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Medicine

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

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그것은 매년 780,000 이상의 사망자를 차지하고 경우 심혈관 질환은 미국을 포함한 세계의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 1 관상 동맥 석회화 및 대동맥 석회화는 동맥 경화성 질환의 특징이며, 심혈관 질환의 강한 예측을 제공합니다. 2 내막 석회화 경화증과 연관 내측 만성 신장 질환, 당뇨병과 연관된 석회화 (또한 Mönckeberg라고도 함) 5 내막 석회화 지질 축적과 마크로파지의 설정에서 발생 혈관 석회화 4 2 가지 주요 유형은 성인에서보고되었다. 혈관 벽에 침투. 5,6 내측 벽 석회화는 독립적 내막 석회화가 발생 엘라스틴 섬유 또는 평활근 세포에 지역화 및 지질 증착 또는 대 식세포의 침윤과 연결되어 있지 않습니다. 5,7,8 연구를의 분자 메커니즘에혈관 석회화는 셀 기반 및 동물 모델 시스템에 의존하고있다. 중간 석회화에 대한 모델 매트릭스 GLA 단백질과 쥐를 포함하는 동안 atherocalcific 질환의 설치류 모델, 아포 지단백 E (아포 E) 9, 10 또는 저밀도 지단백 수용체 (LDLR) (11)는 고지방식이를 공급하거나 결핍 된 쥐를 포함 (MGP) 결핍 (12) 또는 가까운 총 신장 절제술 (5 / 6의 신장 절제술 모델) 또는 높은 아데닌 다이어트에 노출하거나 요독증을 개발 쥐. (13)

여기에, MGP 결핍과 관련된 중간 혈관 석회화의 모델에 초점을 맞추고 있습니다. MGP 동맥 석회화 억제 세포 외 단백질이다. MGP 유전자 12 돌연변이 Keutel 증후군 brachytelephalangy 외에 확산 연골 석회화 특징으로하는 드문 인간 질병, 청각 상실, 말초 폐 협착증에서 확인되었다. 14-18 아니지만 자주 관찰 (19)여러 동맥의 동심 석회화가. Keutel 증후군에 설명 된 uncarboxylated, 생물학적 비활성 MGP의 높은 순환 수준이 심혈관 사망률을 예측하는 동안 인간의 MGP 유전자의 20 일반 다형성은 관상 동맥 석회화 위험이 증가, 21 ~ 23과 연관된다. (24) 인간과는 달리 Keutel 증후군, MGP 결핍 된 마우스는 나이 2 주에서 시작 인해 대동맥 파열로 출생 후 6-8주 다이 자연 광범위한 동맥 석회화로 구성된 심한 혈관 표현형을 개발한다. (12)

아포 달리 - / - 및 LDLR - / - 마우스에 고지방식이를 공급, 연관된 대 식세포 유도 염증 내막의 혈관 석회화를 개발하는 MGP - / -. 생쥐 대 식세포 침윤의 부재에서 내측 혈관 석회화 개발 11,25 비록 이러한 연구 결과는 intim에 대해 서로 다른 기본 자극을 제안Al 및 내측 석회화, 예컨대 종양 괴사 인자 α 및 IL-1과 프로 골 형성 인자 같은 염증성 매개체를 포함한 혈관 석회화 기여 확인되었다 석회화. 26 다중 신호 전달 경로의 두 형태를 매개 시그널링 메커니즘 오버랩 존재 이러한 노치의 Wnt, 골 형태 형성 단백질 (BMP) 신호. 27,28 이러한 신호 전달 경로는 다시 뼈 관련 단백질의 발현을 증가 전사 인자 런트 관련 전사 인자 2 (Runx2)과 osterix의 발현 (증가 . - / - 및 LDLR - / - 마우스에 고지방 및 자발 먹이 석회화를 매개 맥관 구조에서, 오스테오칼신, sclerostin, 알칼리 포스파타제) 28-30 우리 등은 아포 관찰 혈관 석회화가 입증 - / - MGP에서 관찰되는 혈관 석회화 모든 뼈 형태 형성 단백질에 따라 마우스 (BMP)시gnaling하고, 여기에 초점이 경로이다. 11,25,31 BMPs에 뼈 형성을 위해 요구되는 강력한 골 형성 인자이다 인간 동맥 경화증의 발현 증가를 나타내는 것으로 알려져있다. 32-34 시험 관내 연구는 조절하는 BMP 시그널링을 연루 이러한 Runx2 같은 골 형성 인자의 발현. BMP 리간드 35-37 과발현, BMP-2, 고지방식이 공급 아포 E 결손 마우스에서 혈관 석회화의 개발을 가속화. (38) 또한, 이러한 억제제 시그널링 특정 BMP의 사용 - / - (39, 40) 및 / 또는 LDN-193189 (LDN)로 ALK3-FC 모두 LDLR 혈관 석회화 현상을 방지 마우스에 고지방 및 MGP 결핍 생쥐 먹이 11,25.

혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)가 혈관 석회화의 개발에 중요한 역할을한다. 30,41,42에서 개발 내측 혈관 석회화 MGP를 결핍 된 마우스는 charac입니다골아 세포 표현형에 혈관 평활근 세포의 분화에 의해 terized. 이러한 Runx2 및 오스테 오 폰틴 등의 골 형성 마커의 동반 상승 myocardin과 알파 평활근 액틴을 포함하여 혈관 평활근 세포 마커의 감소 식 MGP 결과의 손실. 이러한 변화는 혈관 석회화의 개발과 일치한다. 25,43,44

대동맥 석회화와 마우스에 염증이 일반적으로 말 석회화 조기 석회화 및 골 형성 활동, 폰 코사와 알리자린 레드 염색에 대한 알칼리 포스 파타 아제 활성 및 대식 세포 단백질 마커 (예. 대상으로 면역 조직 화학 프로토콜과 같은 조직 화학적 기술을 이용하여 평가된다, CD68, F4 / 80 맥 1 맥이 맥-3). 9,45 그러나,이 기준 영상 기술 의한 샘플링 바이어스 소모적이고 불완전한 시간 단면으로 대동맥 조직의 처리를 필요로하고 제한된 그들의 염증과 calcificat을 정량화 할 수있는 능력전체 대동맥에 이온. 이 프로토콜은 또한 제공. 시각화 전체 대동맥 및 중간 크기 동맥 석회화 근적외선 형광 (NIR) 분자 이미징 생체를 이용하여 대 식세포 축적을 정량하는 방법을 설명 수확 및 마우스로부터 주 대동맥 혈관 평활근 세포를 배양하여 유도하는 방법 위해 쥐와 시험관에서 인간의 혈관 평활근 세포의 석회화는 혈관의 석회화를 기본 분자 메커니즘을 확인합니다. 이러한 기술은 생체 내에서와 atherocalcific 질병 연구를위한 체외 방법에서 모두 연구자를 제공합니다.

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Protocol

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마우스 모든 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수 하였다. 주택과 본 연구에서 설명 된 쥐를 포함하는 모든 절차 (연구 동물 관리에 분과위원회)가 기관 동물 케어 및 사용위원회 매사추세츠 종합 병원의 승인 하였다. 모든 절차는 고통을 최소화하기 위해 신중하게 수행 하였다.

시약 1. 준비

  1. 전체 대동맥의 근적외선 형광 영상
    주 :. 형광 이미징 프로브는 하이드 록시 아파타이트에 대한 결합에 의해 (46, 47) 혈관의 골 형성 활성을 표시하는 데 사용할 수있는 근적외선 비스포스포네이트 유래, 카 텝신 활성화 형광 이미징 프로브 식세포 단백질 분해 및 elastolytic 활성에 대한 마커로서 작용할 수 맥관. 9 모두 형광 프로브의 동시 사용을 허용하기 위해, 그것은 중요스펙트럼 구별되는 프로브를 사용합니다. 표기 칼슘 NIR은 카 텝신 활성 특정 근적외선 형광 이미징 프로브를 나타내는 석회화 특정 근적외선 형광 이미징 프로브 및 카 텝신 NIR를 나타내는 데 사용된다.
    1. 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR의 솔루션을 준비합니다. 제조사의 프로토콜에 따라, 칼슘 또는 NIR 텝신 NIR 24 nmol의 함유 바이알에 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 1.2를 가하여 가볍게 흔들어.
      주 : 2-8 ℃에서 어둠 속에서 저장시 제조사에 따르면, 한번 PBS로 재구성 된, 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR 용액은 14 일 동안 안정적으로 유지.
  2. 분리 및 쥐 대동맥 혈관 평활근 세포의 석회화
    1. 대동맥 소화 해결 방법 :
      1. 175 U / ㎖ 유형 2 콜라게나 1.25 U / ㎖ 엘라 스타 제를 포함하는 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 신선한 솔루션 (~ 3-5 ml의 당 대동맥 수확) 준비합니다. w 용액 살균및 0.22 μm의 진공 기반 여과 시스템 i 번째 사용할 때까지 얼음 솔루션을 유지.
    2. 셀 미디어 :
      1. 10 % 소 태아 혈청, 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 500 ml의 보충. 사용하기 전에 37 ° C로 미디어를 따뜻하게.
    3. 석회화 미디어 :
      1. 석회화 매체 A (NaPhos, 마우스 세포주에서 사용) :
        1. 10 % 소 태아 혈청, 2 mM 인산 나트륨, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (필요한 부피)의 DMEM 100-500 ml의 보완. 사용하기 전에 37 ° C로 미디어를 따뜻하게.

          또는
      2. 석회화 미디어 B (βGP / ASC / DEX는, 마우스 또는 인간의 세포 라인 중 하나에서 사용) :
        1. 10 % 소 태아 혈청, 10 밀리미터-β 글리세로 포스페이트 나트륨, 50 μg의 / ㎖ L - 아스코르브 산, DMEM (10)의 100 ~ 500 ㎖ (필요에 따라 볼륨)을 보충나노 덱사메타손, 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토. 사용하기 전에 37 ° C로 미디어를 따뜻하게.

2. 꼬리 정맥 주입

  1. 꼬리 주입하기 전에, 5 분 동안 약한 가열 램프하에 마우스 가온.
  2. 튜브 설치류 홀더에 마우스를 억제. 알코올 면봉으로 꼬리를 소독.
  3. 꼬리 정맥 주입을위한 30 G 바늘을 사용한다. 꼬리 정맥은 옆에 있습니다.
    1. 바늘이 꼬리에 진출함에 따라 주사기 앞으로 압력의 완만 한 금액을 적용합니다. 주입에 대한 내성이 더 이상 존재하면 정맥에 액세스하지 않는다.
    2. 정상 속도 칼슘 NIR 100 ㎕ 및 / 또는 카 텝신 NIR 100 ㎕의 부피 주입. 사출의 끝에서, 5 초 동안 정지 된 바늘을 철회.
  4. 대동맥 (3 절 참조) 주입 후 3-24 시간을 수확.

3. 마우스 해부

  • 200 ㎎ / ㎏ 복강 내 펜토 바르 비탈 주입 마우스를 안락사.
  • 해부 보드의 동물 부정사를 놓고 이사회에 각 발을 테이핑에 의해 안정. 해부 현미경 작은 가위를 사용하여, 상부 흉부에 하복부로부터 연장 정중선 절개를 만든다.
  • 집게로 피부를 다시 껍질과 복부 장기를 공개, 복막를 제거합니다. 대동맥을 가로로 쪼개다 않도록주의하면서, 위장 기관을 제거합니다.
  • 전방 다이어프램의 횡 절개를하고 복부를 가로 지르는 절개를 계속합니다. 해부 가위를 사용하여 갈비뼈의 측면을 통해 절단 및 흉골의 우수한 부분에 부드러운 조직의 부착을 제거하여 흉곽을 놓습니다. 폐를 공개, 흉곽을 제거합니다.
  • 조심스럽게 폐를 제거 (식별 및 근위 대동맥 해부에 도움이) 처음에 장소에 마음을 둡니다. 관리, ensuri와 흉선, 기관 및 식도를 제거대동맥은 그대로 유지 ng를.
  • 바로 미세 집게와 마이크로 해부 가위를 사용하여, 요정 대동맥 지방 (그림 1A)를 제거 할 때 세심한주의를 기울이고, 대동맥 궁에 장골 분기에서 대동맥 주변의 연부 조직을 제거합니다. 대동맥 궁 (즉, 팔 머리, 경동맥과 쇄골 하 동맥, 그림 1B)의 큰 가지를 둘러싸고있는 나머지 지방과 연부 조직을 제거합니다.
    참고 : 형광 이미징을 수행 할 때 지방이 배경 신호를 증가시킬 수 있기 때문에 대동맥에서 지방을 제거하는 것이 중요하다.
  • , 흉강에서 마음을 제거 신중 근위 대동맥에서 그것을 분리, 폐기. 장골 분기에서 말초 대동맥을 가로로 쪼개다. 인슐린 주사 바늘을 사용하여, 남아있는 혈액 세포를 씻어 대동맥 궁으로부터 대동맥에 생리 식염수를 주입. 완전히 제거, 대동맥 궁 혈관과 함께 대동맥을 분리몸에서.
  • 이미징을위한 준비가 될 때까지 얼음에 생리 식염수의 대동맥을 놓습니다.
  • 4. 대동​​맥 영상

    1. 이미지 대동맥 생체 즉시 근적외선 반사율 형광 촬상하여 수확 후. 25
      1. 전술 한 바와 같이, 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR 주입 쥐의 대동맥에서 형광 신호의 강도를 정량화 할 수있는 적절한 멀티 채널 파장에서 형광 화상 카메라를 설정합니다. (25) 제조업체에 따르면, 칼슘 NIR은와 ~ 650-678 nm의 광에 의해 여기 될 수있다 ~ 680-700 nm의 범위의 최대 방출. 카 텝신 NIR은 ~ 770 nm에서 최대한의 방출로 ~ 745-750 nm의 광에 의해 여기 될 수있다.

    기본 쥐 대동맥 혈관 평활근 세포의 5. 분리

    1. 상술 한 바와 같이 단계 3.1-3.7를 수행합니다.
    2. 해부가 완료 될 때까지 차가운 HBSS에 대동맥을 놓습니다. 조심스럽게 어떤 REM 수면을 절단만 대동맥을 떠나, periaortic 지방과 연부 조직을 aining.
    3. 무균 조직 배양 후드에서 35mm X 10mm 조직 배양 접시에있는 대동맥 소화 솔루션에 대동맥을 전송합니다. 부드러운 간헐적 락 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 넣어. 소화 후, 대동맥이 늘어나거나 닳은 모양을 나타낸다.
    4. 그대로 중간 층을 유지하면서 해부 현미경 및 멸균 집게로, 대동맥의 외부 외막 층을 제거. 외막을 제거하기위한 하나의 기술은 일단 대동맥 외층을 벗겨 및 양말 다시 박리 및 제거 할 수 있었던 것처럼 하부 내측 층에서 제거한다.
    5. 외막 층이 제거 된 후, 2-4 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포 배양 배지 및 스토어로 새로운 조직 배양 접시에 남은 대동맥 놓는다.
    6. 멸균 후드와 멸균 3mm 마이크로 해부 가위를 사용하여 아래, 폭 1-2mm로 대동맥을 잘라반지입니다.
    7. 대동맥 소화 솔루션으로 새로운 조직 배양 접시에이 반지를 놓고 부드러운 간헐적으로 120 분 동안 흔들어으로 37 ° C에서 품어. 세포를 재현 탁이 인큐베이션 동안 용액 위아래로 수회 피펫.
    8. 15 ML 원뿔 튜브 소화 솔루션 및 전송에 따뜻한 세포 배양 매체의 5 ML을 추가합니다.
    9. 원심 200 x g에서 5 분 동안 튜브.
    10. 세포 배양 배지 (예, 5 ㎖)의 원하는 용적에 재현 탁 미디어 세포 대기음.
    11. 25 cm2로 세포 배양 플라스크마다 대동맥으로부터 분리 된 세포의 전체 양을 플레이트 및 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. 전술 한 바와 같이, 배양 초기 7~10일 동안 25,48. 표준 기술을 사용하여 세포를 전파 매체마다 72-96 시간을 변경합니다. 세포가 합류에 접근, 더 자주 (매 48 시간)을 미디어를 보충.
      참고 : 충분한 ...로서 성장을 몇 주 걸릴 수 있습니다세포의 ntity.
    12. 합류 후에 트립신 통로 세포는 37 ° C로 가온된다.
      1. 각 문화 플라스크에 트립신의 0.5-1.0 ML을 추가하고 3-5 분 동안 품어; 표면에서 세포를 분리하기 위해 필요에 따라 부드럽게 매 30 ~ 60 초 플라스크의 측면을 누릅니다.
      2. 세포를 플라스크의 바닥에서 분리되면, 트립신으로 세포를 세포 배지 10 ㎖를 추가한다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포 펠렛으로부터 미디어 트립신 대기음. 신선한 세포 배지 (예, 50-10 mL)을 원하는 양으로 세포를 재현 탁하고 (챔버 슬라이드에 전달 일부 셀) 새로운 플라스크로 옮긴다.
    13. 이전 α-평활근 액틴에 대항하는 항체를 사용하여 49 바와 같이 셀의 제 1 통로에서, 표준 면역 세포 화학 기법과 평활근 세포 계통을 확인.

    배양 부드러운 근육 6. 유도하는 석회화셀

    1. 플레이트의 세포를 6 웰 포맷 5.12 얻은. 참고 : 잘 추천 당 세포 미디어 2.0 ML의 총 부피에 1 × 10 5 세포 / 웰 시작.
    2. 세포를 6 웰 플레이트 형식으로 최소 7 일 동안 석회화 미디어 A 또는 B에서 성장 할 수 있습니다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.
    3. 세포 매체마다 48 시간을 변경합니다.

    7. 폰 코사 염색 방법을 사용하여 혈관 평활근 세포 석회화 평가

    주 :. 조직 또는 배양 세포의 세포 외 기질의 석회화를 측정하는 폰 코사 방법은은 이온과 인산 바인딩 칼슘 이온의 치환에 기초 50 빛과 유기 화합물의 존재 하에서,은 이온을 환원 금속으로서 시각화 은. . 미 반응은 소듐 티오 설페이트로 처리하여 50를 제거한 다음 폰 코사 염색에 대한 프로토콜이다 :

    1. 세포 CU에서 대기음 미디어lture 판.
    2. 실온에서 20 분 동안 10 %의 포르말린 1 mL에 넣어서 세포를 고정한다.
    3. 포르말린을 제거하고 5 분 동안 증류수로 고정 된 세포를 세척 하였다.
    4. 1-2 시간에 대한 60 ~ 100 W 전구에서 5 % 질산은 용액 1 ml의 세포를 품어.
    5. 질산은 용액을 흡인하고 5 분 동안 증류수로 세척한다.
    6. 5 분 동안 증류수 용액 (/ V W)을 5 % 티오 황산나트륨의 1 ml의 세포를 넣어 반응은을 제거한다.
    7. 5 분 동안 증류수로 세포를 씻어. 반복 세척은 3 배. 폰 코사 염색 표준 거꾸로 광학 현미경과 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
    8. 선택적 단계 : 5 분 동안 원자력 빠른 빨간색의 1ml를 함께 Counterstain과. 증류수 (5 분마다) 세 세척에이 사항을 따르십시오.

    또는

    8. 근적외선 형광 이미징과 혈관 평활근 세포 석회화 평가

    참고 : 능력과 유사마우스 대동맥 내 석회화를 식별하기 위해, 칼슘 NIR 쉽게 배양 된 세포에 의해 증착 석회화 미네랄을 결합한다. 긴 파장 필터이 기술, 형광 현미경 및 플레이트 리더를 사용하면 이미지와 각각의 시험관 석회화를 정량화 할 수 있습니다. 칼슘 NIR의 긴 파장 방출은 다른 기능을 감지하는 낮은 파장 발광 형광체의 동시 이용​​이 가능합니다. 다음과 같이 칼슘 NIR 염색에 대한 프로토콜은 다음과 같습니다

    1. 섹션 1.1.1에서 설명한 바와 같이, 칼슘 NIR 24 nmol의 들어있는 바이알에 1X PBS의 1.2 ml를 추가합니다.
    2. 칼슘 NIR의 1 개를 희석 : (100)를 적절한 석회화 또는 제어 미디어.
    3. 흡인 세포 배양 접시에서 미디어와 문화 매체를 NIR이 함유 칼슘으로 대체합니다.
    4. 하룻밤 37 ℃에서 칼슘 NIR 미디어와 문화 판을 품어.
    5. 우물에서 미디어를 기음과 PBS로 한번 우물을 씻는다.
      참고 :이 시점에서,원 배양액이 웰에 첨가 할 수 있고, 세포를 실시간 영상화 할 수있다. 그렇지 않으면 다음 단계로 진행합니다.
    6. 실온에서 20 분 동안 10 %의 포르말린 1 mL에 넣어서 세포를 고정한다.
    7. 포르말린을 제거하고 5 분 동안 증류수로 고정 된 세포를 세척 하였다. 반복 세척은 3 배.
    8. 선택 단계 :. 면역 형광 염색 또는 관심의 단백질에 대한 다른 대조 염색을 수행 8,9
    9. 이미지 또는 (예를 들어, 칼슘 NIR은 650-678 nm의 광에 의해 여기 될 수있다) 적절한 형광 여기 파장과 발광 필터 (~ 680-700 나노 미터)를 사용하여 칼슘 NIR 얼룩을 검출한다.

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    Representative Results

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    - / - 대동맥 MGP 석회화와 야생형 마우스 칼슘 NIR 형광 이미징을 사용하여 측정 하였다. 어떤 칼슘 NIR 신호 석회화 부재 (도 2)를 나타내는 야생형 마우스의 대동맥에서 검출되지 않았다. 강한 칼슘 NIR 신호는 향상된 혈관 석회화와 일치 MGP 결핍 마우스의 대동맥에서 검출되었다. 야생형로부터 대동맥의 조직 절편 MGP - / - 야생형 마우스 검출없이 석회화 MGP-결핍 마우스에서 관찰 된 광범위한 혈관 석회화 확인 - 생쥐 알리자린 레드 25 (B도 3a)으로 염색 하였다. MGP 결핍과 관련된 혈관 석회화가 BMP 신호에 의존 여부를 확인하기 위해, MGP - / - 마우스가 인생의 1 일부터 시작 LDN, ALK3-FC, 또는 차량으로 처리 하였다. 이들 생쥐는 27 일 칼슘 NIR 주입하고,대동맥은 다음날 수확했다. BMP의 약리학 적 억제는 칼슘 NIR (그림 2) 검출 대동맥 석회화를 감소 시그널링. - / - 마우스 (도 3B - D) 칼슘 NIR과 결과와 유사 LDN- 및 대동맥 ALK3가-FC 처리 MGP - / - 비히클 처리 MGP 비교할 때 쥐 칼슘 알리자린 레드 염색을 감소했다. - / - 생쥐이 결과 BMP 시그널링 MGP 관찰 혈관 석회화 필요하다는 것을 나타낸다.

    LDLR는 - / - / - -. 마우스는 MGP에 NIR 프로브를 높은 지방 다이어트는 동맥 벽의 두 식세포 염증과 석회화을 개발 공급 석회화 및 카 텝신 별 11 동시 꼬리 정맥 주입 마우스 결정하기 위해 수행 된 경우 MGP의 혈관 석회화 . -deficiency은 대 식세포의 축적과 연관된다 (25)는 LDLR - / - 생쥐 먹이고지방 다이어트와 야생형 마우스를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용 하였다. (도 4a)을 예측으로 야생형 마우스의 대동맥, 사실상 칼슘 NIR 또는 카 텝신 NIR 신호를 나타내지 않았다. 내막 동맥 경화증이 모델에서 대 식세포의 침윤 및 혈관 석회화 사이에 강한 연관성을 나타내는 마우스 - / - 대동맥 궁 영역을 선호 공동 현지화 된 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR 신호는 LDLR에서 관찰되었다. - / - 확산 강한 칼슘 NIR 신호 MGP의 대동맥에서 관찰되었지만 쥐의 카 텝신 NIR 신호가 야생형 마우스의 것과 다르지 않았다. 이러한 결과는 MGP 결핍 혈관 석회화 식세포 축적 부재 발생 나타낸다. - / -, 및 LDLR - 더 야생형, MGP에서 이러한 연구 결과, 대동맥을 확인하려면 / - 마우스 대 식세포 마커 MAC-2 (에 특이적인 항체로, 수확 절단 및 염색 - / - 마우스는 풍부한 MAC-2 염색을 보여 주었다; - / - 생쥐 혈관 대 식세포의 부재를 나타내는, MGP의 대동맥에서 검출 가능한 MAC-2 염색이 없었다.

    높은 인산 전술 한 프로토콜을 사용하여, 매체를 함유하는 배양 마우스 - / - 시험 관내 혈관 석회화를 모델링 대동맥 혈관 평활근 세포는 야생형 및 MGP 분리 하였다. - / - 마우스 배양 된 혈관 평활근 세포의 석회화를 변조에 MGP의 역할을 확인하려면, MGP를 발현하는 아데노 바이러스 (Ad.MGP)는 MGP에서 대동맥 혈관 평활근 세포에서 MGP를 복원하는 데 사용되었다. 녹색 형광 단백질 (Ad.GFP)을 발현하는 아데노 바이러스에 감염된 MGP 결핍 혈관 평활근 세포는 대조군으로 사용 하였다. 또한, 후속의 혈관 평활근 세포에서 석회화 MGP 발현을 제거하는 효과를 결정하기 위해, 야생형 마우스의 대동맥 혈관 평활근 세포는 MGP (siMGP)에 대해 지시 된 siRNA로 처리하거나 (siRNA를 제어SISC). 석회화 7 일 동안 석회화 미디어 A의 세포를 성장시켜 배양 된 혈관 평활근 세포에서 유도 하였다. 이어서, 세포 고정되고 폰 코사 방법을 이용하여 칼슘 염색 하였다. - / - Ad.MGP와 MGP의 복원 MGP의 석회화를 감소 혈관 평활근 세포는 아데노 바이러스 처리 된 세포 (- B, E도 5a)를 제어하기 위해 비교. MGP 식의> 95 % 최저의 결과 siMGP 야생 형 대동맥 혈관 평활근 세포의 치료, 25 SISC 처리 된 세포 (- D, F 그림 5C)에 비해 석회화 증가했다. 이러한 결과는 표시가 MGP 결핍 쥐에서 연구 결과 및 MGP 배양 혈관 평활근 세포의 석회화를 변조 것을 보여줍니다 혈관 평활근 세포의 석회화 모방이 체외 모델입니다.

    배양 된 혈관 평활근 세포의 석회화를 감지하는 다른 방법은 칼슘 NIR 함께. 절에서 혈관 석회화를 모델링하기 itro 인간 관상 동맥 혈관 평활근 세포를 구입하고, 처리 기간 후 석회화 미디어 B. 21 일간 배양 석회화가 칼슘 NIR 방법을 이용하여 확인하고, 배양 맞춤 녹색 형광 콜라겐 프로브 (51) 및 훽스트 (Hoechst) 염료 (1 대조했다 μg의 / ml의 10 % 포르말린에 고정 후 5 분) (그림 6)합니다. 혈관 평활근 세포의 핵은 공 초점 현미경 (그림 6A)에 의해 파란색 훽스트 형광 관찰되었다. 대표적인 광학 섹션은 혈관 평활근 세포 (그림 6B)에 의해 생성 된 콜라겐 매트릭스 내에서 칼슘 NIR 묻은 석회화 미네랄을 보여줍니다. 광학 (Z) - 스택의 3 차원 재구성 잘 증착 석회화 광물 (- D도 6C)을 포획로되는 콜라겐 매트릭스를 생성하는 바닥의 혈관 평활근 세포로 배양에서 생성 된 층을 나타낸다.

    1 다시 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    그림 1 :. 야생 형 마우스에서 대동맥의 대표 해부 (A) 흉부 및 공통 장골 동맥 분기까지 연장 복부 대동맥의 사진이 위에있는 기관과 요정 대동맥의 지방 제거 후 도시되어있다. (B) A는 팔 머리와 대동맥 궁보기를 집중 경동맥 및 좌측 쇄골 하 동맥을 떠났습니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    그림 2 : 혈관 석회화는 MGP에 - / - 마우스는 BMP 신호 전달에 의존 MGP는 - / - 하나의 마우스를 복강 내 처리 하였다 (IP) 주사했습니다. hicle, LDN-193189 (LDN, 2.5 ㎎ / ㎏ / 일), 또는 ALK3-FC (2 ㎎ / ㎏ 매일)와 야생형 마우스는 28 일까지 생활의 1 일에 시작 차량의 IP 주사로 치료했다 . 27 일째에, 마우스를 꼬리 정맥을 통해 칼슘 NIR 주사 하였다. 대동맥은 28 일에 수확 및 근적외선 형광 군데 있었다. 이미지는 3mm를 나타내는 스케일 바 네 패널에서 동일한 배율이다. - / - 생쥐 강한 칼슘 NIR 신호 있었다 MGP에서 대동맥이 동안 야생형 마우스 대동맥 칼슘 NIR 신호를 나타내지 않았다. - / - 비히클 - 처리 된 마우스에 비해 MGP 상기 MGP의 대동맥 - / - 또는 LDN ALK3-FC 중 처리 한 마우스는 현저하게 칼슘 NIR 신호를 감소 나타냈다. 이 그림은 참조 (25)에서 가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    3 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    그림 3 : MGP 결핍 생쥐에서 BMP 신호 전달을 방지 대동맥 석회화의 약리학 억제 야생 형 마우스를 차량 (A) 및 IP 주사로 치료했다 MGP - / - 마우스가 차량 (B), LDN의 IP 주사 중 하나를 처리 하였다. (C, 2.5 ㎎ / ㎏ / 일), 또는 ALK3-FC (D, 2 ㎎ / ㎏ 매일)가 28 대동맥가, 수확 단면과 붉은 알리자린과 칼슘을 위해 염색 날까지 삶의 1 일에 시작. 이미지는 400 μm의를 나타내는 눈금 막대와 네 개의 패널에서 동일한 배율로 촬영되었다. - / - 마우스도 2의 칼슘 NIR 신호와 유사하게, 알리자린 레드 염색 비히클 처리 MGP의 대동맥 석회화의 부담을 보여준다. - / - 생쥐는 LDN- 석회화와의 대동맥에서 감소 MGP를 ALK3-FC 처리. 이 수치는에서 가져온 것입니다(25) 참조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    .도 4 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR 대동맥 석회화 식세포 침윤 동시 결정 (A) 야생형 MGP - / - 및 LDLR - / - 마우스에 고지방식이를 공급 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR 주사했다 꼬리 정맥 주사를 통해. 대동맥은 24 시간 후에 수확하여 근적외선 형광 이미징으로 평가 하였다. 이미지는 3mm를 나타내는 눈금 막대와 같은 배율이다. 야생형 마우스는 사실상 동맥 석회화 또는 대 식세포의 존재를 나타내지 않는다. LDLR에서 대동맥는 - / - 마우스 - 공동 지역화 대 식세포의 축적과 광범위한 석회화가 있습니다. 한편, MGP - / - 생쥐 대 식세포 침윤의 부재에서 발생 동맥 석회화있다. (B) 대동맥은 야생형에서 수확 하였다 MGP - / - 및 LDLR는 - / - 마우스는 고지방식이를 공급. 이러한 대동맥 절개 및 MAC-2에 특이적인 항체와 대 식세포에 대한 염색 하였다. 핵은 DAPI로 염색 하였다. 내강 표면은 각 패널의 오른쪽을 향해있다. 이미지는 100 μm의를 나타내는 눈금 막대와 세 개의 패널에서 동일한 배율로 촬영되었다. - / - 마우스 (A)의 결과와 유사하게, MGP의 대동맥에서의 대 식세포의 축적의 증거는 없었다. 이 그림은 참고 25에서 그림의 수정 된 버전입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    . 그림 5 : 마우스와 아데노 바이러스는 GFP (A) 또는 MGP (B)를 표현하는 감염 - - / MGP는 석회화에서 배양 된 혈관 평활근 세포를 보호 배양 대동맥 혈관 평활근 세포는 MGP에서 분리되었다. 야생형 마우스로부터 단리 대동맥 혈관 평활근 세포는 MGP (D)에 타겟팅 된 siRNA (C) 또는 스크램블 siRNA를 제어하거나 함께 형질 감염시켰다. 세포는 7 일간 석회화 미디어 (A)에 성장하고 이후 고정 폰 코사 염색 하였다. 200 μm의를 나타내는 스케일 바 - (D A) 이미지는 네 개의 패널에서 동일한 배율로 촬영되었다. 보기의 직렬 분야는 SEM을 나타내는 오차 막대로, 촬영 및 배경 빼기 (E와 F) 후 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 칼슘 염색에 대한 정량화 하였다. 이 그림은 참고 25에서 그림의 수정 된 버전입니다.4017fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 6
    그림 6 :. 이십일일가 훽스트 (Hoechst) 염료를 사용하여 핵 염색으로 확인되었다 체외에서 세포 외 매트릭스와 관련하여 칼슘 NIR 식별 석회화는 (A) 인간의 관상 동맥 혈관 평활근 세포는 석회화 미디어 B에서 배양. 녹색 형광 콜라겐 프로브와 결합 (B) 칼슘 NIR 염색 (빨간색)의 공 초점 현미경으로 얻은 광 섹션은 콜라겐 매트릭스에 걸쳐 석회화 미네랄을 보여줍니다. 이미지 A는 - B는 10 μm의를 나타내는 눈금 막대와 같은 배율로 촬영되었다. (C와 D) 3 차원 복원은 t 내 석회화 미네랄의 함정 수사를 표시그는 매트릭스 콜라겐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    Discussion

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    동맥 석회화는 인간에서 심장 질환의 중요한 위험 인자 및 심혈관 질환의 발병에 직접적으로 기여할 수있다. 죽상 동맥 경화 질환의 얇은 섬유 대문자 1,5,52 내막 칼슘 증착 지역 역학적 스트레스 증가에 기여하는 것이 제안되어왔다 플라크 파열. 심장 비대를 유발하고 심장 기능에 영향을 미칠 수있는 동맥 경화를 증가시켜 53, 54 내측 석회화에 미치는 영향 임상 결과를. (55) 따라서, 인간의 질병에 중요한 통찰력을 제공하고 잠재적에 대한 새로운 목표를 식별 혈관 석회화의 기초 분자 메커니즘을 이해 요법.

    여기서, 동맥 경화증과 석회화와 NIRF 영상을 이용한 혈관 석회화 뮤린 모델에서 대 식세포 축적을 검출하는 방법을 설명한다.도 9는 정확하게 NIR을 주입하는 것이 중요꼬리 정맥에 F 에이전트. 이 지배가 달성되기 전에 상당한 연습을 필요로하는 기술이다. (56) 또한,이 지방 칼슘 NIR 및 카 텝신 동일한 파장에서 autofluorescent 신호를 발생할 수있는 바와 같이, 대동맥에서 요정 대동맥 지방 모두를 제거하는 것이 중요 NIR 신호. NIRF 에이전트의 사용은 혈관 석회화와 염증을 평가하는 표준 조직 학적 방법에 비해 많은 중요한 장점이 있습니다. 종래의 조직 학적 기법과 대조적으로, 이들 제제는 전체 대동맥 석회화 및 대 식세포 침윤의 정량을 허용한다. 또한, 그들은 조직 학적 염색보다 동맥 석회화의 개발과 관련된 초기 변화를 검출하기위한 민감한 방법을 제공하고, 따라서 질병의 초기 단계에 기계적인 통계를 제공 할 수있다. 초기 칼슘 NIR 신호의 사이트가 증가 포함한 골 형성 마커와 연관된 아 알칼리 포스 파타 아제 활성Runx2와 오스테 오 폰틴 유전자 발현 등 리터. 또한, 석회화 및 카 텝신 활동에 대한 스펙트럼 별개의 프로브의 동시 사용은 정량 모두 아테롬성 및 석회화 질환의 시공간 진행의 연결을 가능하게한다. (9)

    혈관 질환의 기본 병태 생리 학적 메커니즘에 대한 우리의 이해에 혈관 석회화와 염증 보조기구의 공간 및 시간 특성을 식별. 예를 들어, NIRF 에이전트의 사용이 보여준 그 내막 석회화의 모델 (아포 E - / -와 LDLR - / - 고지방 다이어트에 쥐), 혈관 대 식세포의 축적의 사이트에 공동-지역화 석회화 (그림 4)와 그 석회화 시간적 식세포의 축적을 따른다. 9,11를 흥미롭게 텝신 NIR 아무런 식세포 축적을 MGP-결핍 마우스에서 발견 내측 혈관 석회화에서 검출되지 않았다. (25)를 목S는 NIRF 제를 이용하는 실험으로부터, 축적 대 식세포가 혈관 내막의 석회화와 연관되어 있지만,이 혈관 내측 석회화를 위해 필요하지 않다고 결론을 내릴 수있다.

    이미징 및 혈관 질환을 연구의 역할과 유사하게, NIRF 영상은 대동맥 판막 질환을 연구하기 위해 이용되고있다. 47 대동맥 판막 질환 밸브에 지질 함유 대 식세포 및 석회화 병변에 의해 표시 및 유사 기본 분자 메커니즘 및 동맥 경화증 등의 유전 적 결정을 전시한다 . 57-59 대동맥 판막 석회화는 전단지 기능의 손상을 야기하고 노인 임상 대동맥 협착증의 주요 원인이다. 증상 대동맥 협착증에 대한 현재 사용할 수있는 유일한 치료는 밸브 교체입니다. 대동맥 판막 질환의 분자 적 메카니즘에 대한 이해는 말기를 프로그레시브 대동맥판 석회화 임상 적 합병증을 방지 할 필요가있다. NI의 활용동물 모델에서 분자 이미징 툴과 같은 RF 에이전트는 초기 단계에서 대동맥 판막 질환을 평가하는 중요한 방법을 제공한다. (60)

    표준 기술은 관상 동맥 플라크가 협착의 정도에 초점을 맞추고있다, 그러나 급성 관상 동맥 증후군의 대부분이 비 흐름 제한 플라크의 파열의 결과 시각화합니다. 염증으로 플라크 내에서 6 생물학적 프로세스를, 플라크 파열의 더 나은 예측의 역할 종래의 이미징 기술에 반대 협착. 61 정도보다 NIRF 촬상 셀룰러 활성 (매트릭스 메탈로 프로테아제 (MMP) 활성 가능 제, 카 텝신 NIR과 단백질 분해 및 elastolytic 활성 즉, 대 식세포 단백질 분해 활성 및 골 형성 촉진 활성을 측정하는 기회를 제공한다 ) 칼슘 NIR에. 9이 방법은 따라서 심혈관 질환의 동시 기능과 해부학 적 평가를 제공합니다. NIRF 이미징 전자를 이용낮은 파장의 광에 비해 증가 된 조직 침투 장점이 650 ~ 900 nm의 범위에서 xcitation 파장, 따라서 질병 병변 큰 깊이 평가를 허용한다. 60도 근처에서 혈관 조직 autofluorescent 배경 신호가 감소 - 적외선 파장 범위. 이 프로토콜은 NIRF 촬상 생체의 사용에 초점을 맞추고 있지만, NIRF 촬상 또한 생체 내에서 길이 분자 이미징에 유용한 플랫폼을 나타낸다. (9) NIRF 이미징은 생체 내에 현미경과 결합 될 때, 인간의 미래의 진단 애플리케이션을 가질 수있다. (61) 그러나, 제한 칼슘 NIR 이미징 종 비스포스포네이트 유래 프로브 자체 석회화 생리적 과정을 변경시킬 수 있다는 것이다. 62

    심장 혈관 석회화는 골 형성 표현형에 혈관 평활근 세포의 분화를 포함 적극적으로 규제 과정이다. 25,41,42 63 게시 유사하고, 생체 외 연구 (그림 5)를 수행하기 위해 쥐의 대동맥 당 세포의 적절한 숫자를 달성했다. 또 다른 나혈관 평활근 세포의 분리를위한 THOD는 효소 소화 아니라 외식 대동맥 반지의 직접적인 문화를 포함하지 않는다; 이 기술은 소화 효소를 이용하는 방법보다 더 적은 세포를 수득하는 것으로보고되었다. 63,64

    두 개의 서로 다른 석회화 미디어, 하나 βGP와 / ASC / DEX 65, 66 또는 NaPhos, 25,43은 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하는 데 사용할 수있는 설명되어 있습니다. 미디어의 두 가지 유형의 동등한 성공 쥐의 혈관 평활근 세포를 석회 성으로 만들다하기 위해 사용되어왔다. 석회화 미디어 βGP / 오름차순을 포함하는 동안 / DEX는 인간의 혈관 평활근 세포 (그림 6) 석회 성으로 만들다하는 데 사용되었습니다, NaPhos를 포함하는 매체는 우리의 경험에 인간의 혈관 평활근 세포를 석회화에 효과가되지 않았습니다. 또한, 21 - 석회화가 발견되기 전에 석회화 미디어 B에 인간의 혈관 평활근 세포의 배양 28 일이 요구 될 수있다. MGP의 발현 수준이 된 siRNA와 calcificati 감소되었을 때 시험 관내 야생형 혈관 평활근 세포의 석회화를 증가시켰다MGP의 감소에 - / - 혈관 평활근 세포를 MGP 표현이 복원 될 때 (그림 5). - / - 이러한 결과는 MGP에서 관찰 된 대동맥 석회화와 일치 마우스 및 혈관 평활근 세포의 석회화이 체외 방법은 생체 내 석회화의 유용한 모델 역할을하는 것이 좋습니다. 이는 혈관 평활근 세포 배양에서 그대로 혈관에 관한 결론을 도출에 제한이 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 배양 된 혈관 평활근 세포는 67-70 혈관 평활근 세포가 석회화 전에 조골 세포 계보에 차별화 않는 미디어를 석회화에서 배양. 유전자 발현 패턴, 형태, 강성의 변화를 개발뿐만 아니라, 특히 높은 구절에서, 자신의 생체 수축 특성을 잃고,하지만 할 수 있습니다 종종 생체 내에서 관찰하는 연골 세포의 중간을 나타낸다. (71) 이는 배양 된 세포에서 도출 기계적인 결론은 생체 시스템에서 검증하는 것이 중요하다. 에이 한계를 극복 전자 잠재적 인 방법은 배양 그대로 용기 링을 사용하여 생체 상태에서 혈관 평활근 세포를 연구하는 것입니다. (70)

    두 가지 방법은 폰 코사 방법 (그림 5) 칼슘 NIR 염색 (그림 6) 배양 된 혈관 평활근 세포의 석회화를 검출되게됩니다. 석회화에 대해 평가하기 위해 자주 사용하지만, 폰 코사 방법은 다소 칼슘 결정에 대한 그것의 감소 특이성에 의해 제한된다. NIR이 느껴진다 (50) 칼슘은 석회화에 대한 구체적 특히 유리하다 할 추가 스펙트럼-별개의 형광 동시 염색을 가능하게한다는 점에서 에이전트. 미래 석회화기구를 정확하게 파악할 수있는 추가의 분자 프로브 칼슘 NIR을 이용한 이러한 프로토콜의 애플리케이션 및 IDE 위해 높은 처리량 방법 VSMC 석회화 소분자 억제제의 신속한 평가를 가능하게 할 수있다혈관 석회화에 대한 ntify 잠재적 인 새로운 치료.

    요약하면, 심장 혈관 석회화는 임상 질환에 중요한 위험 요인과 잠재적 인 기여. 심장 혈관 석회화 및 동맥 경화성 질환의 메커니즘에 대한 지식은 동물 세포 기반 모델 모두에 의존한다. 생체 내, 생체 외생체 외에서 모델에서 석회화를 평가하기위한 방법론은 심혈관 질환에 대한 우리의 이해를 발전하는 것이 중요하다.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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