臓病と糖尿病に関連する石灰化、（もMönckebergとして知られている）5内膜石灰化は、脂質蓄積とマクロファージの設定で発生します。血管石灰化の4つの主なタイプは、成人で報告されています。血管壁への浸潤。5,6内側側の壁の石灰化は、エラスチン繊維または平滑筋細胞に局在し、脂質沈着やマクロファージの浸潤に関連付けられていない、独立して内膜石灰化の発生。の分子機構に関する研究5,7,8血管石灰化は、細胞ベースおよび動物モデル系に依存していました。 atherocalcific疾患のための齧歯類モデルは、アポリポタンパク質E（アポE）9,10または低密度リポタンパク質受容体（LDLR）中膜石灰化のためのモデルは、行列のGlaタンパク質（MGP）欠損マウスを含むながら11は 、高脂肪食を与えいずれかを欠損したマウスを含みます12またはそれに近い総腎摘出（5/6日の腎摘出モデル）によって、または高アデニン食事療法への曝露のいずれかによって尿毒症を発症ラット。13
ここでは、MGPの欠損に関連する内側血管石灰化のモデルは、に焦点を当てています。 MGPは、動脈石灰化を阻害し、細胞外タンパク質である。MGP遺伝子における12の変異がKeutel症候群、brachytelephalangyに加えて、拡散軟骨石灰化によって特徴づけられるまれなヒト疾患、難聴、および末梢肺動脈狭窄症で同定されている。14-18ではないが、しばしば観察、19複数の動脈の同心円状石灰化がKeutel症候群に記載されている。非カルボキシル化、生物学的に不活性なMGPの高い循環レベルは、心血管死亡率を予測しながら、人間のMGP遺伝子における20の一般的な多型は冠動脈石灰化、21-23リスクの増加と関連している。24人間とは異なり、 Keutel症候群で、MGP欠損マウスは生後2週間で開始自発的な広範囲の動脈石灰化からなる重度の血管の表現型を開発し、原因大動脈破裂に6-8週間出産後に死亡する。12
アポEとは異なり- / -およびLDLR - / -マウスは、高脂肪食を与え、関連マクロファージ誘発性炎症と内膜血管石灰化を開発する、MGP - / - 。マウスは、マクロファージの浸潤が存在しない状態で内側血管石灰化を開発11,25が、これらの知見は、intimに異なる根本的な刺激を示唆していますアルと中膜石灰化は、例えば、腫瘍壊死因子αおよびIL-1およびプロ骨形成因子などの炎症性メディエーターを含む血管石灰化に貢献同定されている石灰化。26、複数のシグナル伝達経路の両方の形式を仲介するシグナル伝達機構で重複がありますこのようなノッチは、Wnt、および骨形成タンパク質（BMP）シグナル。27,28のように、これらのシグナル伝達経路は、次に、骨関連タンパク質の発現を増加させる転写因子ラント関連転写因子2（Runx2の）及びオステリックスの発現を（増加させます- / -およびLDLR - / -マウスは、高脂肪食および自発を与え、例えば石灰化を媒介する血管系において、オステオカルシン、スクレロスチン、およびアルカリホスファターゼ）28-30我々は、他のアポEで観察された血管石灰化のことを実証しましたMGPに観察血管石灰化- / -マウスはすべて、骨形成タンパク質（BMP）SIに依存しますgnaling、それはここに焦点を当てているこの経路である。11,25,31 BMPは、骨形成のために必要な強力な骨形成因子であり、ヒトのアテローム性動脈硬化症で発現増加を示すことが知られている。32-34 in vitro試験を調節におけるBMPシグナル伝達を関与していますなどのRunx2などの骨形成因子の発現。BMPリガンドの35-37過剰発現は、BMP-2は、高脂肪食給餌したApoE欠損マウスにおける血管石灰化の開発を加速。38また、このようなシグナル伝達阻害剤、特定のBMPの使用を39,40 LDN-193189（LDN）として、および/ またはALK3-Fcは、両方のLDLR内の血管石灰化の発症を予防する- / -マウスは、高脂肪食とMGP欠損マウスを与え11,25。
血管平滑筋細胞（VSMC）は、血管石灰化の発展に重要な役割を持っている。MGP欠損マウスに発症30,41,42内側血管石灰化はCHARACです骨形成表現型へのVSMCの分化転換によってterized。このようなRunx2のおよびオステオポンチンなどの骨形成マーカーの同時上昇とミオカルディンおよびα平滑筋アクチンを含むVSMCマーカーの発現低下でMGP結果の損失、。これらの変化は、血管石灰化の発達と一致する。25,43,44
大動脈石灰化と炎症マウスでは、典型的には、早期の石灰化および骨形成活性のためのアルカリホスファターゼ活性などの組織化学的技術を利用して評価され、後半に石灰化のためのフォン・コッサおよびアリザリンレッド染色、およびマクロファージのタンパク質マーカー（ 例えば 、標的免疫組織化学プロトコル。、CD68、F4 / 80、のMac-1、のMac-2 MAC-3）9,45しかし、これらの標準的な画像化技術が原因で、サンプリングの偏りに時間がかかり、不完全である、断面に大動脈組織の処理を必要とし、それらに限定されています炎症とcalcificatを定量する能力全体の大動脈内のイオン。このプロトコルは、ex vivo近赤外蛍光（NIR）分子イメージングを利用した全大動脈および中型動脈石灰化およびマクロファージの蓄積を可視化し、定量化する方法を説明している。また、提供収穫するための方法であるとマウスからの一次大動脈のVSMCを培養し、誘導します血管石灰化の根底にある分子メカニズムを決定するために、マウスおよびインビトロでヒトのVSMCの石灰化。これらの技術は、インビボおよびatherocalcific疾患を研究するためのインビトロ方法で両方で調査員を提供しています。
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Protocol
マウスを用いた研究はすべて国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施しました。住宅この研究で説明したマウスに関連するすべての手続きは、マサチューセッツ総合病院（研究動物管理部会）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。すべての手順は、苦痛を最小限にするために注意して行きました。
試薬の調製
- 全大動脈の近赤外蛍光イメージング
注：ビスホスホネート由来、近赤外蛍光イメージングプローブは、ヒドロキシアパタイトに結合することによって、血管系内の骨形成活性をマークするために使用することができる46,47カテプシン活性化蛍光イメージングプローブは、マクロファージのタンパク質分解とにおける弾性線維溶解性の活性のマーカーとして働くことができます。血管系9の両方の蛍光プローブの同時使用を可能にするために、それが重要ですスペクトル的に別個であるプローブを使用しています。表記カルシウムNIRは、カテプシン活性を特異的近赤外蛍光イメージングプローブを示すために、石灰化に固有の近赤外蛍光イメージングプローブおよびカテプシンNIRを示すために使用されます。- カルシウムNIRおよびカテプシンNIRの溶液を調製します。製造業者のプロトコルに従って、カルシウムNIRまたはカテプシンNIRの24ナノモルを含むバイアルに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1.2ミリリットルを追加し、軽く振ります。
注：2〜8℃で暗所に保存した場合、メーカーによると、一度PBSで再構成し、カルシウムNIRおよびカテプシンNIRソリューションは、14日間安定のままです。
- カルシウムNIRおよびカテプシンNIRの溶液を調製します。製造業者のプロトコルに従って、カルシウムNIRまたはカテプシンNIRの24ナノモルを含むバイアルに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1.2ミリリットルを追加し、軽く振ります。
- 単離とマウス大動脈のVSMCの石灰化
- 大動脈消化ソリューション：
- 175 U / mlの2型コラゲナーゼおよび1.25 U / mlのエラスターゼを含むハンクス液（HBSS）で新鮮な溶液（〜3〜5ミリリットルあたり大動脈収穫）を準備します。液Wを滅菌0.22μmの真空駆動型ろ過システムi番目、使用するまで氷上で解決策を続けます。
- セル・メディア：
- 10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の500ミリリットル、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを補足します。使用前に37℃に媒体を温めます。
- 石灰化メディア：
- 石灰化培地A（NaPhos;マウス細胞株において使用されます）。
- 10％ウシ胎児血清、2 mMリン酸ナトリウム、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを含むDMEM（体積適宜）100〜500ミリリットルを補います。使用前に37℃に媒体を温めます。
OR
- 10％ウシ胎児血清、2 mMリン酸ナトリウム、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを含むDMEM（体積適宜）100〜500ミリリットルを補います。使用前に37℃に媒体を温めます。
- 石灰化メディアB（βGP/ ASC / DEXは、マウスまたはヒト細胞株のいずれかで使用）：
- 10％ウシ胎児血清を含むDMEM（体積適宜）100〜500ミリリットルを補足する、10mMのβグリセロリン酸ナトリウム、50μg/ mlのL-アスコルビン酸、10nMのデキサメタゾン、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシン。使用前に37℃に媒体を温めます。
- 石灰化培地A（NaPhos;マウス細胞株において使用されます）。
- 大動脈消化ソリューション：
2.尾静脈注射
- 尾注射の前に、5分間の穏やかな加熱ランプ下でマウスを温めます。
- チューブげっ歯類ホルダーにマウスを抑えます。アルコール綿棒で尾を消毒します。
- 尾静脈注射のための30 G針を利用します。尾静脈を横方向に配置されています。
- 針が尾内に前進されるように、注射器に前方圧力の穏やかな量を適用します。注射に対する抵抗性がもはや存在したら、静脈がアクセスされていません。
- 安定した速度でカルシウムNIR100μlのおよび/またはカテプシンNIRの100μlの容量を注入します。注射の終わりに、5秒の休止の後、針を撤回。
- 大動脈（セクション3を参照）注射後3-24時間を収穫。
3.マウスの解剖
注：蛍光撮影を行うときに脂肪がバックグラウンドシグナルを増加させることができるので、大動脈から脂肪を除去することが重要です。
4.大動脈イメージング
- すぐ近赤外蛍光反射イメージングによる収穫後の画像大動脈エキソビボ 25
- 製造業者によると25前述のように、カルシウムNIRおよびカテプシンNIR注入マウスの大動脈からの蛍光シグナル強度を定量化するための適切なマルチチャネル波長で蛍光イメージャーを設定し、カルシウムNIRを有する〜650から678 nmの光で励起することができます〜680から700 nmの範囲で最大発光。カテプシンNIRは〜770 nmで最大発光で〜745-750 nmの光で励起することができます。
プライマリマウス大動脈血管平滑筋細胞の単離5.
- 上記のようにステップ3.1から3.7を実行します。
- 解剖が完了するまで冷HBSSで大動脈を置きます。慎重に任意のレムを切り取ります唯一の大動脈を残し、大動脈周囲脂肪や軟部組織をaining。
- 無菌組織培養フードの下で35ミリメートル×、10mmの組織培養皿に大動脈消化溶液に大動脈を転送します。穏やかな断続的に揺り動かしながら30分間、37℃のインキュベーター内に置きます。消化後、大動脈を伸ばしたり擦り切れた外観を呈します。
- 無傷の中間層を維持しながら解剖顕微鏡および滅菌鉗子で、大動脈の外側の外膜層を除去します。外膜を除去するための一つの技術は、一端に大動脈の外側の層をはがすと靴下のような下層の中間層からそれを削除することですバック剥離して除去することができました。
- 外膜層を除去した後、2-4時間、5％CO 2、37℃で細胞培養培地とストアと新しい組織培養皿に残っている大動脈を置きます。
- 無菌フード下で無菌の3ミリメートルの微小解剖ハサミを使用して、幅の広い1〜2ミリメートルに大動脈をカットリング。
- 大動脈消化ソリューションを使用して新しい組織培養皿の中でこれらのリングを置き、120分間穏やかに振動し、断続的に37℃でインキュベートします。細胞を再懸濁するために、このインキュベーションの間を上下に数回ソリューションをピペット。
- 消化液に暖かい細胞培養培地の5ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブに移します。
- 遠心分離機200×gで5分間チューブ。
- 細胞培養培地（ 例えば 、5ミリリットル）の所望の体積にメディアを再懸濁細胞を吸引。
- プレート25cm 2の細胞培養フラスコの各大動脈から単離された細胞の全体の量、5％CO 2、37℃でインキュベートします。インキュベーションの最初の7〜10日の間、25,48。前述したように、標準的な技術を用いて細胞を増殖させる、メディアごとに72〜96時間を変更します。細胞がコンフルエントに近づくにつれ、より頻繁に（48時間ごと）、メディアを補充。
注：これは、十分な資格を成長させるために何週間かかる場合があります細胞のntity。 - コンフルエント後、トリプシンで継代細胞を37℃に加温すること。
- 各培養フラスコにトリプシン0.5〜1.0 mlを加え3-5分間インキュベートします。表面から細胞を剥離するために、必要に応じて静かにすべての30-60秒フラスコの側面をタップします。
- 細胞がフラスコの底から切り離した後、トリプシンで細胞に細胞培地の10ミリリットルを追加します。 5分間、200×gで細胞を遠心。細胞ペレットからメディアおよびトリプシンを吸引。新鮮な細胞培地（ 例えば 5〜10 ml）を所望の量で細胞を再懸濁し、（チャンバースライドに移し、一部の細胞で）新しいフラスコに移します。
- 細胞の最初の継代において、前述のように、標準的な免疫細胞化学技術を用いて平滑筋細胞系統を確認し、49α平滑筋アクチンに対する抗体を用いました。
培養平滑筋の6誘導石灰化細胞
- プレートの細胞を6ウェルフォーマットで5.12から得られます。注：1×10 5細胞/ウェルあたりの細胞培地の2.0ミリリットルの全容量でで開始が推奨されます。
- 細胞を6ウェルプレートフォーマットで少なくとも7日間石灰化メディアAまたはBで成長することを可能にします。 5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。
- 細胞培地を48時間ごとに変更します。
7.フォン・コッサ染色法を用いたVSMC石灰化の評価
注：組織または培養細胞の細胞外マトリックスの石灰化を測定するためのフォン・コッサ法は、銀イオンとリン酸塩結合カルシウムイオンの置換に基づいて50の光及び有機化合物の存在下で、銀イオンが還元され、金属のように可視化されます銀。未反応の銀はチオ硫酸ナトリウムで処理することにより除去し、以下のように、フォン・コッサ染色のための50のプロトコルです。
- セルのCuから培地を吸引ltureプレート。
- 20分間室温で10％ホルマリンの1ミリリットルでそれらを配置することによって細胞を固定。
- ホルマリンを削除し、5分間蒸留水で固定した細胞を洗浄します。
- 1-2時間のための60から100 Wの電球の下で5％硝酸銀溶液1mlで細胞をインキュベートします。
- 硝酸銀溶液を吸引し、5分間蒸留水で洗浄しました。
- 5分間蒸留水中の溶液（w / v）の5％チオ硫酸ナトリウム1mlに細胞を配置することによって、未反応の銀を削除します。
- 5分間蒸留水で細胞を洗浄。繰り返し洗浄を3倍。フォン・コッサ染色は、標準的な倒立光学顕微鏡とイメージングのための準備ができています。
- オプションの手順：5分間の核ファーストレッドの1ミリリットルとの対比。蒸留水で3回洗浄（5分ごと）でこれに従ってください。
OR
8.近赤外蛍光イメージングでVSMC石灰化の評価
注：その能力と同様にマウスの大動脈内の石灰化を識別するために、カルシウムNIRは容易に培養細胞によって堆積石灰化ミネラルをバインドします。長波長フィルタと、この技術、蛍光顕微鏡およびプレートリーダーを使用して画像をそれぞれ、 インビトロでの石灰化を定量化することができます。カルシウムNIRの長波長の発光は、他の特徴を検出するための低波長発光蛍光体の同時利用が可能になります。次のようにカルシウムNIR染色のためのプロトコルは次のとおりです。
- 第1.1.1項で説明したように、カルシウムNIRの24ナノモル含むバイアルに1×PBSの1.2ミリリットルを追加します。
- 適切な石灰化や制御のメディアで100：カルシウムNIRの株式1を希釈します。
- 培養プレートから吸引細胞培地およびカルシウムNIR含有培地と交換してください。
- 一晩37℃でカルシウムNIRメディアと培養プレートをインキュベートします。
- ウェルから培地を吸引除去し、PBSで一回、ウェルを洗浄します。
注：この時点で、元の培養培地をウェルに添加することができ、細胞が生きて画像化することができます。それ以外の場合は、以下の手順に進んでください。 - 20分間室温で10％ホルマリンの1ミリリットルでそれらを配置することによって細胞を固定。
- ホルマリンを削除し、5分間蒸留水で固定した細胞を洗浄します。繰り返し洗浄を3倍。
- オプションの手順：目的のタンパク質のための免疫蛍光染色または他のcounterstainsを実行します8,9。
- 画像または（ 例えば 、カルシウムNIRは、650から678 nmの光で励起することができます）、適切な蛍光励起波長と発光フィルタ（〜680から700 nm）を用いて、カルシウムNIRの汚れを検出。
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Representative Results
- / -大動脈MGPにおける石灰化および野生型マウスは、カルシウムNIR蛍光イメージングを用いて測定しました。いいえカルシウムNIR信号は、石灰化が存在しない（ 図2）を示す、野生型マウス由来の大動脈において検出されませんでした。強力なカルシウムNIR信号が高度な血管石灰化と一致しているMGP欠損マウスからの大動脈で検出されました。野生型からの大動脈の組織切片MGP - / -野生型マウスにおいて検出されない石灰化とMGP欠損マウスで観察された豊富な血管石灰化を確認し、 -マウスはアリザリンレッド25（B 図3A）で染色しました。 MGP欠乏に関連した血管石灰化は、BMPシグナル伝達に依存しているかどうかを判断するには、MGP - / -マウスはLDN、ALK3-Fcで処理した、または車両は人生の1日目に開始しました。これらのマウスは、27日目にカルシウムNIRを注射し、大動脈を翌日回収しました。カルシウムNIR（ 図2）を用いて検出縮小大動脈石灰化をBMPシグナル伝達の薬理学的阻害。カルシウムNIRとの調査結果と同様に、LDN-とALK3-Fc処置MGPの大動脈が- - / -マウス（ 図3B - D）/ -ビヒクル処理MGPと比較した場合、マウスはカルシウムのためのアリザリンレッド染色を減少させていました。 - / -マウスこれらの結果は、BMPシグナリングがMGPに観察血管石灰化のために必要とされることを示します。
LDLR - / - / - -マウスは、MGPに動脈壁のマクロファージ炎症および石灰化の両方を開発石灰およびカテプシン特異NIRプローブ11同時尾静脈注射を、高脂肪食を与えたマウスは、場合MGPの血管石灰化を決定しました-deficiencyは、マクロファージの蓄積に関連付けられている25 LDLR - / -マウスの給餌高脂肪食および野生型マウスを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用しました。予想通り、野生型マウスからの大動脈を（ 図4A）、実質的にカルシウムNIRまたはカテプシンNIR信号を示しませんでした。内膜アテローム性動脈硬化症のこのモデルにおけるマクロファージ浸潤と血管石灰化との間に強い関連性を示す、 - / -マウス大動脈弓の領域に好ま共局在カルシウムNIRおよびカテプシンNIR信号がLDLRで観察されました。 / - -びまん性と強力なカルシウムNIR信号はMGPの大動脈で観察されたが、マウス、カテプシンNIR信号は、野生型マウスのそれと何ら変わりませんでした。これらの知見は、MGP欠乏症における血管石灰化は、マクロファージの蓄積の非存在下で起こることを示しています。さらに、これらの知見を確認するため、野生型からの大動脈は、MGP - / - 、およびLDLR - / -マウスは、回収区画、およびマクロファージマーカーに特異的な抗体で染色したMAC-2（
高リン酸塩は、上記のプロトコルを使用して、メディアを含むことをマウスおよび培養- / - インビトロでの血管石灰化をモデル化するために、大動脈のVSMCは、野生型とMGPから単離しました。 - / -マウス培養したVSMCの石灰化を調節するのにMGPの役割を決定するために、MGPを発現するアデノウイルス（Ad.MGP）はMGPから大動脈たVSMCにMGPを復元するために使用されました。緑色蛍光タンパク質（Ad.GFP）を発現するアデノウイルスに感染MGP欠損たVSMCは、対照として使用しました。また、その後の石灰化のたVSMCからMGP発現を除去する効果を決定するために、野生型マウスの大動脈のVSMCは、MGP（siMGP）に対するsiRNAで処理したか（コントロールsiRNASISC）。石灰化は、7日間、石灰化培地A中で細胞を増殖させることによって培養したVSMCで誘導しました。細胞は、その後、フォンコッサ法を用いてカルシウム固定し、染色しました。 Ad.MGPとMGPの回復はMGPの石灰化を減少- / -のVSMCは、アデノウイルス処理細胞（ - B、E 図5A）を制御するために比較しました。 MGP式の> 95％のノックダウンをもたらしsiMGPと野生型大動脈VSMCを、の治療、25は SISC処理細胞（ 図5C - D、F）と比較して、石灰化を増加させました。これらの結果は、MGP欠損マウスにおける知見VSMC石灰化の模倣のこのin vitroモデルことを示しているとMGPが培養したVSMCの石灰化を調節することを示しています。
培養したVSMCの石灰化を検出する別の方法は、カルシウムNIRです。 Vにおける血管石灰化をモデル化するために、 ITRO、ヒト冠状動脈のVSMCを購入し、治療期間の後に石灰化メディアBの21日間培養し、石灰化はカルシウムNIR法を用いて同定し、培養物を、カスタム緑色蛍光コラーゲンプローブ51とヘキスト染料（1で対比染色しました/ mlの10％ホルマリンで固定後5分）（ 図6）のために。 VSMC核を共焦点顕微鏡（ 図6A）によって青色ヘキスト蛍光で観察しました。代表的な光学部は、VSMCを（ 図6B）によって生成されたコラーゲンマトリックス内カルシウムNIR染色石灰化ミネラルを示しています。光のzスタックの三次元再構成は、ウェルの底にしたVSMCが堆積石灰化ミネラルが（ - D 図6C）に捕捉されるようになるにはコラーゲンマトリックスを生成として培養中に作成された層を示しています。
1再 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
図1：野生型マウスからの大動脈の代表的な解剖 （A）胸部および総腸骨動脈分岐部まで延びる腹部大動脈の画像が重なる臓器や周囲大動脈脂肪を除去した後に描かれています。 （B）Aは、腕頭と大動脈弓のビューを集中総頸動脈、左鎖骨下動脈を残しました。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：MGPにおける血管石灰化 - / - マウスは、BMPシグナル伝達に依存している MGP - / -マウスは、腹腔内（ip）で処置したいずれかの注射がまし。 hicle、LDN-193189（LDN、2.5ミリグラム/ kg /日）、またはALK3-Fcを（2ミリグラム/キログラム隔日）と野生型マウスは、28日目までの人生の1日目から始まる車両の腹腔内注射で処置しました。27日目に、マウスに尾静脈を介してカルシウムNIRを注射しました。大動脈を28日目に採取し、近赤外蛍光を用いて画像化しました。画像は3ミリメートルを示すスケールバーを持つすべての4つのパネルで同じ倍率です。野生型マウスの大動脈は、MGPから大動脈ながらカルシウムNIR信号を示さなかった- / -マウスは、強力なカルシウムNIR信号を持っていました。 / - -ビークル処理されたMGPマウスに比べると、MGPの大動脈- / - LDNまたはALK3-Fcのいずれかで処置したマウスでは有意に減少し、カルシウムNIR信号を示しました。この図は、基準25から取られている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
図3：MGP- 欠損マウスにおけるBMPシグナル伝達を防ぎ大動脈石灰化の薬理学的阻害野生型マウスは、車両（A）との腹腔内注射で処置したMGP - / -マウスは、車両（B）、LDNの腹腔内注射のいずれかで処理しました。 （C、2.5ミリグラム/ kg /日）、またはALK3-Fcを（D、2ミリグラム/キログラム隔日）は28大動脈は、収穫切片、赤アリザリンとカルシウムのために染色した日までの人生の1日目から始まります。画像は、400ミクロンを示すスケールバーを持つすべての4つのパネルで同じ倍率で撮影しました。 - / -マウス、図2中のカルシウムNIR信号と同様に、アリザリンレッド染色は、ビヒクル処置MGPの大動脈における石灰化の重い負担を示しています。 - / -マウスの石灰化はLDN-及びALK3-Fc処置MGPの大動脈に減少します。この数字はから取られます25を参照する 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：同時カルシウムNIRおよびカテプシンNIRと大動脈石灰化とマクロファージの浸潤の決意 （A）野生型、MGP - / - 、およびLDLR - / -マウスは、高脂肪食を与えたが、カルシウムNIRおよびカテプシンNIRを注射しました尾静脈注射を介し。大動脈を24時間後に回収し、近赤外蛍光イメージングを用いて評価しました。画像は3ミリメートルを示すスケールバーと同じ倍率です。野生型マウスは、実質的に大動脈石灰化またはマクロファージの存在を示しません。 LDLRから大動脈- / -マウスは、マクロファージの蓄積と局在共同広範な石灰化を持っています。対照的に、MGP - / -マウスマクロファージ浸潤の不在下で起こる大動脈石灰化を有します。 - / - （B）大動脈をMGPは、野生型から回収し、LDLR - / -マウスは、高脂肪食を与えました。これらの大動脈を切断し、MAC-2に特異的な抗体を用いてマクロファージについて染色しました。核はDAPIで染色しました。内腔の表面には、各パネルの右側に向かっています。画像は、100ミクロンを示すスケールバーを有する全ての3つのパネルにおいて同一の倍率で撮影しました。 - / -マウス（A）における知見と同様に、MGPの大動脈におけるマクロファージの蓄積の証拠はなかったです。この図は、基準25から図の修正版である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5：MGPが石灰化から培養したVSMCを保護培養大動脈VSMCををMGPから単離した- / -マウスとGFP（A）またはMGP（B）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染。野生型マウスから単離した大動脈たVSMCは、MGP（D）を標的とするsiRNA（C）、またはsiRNAのスクランブルコントロールのいずれかでトランスフェクトしました。細胞を7日間石灰化培地A中で増殖させ、その後、固定し、フォン・コッサ染色しました。 200ミクロンを示すスケールバーと-画像は、すべての4つのパネル（D A）と同じ倍率で撮影しました。ビューのシリアルフィールドはSEMを示すエラーバーは、バックグラウンド減算（EとF）後の画像Jソフトウェアを使用して撮影し、カルシウム染色のために定量しました。この図は、基準25から図の修正版です。4017fig5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 6：in vitroでの カルシウム細胞外マトリックスと関連してNIR識別石灰化は 21日間石灰化メディアBで培養（A）ヒト冠状動脈のVSMCは、Hoechst色素を用いた核染色により同定しました。緑色蛍光コラーゲンプローブと組み合わせて（B）カルシウムNIR染色（赤）の共焦点顕微鏡によって得られた光学部は、コラーゲンマトリックス全体に石灰化ミネラルを示しています。画像A - Bを 10μmを示すスケールバーと同じ倍率で撮影しました。 （C及びD）三次元再構成は、T内の石灰ミネラルの取り込みを示します彼は行列をコラーゲン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
動脈石灰化は、ヒトにおける心血管疾患の重要な危険因子であり、心血管イベントの発症に直接貢献するかもしれない。アテローム性動脈硬化症の薄い線維性キャップで1,5,52内膜カルシウム沈着は、ローカル生体力学的ストレスを増加させ、に貢献することが提案されていますプラーク破裂。心臓肥大を誘導し、心臓機能に影響を与える可能性動脈硬化を増加させることによって、53,54中膜石灰化の影響臨床転帰を。55したがって、ヒト疾患に重要な洞察を提供し、潜在的にするための新規の標的を同定する血管石灰化の根底にある分子メカニズムを理解します治療。
ここでは、大動脈石灰化アテローム性動脈硬化症およびNIRFイメージングを利用した血管石灰化のマウスモデルにおけるマクロファージの蓄積を検出するための方法が記載されている。9正確NIRを注入することが重要です尾静脈へのF剤。これは、習得が達成される前に、かなりの練習が必要な技術である。56さらに、この脂肪がカルシウムNIRおよびカテプシンと同じ波長で自家蛍光信号を発生することがありますように、大動脈から周囲大動脈脂肪のすべてを除去することが重要ですNIR信号。 NIRF剤の使用は、血管石灰化および炎症を評価するための標準的な組織学的方法を超える多数の重要な利点を有します。従来の組織学的技術とは対照的に、これらの薬剤は、全大動脈石灰化およびマクロファージの浸潤の定量化を可能にします。さらに、彼らは組織学的染色よりも、大動脈石灰化の開発に関連した初期の変化を検出するための、より感度の高い方法を提供し、したがって、疾患の初期段階に機械的な洞察を提供することができます。初期のカルシウムNIR信号の9サイトが増加を含む骨形成のマーカーと関連していますWELとしてアルカリホスファターゼ活性Runx2のとオステオポンチン遺伝子発現としてリットル。また、石灰化およびカテプシン活性のためのスペクトル的に別個のプローブの同時使用は、定量化との両方のアテローム性や石灰病気の時空間進行の関連付けを可能にします。9
血管疾患の根底にある病態生理学的メカニズムの理解に血管石灰化および炎症助剤の空間的および時間的特性を特定します。例えば、NIRF剤の使用は、内膜の石灰化（ - / -およびLDLR - / -のApoE高脂肪食を与えたマウス）のモデルにすることを実証している、血管石灰化は、マクロファージの蓄積のサイトに同時局在する（ 図4）とその石灰化は、時間的にマクロファージの蓄積を、次の。9,11は興味深いことに、カテプシンNIRとのマクロファージの蓄積がMGP欠損マウスに見られる内側血管石灰化は検出されなかった。25木Sは、NIRF剤を用いた実験から、マクロファージの蓄積は、血管内膜の石灰化に関連しているが、それは血管の中膜石灰化のために必要とされないと結論することができます。
イメージング及び血管疾患を研究におけるその役割と同様に、NIRFイメージングは大動脈弁疾患を研究するために利用されてきた。47大動脈弁疾患は、バルブ上の脂質を含んだマクロファージと石灰化病変でマークおよび類似の根底にある分子メカニズムおよびアテローム性動脈硬化症などの遺伝的決定因子を呈します。57-59大動脈弁の石灰化は、リーフレット機能の障害を引き起こし、高齢者の臨床大動脈弁狭窄症の主な原因です。症候性大動脈弁狭窄症のための現在利用可能な唯一の治療は、弁置換術です。大動脈弁疾患の分子機構のより良い理解は、進行性大動脈弁の石灰化の後期臨床的合併症を防止する必要があります。 NIの利用動物モデルにおける分子イメージングツールとしてRF剤は、その初期段階で大動脈弁疾患を評価するための感度の高い方法を提供する。60
冠動脈プラークを可視化する標準的な技術は、狭窄の重症度に焦点を当てている、まだ急性冠症候群の大半は非流動制限プラークの破裂に起因する。炎症などのプラーク内の6の生物学的プロセスは、プラーク破裂の優れた予測因子として働きます従来のイメージング技術とは対照的に、狭窄の程度。61より、NIRFイメージングは、マトリックスメタロプロテイナーゼと（ すなわち 、マクロファージのタンパク質分解活性（MMP）活性化剤、カテプシンNIRでタンパク質分解及び弾性線維溶解性の活性、および骨形成活性細胞活性を測定するための機会を提供します）カルシウムNIRと。9したがって、この方法は、心血管疾患の同時機能的および解剖学的評価を提供します。 NIRFイメージングは、電子を利用します低い波長の光に比べて増加した組織浸透の利点を有する650〜900 nmの範囲のxcitation波長は、従って、疾患病変のより深い評価を可能にする。60、また周辺の血管組織の自己蛍光バックグラウンド信号が減少します-infrared波長範囲。このプロトコルは、NIRFイメージングex vivoでの使用に焦点を当てているが、NIRFイメージングはまた、インビボでの長手方向の分子イメージングのために有用なプラットフォームを表す。9 NIRFイメージングは、生体顕微鏡と組み合わせた場合、ヒトにおける将来の診断用途を有することができる。61が、制限をカルシウムNIRイメージングの長手方向ビスホスホネート誘導プローブ自体が石灰化の生理学的プロセスを変更することができるということである。62
心血管石灰化は、骨形成表現型へのVSMCの分化転換を伴う積極的に調節されたプロセスである。25,41,42 63公開に類似しており、in vitro試験（ 図5）を実行するために、マウスの大動脈当たりの細胞の十分な数を達成しました。代替私VSMC分離のためのTHODは、酵素消化ではなく、外植大動脈輪の直接培養を伴いません。この技術は、酵素消化を利用する技術よりも少ない細胞を生じることが報告されている。63,64
二つの異なる石灰化メディア、どちらかβGPと/ ASC / DEX 65,66またはNaPhos、25,43がにVSMCの石灰化を誘導するために用いることができることが記載されています。メディアの両方のタイプが同等の成功とネズミのVSMCを石灰化するために使用されています。 βGP/ ASC / DEXを含む石灰化メディアは人間のVSMC（ 図6）を石灰化するために使用されてきたが、NaPhosを含む培地は、私たちの経験では、人間のVSMC石灰化に効果的ではなかったです。また、21 - 石灰化が検出される前に石灰化メディアBにおける人間のVSMCの文化の28日間が必要になることがあります。 MGPの発現レベルは、siRNAおよびcalcificatiで減少したときに、in vitroで野生型のVSMCの石灰化が増加しましたMGPに減少したオン- / -のVSMCをMGPの発現が回復したとき（ 図5）。 / - -これらの知見は、MGPで観察された大動脈石灰化と一致しているマウスとVSMC石灰化のこのインビトロ方法は、in vivoでの石灰化の有用なモデルとして役立つことを示唆しています。培養たVSMCから、無傷の血管についての結論を引き出すには限界があることは、注意することが重要です。培養したVSMCは、遺伝子発現パターンの変化、形態、および剛性の開発に加えて、特に高いの通路でそれらのインビボ収縮特性を、失われる可能性があります。メディアの石灰化で培養67-70のVSMCは、石灰化の前に、骨芽細胞系統に分化するが、しないでください多くの場合、in vivoで観察される軟骨細胞の中間を示す。71培養細胞から引き出された機械的な結論はインビボ系で検証することが重要です。にこの制限を克服する電子潜在的な方法は、培養された無傷の血管リングを使用して、それらのインビボ状態でのVSMCを研究することである。70
2つの異なる方法は、フォン・コッサ法（ 図5）とカルシウムNIR染色（ 図6）培養したVSMCの石灰化を検出するために提示されています。石灰化のために評価するために頻繁に使用されるが、フォン・コッサ法がややカルシウム結晶のその還元特異性によって制限され、50カルシウムNIRは、石灰化のために特異的であるように感じられ、それが追加のスペクトル的に別個の蛍光との同時染色を可能にするという点で特に有利で す薬剤。9今後の石灰化のメカニズムに重要な洞察を提供することができる追加の分子プローブを用いたカルシウムNIRを利用し、このプロトコルのアプリケーションおよびIDEに、ハイスループット様式でVSMC石灰化の小分子阻害剤の迅速な評価を可能にすることができます血管石灰化のための潜在的な新規治療法をntify。
要約すると、心血管石灰化は、臨床疾患のための重要な危険因子と潜在的な貢献者です。心臓血管の石灰化およびアテローム性動脈硬化症のメカニズムの知識は、動物および細胞ベースのモデルの両方に依存しています。 in vivoで 、ex vivoで 、in vitroでのモデルに石灰化を評価するための方法論は、心血管疾患の我々の理解を進めるために重要です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | SAB2500963 | |
| Chamber slide | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium | Gibco | 14190-144 | |
| Elastase | Sigma | E1250 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Forceps, fine point | Roboz | RS-4972 | |
| Forceps, full curve serrated | Roboz | RS-5138 | |
| Formalin (10%) | Electron Microscopy Sciences | 15740 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| Human coronary artery smooth muscle cells | PromoCell | C-12511 | |
| Insulin syringe with needle | Terumo | SS30M2913 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-7506 | |
| Micro-dissecting spring scissors (13 mm) | Roboz | RS-5676 | |
| Micro-dissecting spring scissors (3 mm) | Roboz | RS-5610 | |
| NIR, cathepsin (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
| NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Normal Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Nuclear fast red | Sigma-Aldrich | N3020 | |
| Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| Silver nitrate (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S-1648 | |
| ß-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma | G9422 | |
| Tissue culture flask, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
| Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture plate, six-well | Falcon | 353046 | |
| Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
| Tube rodent holder | Kent Scientific | RSTR551 | |
| Vacuum-driven filtration system | Millipore | SCGP00525 |
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