Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Forkalkning av vaskulære glatte muskelceller og avbildning av Aorta forkalkninger og betennelser

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjerte- og karsykdommer er den ledende årsak til sykelighet og dødelighet i verden, inkludert USA, hvor det står for mer enn 780 000 dødsfall årlig. 1 Koronar forkalkning og aortic forkalkning er kjennetegnene ved aterosklerotisk sykdom og tjene som sterke prediktorer for kardiovaskulære hendelser. 2- 4 To hovedtyper av vaskulære forkalkning er rapportert hos voksne: intima forkalkning, assosiert med aterosklerose, og medial (også kjent som Monckeberg) forkalkning, assosiert med kronisk nyresykdom og diabetes 5 intimaoverflaten forkalkning oppstår i innstillingen av lipid akkumulering og makrofag. infiltrasjon i åreveggen. 5,6 Medial vegg forkalkning oppstår uavhengig av intima forkalkning, lokaliserer til elastin fiber eller glatte muskelceller, og er ikke forbundet med lipid deponering eller makrofag infiltrasjon. 5,7,8 studier på de molekylære mekanismervaskulær forkalkninger har stolt på cellebasert og dyremodellsystemer. Gnagermodeller for atherocalcific sykdom inkluderer mus som mangler enten apolipoprotein E (ApoE) 9,10 eller low-density lipoprotein reseptor (LDLR) 11 matet en fettrik diett, mens modeller for medial forkalkning inkluderer mus med matrix Gla protein (MGP) mangel 12 eller rotter som utvikler uremia enten ved nær total nefrektomi (5 / sjette nefrektomi modell), eller ved eksponering for en høy-adenin diett. 13

Her er modellen av mediale vaskulær forkalkning i forbindelse med MGP mangel fokusert på. MGP er et ekstracellulært protein som inhiberer arteriell forkalkninger. 12 Mutasjoner i MGP-genet er blitt identifisert i Keutel syndrom, en sjelden human sykdom karakterisert ved diffus brusk forkalkning i tillegg til brachytelephalangy, hørselstap, og perifere pulmonalstenose. 14-18 Selv om det ikke er ofte observert, 19konsentriske forkalkning av flere arterier har blitt beskrevet i Keutel syndrom. 20 Felles polymorfismer i menneske MGP-genet er assosiert med økt risiko for koronar forkalkning, 21-23 mens høyere sirkulerende nivåer av uncarboxylated, biologisk inaktivt MGP forutsi kardiovaskulær dødelighet. 24 I motsetning til mennesker med Keutel syndrom, MGP-mangelfull mus utvikler en alvorlig vaskulær fenotype som består av spontan utbredt arteriell forkalkning starter på to uker gamle og dør 6-8 uker etter fødselen på grunn av aorta ruptur. 12

I motsetning til ApoE - / - og LDLR - / - mus foret med en fettrik diett, som utvikles intimal vaskulær forkalkning med tilhørende makrofag-indusert inflammasjon, MGP - / -. Mus utvikler medial vaskulær forkalkning i fravær av makrofagin 11,25 Selv disse funnene tyder ulike underliggende stimuli for intimal og medial forkalkning, det er overlapping i signalmekanismer som formidler begge former for forkalkninger. 26 flere signalveier har blitt identifisert som bidrar til vaskulær forkalkninger inkludert inflammatoriske mediatorer som tumornekrosefaktor-α og IL-1 og pro-osteogene faktorer såsom hakk, Wnt, og benmorfogenetisk protein (BMP) signalering. 27,28 Disse signalveier øke ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer runt relaterte transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) og osterix, som i sin tur øker ekspresjon av ben-relaterte proteiner ( . f.eks osteocalcin, sclerostin, og alkalisk fosfatase) i blodkar som megle forkalkning 28-30 Vi og andre har vist at den vaskulære forkalkning observert i ApoE - / - og LDLR - / - mus matet en fettrik diett og spontan vaskulære forkalkning observert i MGP - / - mus alt avhenge benmorfogenetisk protein (BMP) signaling, og det er denne reaksjonsvei som er fokusert på her. 11,25,31 BMP er potente osteogene faktorer som kreves for bendannelse og er kjent for å utvise økt ekspresjon i humane aterosklerose. 32-34 In vitro-studier har innblandet BMP signalering i regulering ekspresjon av osteogene faktorer som Runx2. 35-37 Overekspresjon av BMP-ligand, BMP-2, akselererer utviklingen av vaskulær forkalkning i ApoE-mangelfulle mus foret med en diett med høyt fettinnhold. 38 Videre, ved bruk av spesifikke BMP signale inhibitorer slike som LDN-193189 (LDN) 39,40 og / eller ALK3-Fc hindrer utvikling av vaskulære forkalkning i begge LDLR - / - mus matet en fettrik diett og MGP-mangelfull mus 11,25.

Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) har en avgjørende rolle i utviklingen av vaskulær forkalkninger. 30,41,42 Den mediale vaskulære forkalkning som utvikler seg i MGP-mangelfull mus er karakterisertsert av en transdifferensiering av VSMCs til en osteogene fenotype. Tap av MGP resulterer i redusert uttrykk for VSMC markører inkludert myocardin og alfa glatt muskulatur aktin, med en samtidig økning i osteogene markører som Runx2 og osteopontin. Disse endringene faller sammen med utviklingen av vaskulær forkalkning. 25,43,44

Aorta forkalkninger og betennelser i mus er vanligvis vurderes å benytte histochemical teknikker som alkalisk fosfatase aktivitet for tidlig forkalkning og osteogene aktivitet, von Kossa og Alizarin rød farging for sent forkalkning, og immunhistokjemiske protokoller som er rettet mot makroproteinmarkører (f.eks., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 imidlertid har disse vanlige avbildningsteknikker krever behandling av aortisk vev i tverrsnitt, noe som er tidkrevende og ufullkommen på grunn av skjevhet prøvetaking, og er begrenset i sin evne til å kvantifisere betennelse og calcification i hele aorta. Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere og kvantifisere hele aorta og mellomstore arteriell kalsifisering og makrofag-akkumuler anvendelse av nær-infrarødt, fluorescent (NIR) molekylær avbildning ex vivo. Også tilveiebrakt er en fremgangsmåte for høsting og dyrking av primære aorta VSMCs fra mus og indusere forkalkning av murine og humane VSMCs in vitro for å bestemme de molekylære mekanismer som ligger til grunn for vaskulær forkalkning. Disse teknikker gir undersøkeren med både in vivo og in vitro metoder for å studere atherocalcific sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle studier med mus ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Bolig og alle prosedyrer som involverer mus som er beskrevet i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komiteer ved Massachusetts General Hospital (Subcommittee på forskning Animal Care). Alle prosedyrer ble utført med forsiktighet for å minimalisere lidelse.

1. Utarbeidelse av reagenser

  1. Nær-infrarød Fluorescens Imaging av Whole Aorta
    Merk: a. Bisfosfonat-avledet, nær-infrarødt, fluorescent avbildning sonde kan benyttes til å markere osteogen aktivitet i vaskulaturen ved binding til hydroksyapatitt 46,47 A cathepsin-aktiverte fluoriserende bilde sonde kan tjene som en markør for makrofag proteolytisk og elastolytic aktivitet i vaskulaturen. 9. for å muliggjøre den samtidige bruk av begge fluorescerende prober, er det viktigå bruke sonder som er spektralt tydelig. Notasjonen kalsium NIR vil bli brukt for å indikere den forkalkning-spesifikke nær-infrarødt, fluorescent avbildning sonde og cathepsin NIR for å indikere den cathepsin aktivitetsspesifikk nær-infrarødt, fluorescent avbildning sonde.
    1. Forbered løsninger av kalsium NIR og cathepsin NIR. Som per produsentens protokoller, tilsett 1,2 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) til hetteglasset med 24 nmol av kalsium NIR eller cathepsin NIR og rist forsiktig.
      Merk: Ifølge produsenten, etter rekonstituering med PBS, kalsium NIR og cathepsin NIR løsninger forbli stabil i 14 dager ved oppbevaring i mørke ved 2-8 ° C.
  2. Isolasjon og Forkalkning av Murine aortic VSMCs
    1. Aortic Fordøyelse Løsning:
      1. Fremstille en frisk oppløsning (~ 3-5 ml pr aorta innhøstet) med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) inneholdende 175 U / ml kollagenase type 2 og 1,25 U / ml elastase. Steriliser løsningen wed et 0,22 um vakuumdrevet filtreringssystem og holde løsningen på is inntil bruk.
    2. Cell Media:
      1. Supplement 500 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Varm media til 37 ° C før bruk.
    3. Forkalkning Media:
      1. Forkalkning Media A (NaPhos anvendt i musecellelinjer):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volum som nødvendig) med 10% føtalt bovint serum, 2 mM natriumfosfat, 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Varm media til 37 ° C før bruk.

          ELLER
      2. Forkalkning Media B (βGP / Asc / DEX, brukes i enten mus eller humane cellelinjer):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volum som nødvendig) med 10% føtalt bovint serum, 10 mM β-glycerofosfat dinatrium, 50 ug / ml L-askorbinsyre, 10nM deksametason, 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Varm media til 37 ° C før bruk.

2. Tail Vein Injection

  1. Før hale injeksjon, varme musene under ett mild varmelampe i 5 min.
  2. Beherske musen i et rør gnager holder. Desinfiser halen med en spritserviett.
  3. Bruk en 30 G nål for halevenen injeksjon. Tail årer er plassert lateralt.
    1. Anvende en svak mengde trykk fremover på sprøyten når nålen er ført inn i halen. Den vene åpnes når motstanden til injeksjonen er ikke lenger til stede.
    2. Injiser et volum på 100 pl av kalsium NIR og / eller 100 ul av cathepsin NIR i en jevn hastighet. Ved slutten av injeksjonen, etter en 5 sek pause, trekke nålen.
  4. Høste Aorta (se avsnitt 3) 3-24 timer etter injeksjon.

3. Mouse Dissection

  • Avlive mus med 200 mg / kg intraperitoneal pentobarbital injeksjon.
  • Lå dyret liggende på disseksjon bord og stabil ved taping hver pote til styret. Ved hjelp av en dissekere mikroskop og liten saks, lage en midtlinjen snitt som strekker seg fra nedre del av magen til den øvre thorax.
  • Skrelle tilbake huden med pinsett og fjern bukhinnen, avslører abdominal organer. Fjern de gastrointestinale organer, tar seg ikke å skjære over hovedpulsåren.
  • Lag en lateral snitt i fremre mellomgulvet og fortsetter snittet over magen. Ved hjelp av disseksjon saks, slipper brystkasse ved å skjære gjennom sidene av ribbene og fjerning av det myke vevet vedheftende til den overlegne delen av brystbenet. Fjern brystkasse, avslører lungene.
  • La hjertet på plass i første omgang (til hjelp i å identifisere og dissekere den proksimale aorta) og forsiktig fjerne lungene. Fjern thymus, luftrøret, og spiserøret med forsiktighet, ensuring at aorta forblir intakt.
  • Bruke rett fin pinsett og mikro-dissekere saks, fjerne det myke vevet rundt aorta fra hoftedelinger til aortabuen, og vær spesielt oppmerksom når du fjerner peri-aorta fett (figur 1A). Fjern de resterende fett og bløtvev rundt de store grener av aortabuen (dvs. brachiocephalic, felles carotis og subclavia arterier, figur 1B).
    Merk: Det er viktig å fjerne fett fra aorta fordi fett kan øke bakgrunnssignalet ved utførelse av fluorescens-avbildning.
  • Ta hjertet fra brysthulen, forsiktig løsne den fra den proksimale aorta, og kast. Transekt distal aorta ved hofte bifurkasjon. Ved hjelp av en nål insulin, injisere normal saltløsning inn i aorta fra aortabuen til å vaske ut gjenværende blodceller. Ta av aorta sammen med aortabuen årene, helt fjerne denfra legemet.
  • Plasser aorta i normal saltløsning på is inntil de er klare for avbildning.
  • 4. aortic Imaging

    1. Bilde Aorta ex vivo umiddelbart etter høsting av nær-infrarød fluorescens refleksjon bildebehandling. 25
      1. Sett fluorescens imager på de aktuelle flerkanals bølgelengder for å kvantifisere fluorescens signal intensiteter fra Aorta kalsium NIR og katepsinaktivitet NIR-injisert mus, som tidligere beskrevet. 25 Ifølge produsenten, kan kalsium NIR bli opphisset av ~ 650-678 nm lys med en maksimal emisjon i ~ 680-700 nm rekkevidde. Cathepsin NIR kan bli opphisset av ~ 745-750 nm lys med en maksimal emisjon på ~ 770 nm.

    5. Isolering av Primary Murine aortic vaskulære glatte muskelceller

    1. Utfør trinn 3,1-3,7 som beskrevet ovenfor.
    2. Plasser Aorta i kaldt HBSS før disseksjoner er fullført. Skjær forsiktig bort noen reminnelukker periaortic fett og mykt vev, slik at bare aorta.
    3. Under et sterilt vev kultur hette, overføre Aorta til aortic Fordøyelse Solution i 35 mm x 10 mm vev kultur retter. Plasser i en inkubator ved 37 ° C i 30 min med mild intermitterende rocking. Etter fordøyelse, de Aorta viser en strukket eller frynsete utseende.
    4. Med disseksjon mikroskop og steril tang, fjerne det ytterste adventitia laget av aorta samtidig som mediale lag intakt. En teknikk for å fjerne adventitia er å skrelle bort det ytterste laget av aorta i den ene enden og fjerne den fra underliggende mediale lag som en sokk kan skrelles tilbake og fjernet.
    5. Når adventitia laget er fjernet, legger de resterende aorta inn i en ny vev kultur tallerken med cellekulturmedier og butikken ved 37 ° C med 5% CO 2 for 2-4 timer.
    6. Under en steril hette og ved hjelp av sterile 3 mm mikro-disseksjon saks, klippe aorta inn 1-2 mm bredringer.
    7. Plasser disse ringer i en ny vevskulturskål med Aorta Fordøyelse løsning og inkuberes ved 37 ° C med forsiktig intermitterende gynge i 120 minutter. Pipettere løsningen opp og ned flere ganger i løpet av denne inkubasjonen å resuspendere cellene.
    8. Tilsett 5 ml varm cellekulturmedier til fordøyelse løsning og overfør til et 15 ml konisk rør.
    9. Sentrifuger røret i 5 min ved 200 x g.
    10. Aspireres media og resuspender cellene i det ønskede volum av cellekulturmedier (f.eks, 5 ml).
    11. Plate hele mengden av isolerte celler fra hver aorta i en 25 cm2 cellekulturkolbe og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2. Forplante celler ved hjelp av standardteknikker, slik som tidligere beskrevet. 25,48 løpet av de første 7-10 dagers inkubasjon, endrer media hver 72-96 timer. Som cellene nærmer samløpet, fylle media oftere (hver 48 timer).
      Merk: Det kan ta mange uker å vokse tilstrekkelig quantity av celler.
    12. Når konfluent, passasje cellene med trypsin som er oppvarmet til 37 ° C.
      1. Legg 0,5-1,0 ml trypsin til hver kultur kolbe og inkuberes i 3-5 min; banke forsiktig på siden av kolben hver 30-60 sekunder etter behov for å løsne cellene fra overflaten.
      2. Når cellene løsner fra bunnen av kolben, tilsett 10 ml av cellemateriale til cellene i trypsin. Sentrifuger cellene ved 200 xg i 5 minutter. Aspireres media og trypsin fra cellepelleten. Resuspender cellene i den ønskede mengde frisk celle media (f.eks 5-10 ml) og overføres til en ny kolbe (med noen celler overføres til et kammer lysbilde).
    13. Ved den første passering av celler, bekrefter den glatte muskelcelle avstamning med standard immunocytokjemi teknikker, som beskrevet tidligere, 49 ved hjelp av et antistoff rettet mot α-glattmuskel aktin.

    6. Inducing Forkalkning av Cultured glatt muskulaturceller

    1. Plate-celler oppnådd fra 5,12 i en 6-brønners format. Merk: Fra og med 1 x 10 5 celler / brønn i et totalt volum på 2,0 ml av cellemateriale per brønn er anbefalt.
    2. Tillate celler å vokse i forkalkning Media A eller B i minst 7 dager i en 6-brønn plate-format. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO2.
    3. Endre celle media hver 48 time.

    7. Vurdere VSMC Forkalkning Bruke von Kossa Farging Method

    Merk:. Den von Kossa fremgangsmåte for måling av ekstracellulær matriks forkalkning av vev eller dyrkede celler er basert på substitusjon av fosfatbundne kalsiumioner med sølvioner 50 I nærvær av lys og organiske forbindelser, er sølv-ioner reduseres og visualiseres som metallisk sølv. Enhver ureagert sølv er fjernet ved behandling med natrium-tiosulfat 50 Protokollen for von Kossa-farging er som følger.:

    1. Sug media fra celle cuLTURE plater.
    2. Fix-celler ved å plassere dem i 1 ml 10% formalin ved romtemperatur i 20 min.
    3. Fjern det formalin og vasker de fikserte celler med destillert vann i 5 minutter.
    4. Inkuber cellene i 1 ml av 5% sølvnitrat-løsning under en 60-100 W lyspære i 1-2 timer.
    5. Aspirer sølvnitratløsningen og vask med destillert vann i 5 minutter.
    6. Fjerne uomsatt sølv ved å plassere cellene i 1 ml 5% natriumtiosulfat (vekt / volum) oppløsning i destillert vann i 5 minutter.
    7. Skyll celler med destillert vann i 5 minutter. Gjenta vasker 3x. Den von Kossa flekken er klar for avbildning med standard invertert lysmikroskopi.
    8. Valgfritt trinn: Counterstain med 1 ml atom fort rød i 5 min. Følg dette med tre vasker med destillert vann (5 min hver).

    ELLER

    8. Vurdere VSMC Forkalkning med nær-infrarødt Fluorescent Imaging

    Merk: I likhet med sin evneå identifisere forkalkning i muse Aorta, kalsium NIR binder lett calcific mineral avsatt av dyrkede celler. Ved hjelp av denne teknikken, fluorescerende mikroskopi og plate leserne med lange bølgelengde filtre kan image og kvantifisere in vitro forkalkning, henholdsvis. Den lange bølgelengde utslipp av kalsium NIR gir mulighet for samtidig utnyttelse av lavere bølgelengdemitterende fluoroforer til å detektere andre funksjoner. Protokollen for kalsium NIR farging er som følger:

    1. Som beskrevet i avsnitt 1.1.1, tilsett 1,2 ml 1x PBS til hetteglasset med 24 nmol av kalsium NIR.
    2. Fortynn kalsium NIR lager 1: 100 i de aktuelle forkalkning eller kontroll medier.
    3. Sug cellemateriale fra kulturplater og erstatte med kalsium NIR-holdige kulturmedier.
    4. Inkuber kulturplatene med kalsium NIR media over natten ved 37 ° C.
    5. Aspirer media fra brønnene og vask brønnene gang med PBS.
      Merk: På dette punktet,den opprinnelige kulturmedier kan bli tilsatt til brønnene, og cellene kan avbildes direkte. Ellers fortsetter du med trinnene nedenfor.
    6. Fix-celler ved å plassere dem i 1 ml 10% formalin ved romtemperatur i 20 min.
    7. Fjern det formalin og vasker de fikserte celler med destillert vann i 5 minutter. Gjenta vasker 3x.
    8. Valgfritt trinn. Utføre immunfluorescens flekker eller andre counterstains for proteiner av interesse 8,9
    9. Bilde eller oppdage kalsium NIR flekken ved hjelp av egnet fluorescens eksitasjonsbølgelengdene (f.eks kan kalsium NIR bli opphisset av 650-678 nm lys) og emisjonsfiltre (~ 680-700 nm).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Aorta forkalkning i MGP - / - og villtype-mus ble målt ved hjelp av billeddannelse av kalsium NIR fluorescens. Ingen kalsium- NIR signal ble detektert i aortaer fra villtype-mus, noe som indikerer fravær av forkalkning (figur 2). En sterk kalsium NIR-signal ble detektert i aortaer fra MGP-manglende mus, noe som er konsistent med avansert vaskulær forkalkning. Vevssnitt av Aorta fra villtype og MGP - / - mus ble farget med Alizarin rød 25 (figur 3A - B), bekrefter den omfattende vaskulære forkalkning observert i MGP-mangelfull mus uten forkalkninger påvist i villtype mus. For å avgjøre om det vaskulære forkalkning i forbindelse med MGP-mangel er avhengig av BMP signalering, MGP - / - mus ble behandlet med LDN, ALK3-Fc, eller kjøretøy som starter på dag 1 av liv. Disse mus ble injisert med kalsium NIR på dag 27 ogAorta ble høstet den påfølgende dagen. Farmakologisk inhibering av BMP signaler redusert aorta forkalkning detektert med kalsium NIR (figur 2). I likhet med funnene med kalsium NIR, de Aorta av LDN- og ALK3-Fc-behandlede MGP - / - mus hadde redusert Alizarin rød flekk for kalsium i forhold til kjøretøybehandlede MGP - / - mus (figur 3B - D). Disse resultatene indikerer at BMP signalering er nødvendig for vaskulær forkalkning observert i MGP - / - mus.

    LDLR - / - mus foret med en fettrik diett utvikle både makrofag betennelse og forkalkning av arterieveggen 11 Samtidig haleveneinjeksjon av calcific og cathepsin-spesifikk NIR sonder i MGP -. / - Mus ble utført for å bestemme om vaskulær forkalkning i MGP -deficiency er forbundet med makrofag-akkumuleringen 25 LDLR -. / - mus tilførtmed høyt fettinnhold og villtype-mus ble anvendt som positive og negative kontroller, respektivt. Aorta fra villtype mus viste nesten ingen kalsium NIR eller cathepsin NIR signal, som forventet (figur 4A). Co-lokalisert kalsium NIR og cathepsin NIR signaler som favoriserte aortabuen region ble observert i LDLR - / - mus, noe som indikerer en sterk sammenheng mellom makrofaginfiltrering og vaskulær forkalkning i denne modellen av intimal aterosklerose. Selv om en diffus og sterk kalsium NIR signal ble observert i Aorta av MGP - / - mus, den cathepsin NIR signal var ikke forskjellig fra den til villtype-mus. Disse funnene tyder på at vaskulær forkalkning i MGP mangel forekommer i fravær av makrofager akkumulering. For ytterligere å bekrefte disse resultater, Aorta fra vill-type, MGP - / -, og LDLR - / - mus ble høstet, seksjonert og farget med et antistoff som er spesifikt for makrofag markør MAC-2 ( - / - mus viste rikelig MAC-to flekker; Det var ingen påvisbar MAC-2 flekker i Aorta i MGP - / - mus, noe som indikerer et fravær av vaskulære makrofager.

    For å modellere vaskulær forkalkning in vitro, ble aorta VSMCs isolert fra villtype og MGP - / - mus og dyrket i høy-fosfat-inneholdende medium, ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor. For å finne ut hvilken rolle MGP i moduler forkalkning av dyrkede VSMCs ble et adenovirus som uttrykker MGP (Ad.MGP) brukes til å gjenopprette MGP i aorta VSMCs fra MGP - / - mus. MGP-manglende VSMCs infisert med adenovirus som uttrykker grønt fluorescerende protein (Ad.GFP) ble anvendt som kontroll. I tillegg, for å bestemme virkningen av å fjerne MGP ekspresjon fra VSMCs ved etterfølgende forkalkning, ble aorta VSMCs fra villtype-mus behandlet med siRNA rettet mot MGP (siMGP) eller tak siRNA (siSC). Forkalkning ble indusert i dyrkede VSMCs ved å dyrke cellene i forkalkning Media A for 7 dager. Celler ble deretter fiksert og farget for kalsium ved hjelp av von Kossa-metoden. Restaurering av MGP med Ad.MGP redusert forkalkning i MGP - / - VSMCs sammenlignet med kontroll adenovirus-behandlede celler (figur 5A - B, E). Behandling av villtype aorta VSMCs med siMGP, noe som resulterer i> 95% knockdown av MGP uttrykk, 25 øket forkalkning i forhold til siSC-behandlede celler (figur 5C - D, F). Disse resultatene indikerer at denne in vitro-modell av VSMC forkalkning etterligner resultatene i MGP-manglende mus og viser at MGP modulerer forkalkning av dyrkede VSMCs.

    En alternativ metode for å påvise forkalkning av dyrkede VSMCs er med kalsium NIR. For å modellere vaskulære forkalkning i v itro, humane koronare arterien VSMCs ble kjøpt og dyrket i 21 dager i media forkalkning B. Etter behandlingsperioden, forkalkning ble identifisert ved anvendelse av kalsium NIR-metoden og kulturene ble motfarget med en tilpasset grønt-fluorescerende kollagen sonde 51 og Hoechst fargestoff (1 ug / ml i 5 minutter etter fiksering i 10% formalin) (figur 6). VSMC kjerner ble observert med blå Hoechst fluorescens ved konfokalmikroskopi (Figur 6A). En representant optiske delen viser kalsium NIR-farget calcific mineral innen kollagen matrise produsert av VSMCs (Figur 6B). Tre-dimensjonale rekonstruksjoner av optiske z-stabler illustrere lag som er opprettet i kultur som VSMCs på bunnen av brønnen produsere et kollagen matriks hvori det avsatte calcific mineralet blir oppfanget (figur 6C - D).

    re en "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    Figur 1:. Representative Disseksjon av en Aorta fra en vill-type mus (A) Et bilde av den torakale og abdominale aorta som strekker seg til den felles bekkenarterie delinger er vist etter fjernelse av de overliggende organer og peri-aorta fett. (B) En fokusert visning av aortabuen med brachiocephalic, venstre felles carotis, og venstre subclavia arterier. Skala barer = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2: Vaskulær forkalkning i MGP - / - mus er avhengig av BMP signale MGP - / - mus ble behandlet med intraperitoneal (ip) injeksjoner av enten ve. kjøretøyet, LDN-193189 (LDN, 2,5 mg / kg / dag), eller ALK3-Fc (2 mg / kg annenhver dag) og villtype mus ble behandlet med ip injeksjoner av kjøretøy som begynner på dag 1 av liv til dag 28 . På dag 27 ble musene injisert med kalsium NIR via halevenen. Aorta ble høstet på dag 28 og avbildes med nær-infrarød fluorescens. Bildene er på samme forstørrelse i alle fire paneler med målestokken som indikerer 3 mm. Villtype mus Aorta viste ikke kalsium NIR-signal mens Aorta fra MGP - / - mus hadde en sterk kalsium NIR signal. Sammenlignet med kjøretøy-behandlet MGP - / - mus, de Aorta av MGP - / - utstilt mus behandlet med enten LDN eller ALK3-Fc betydelig redusert kalsium NIR signaler. Dette tallet er hentet fra referanse 25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    3 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Figur 3: Farmakologisk Hemming av BMP Signaling forhindrer Aorta forkalkning i MGP-manglende mus villtype-mus ble behandlet med ip-injeksjoner av bærer (A) og MGP - / - mus ble behandlet med enten ip-injeksjoner av bærer (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / dag), eller ALK3-Fc (D, 2 mg / kg annenhver dag) som begynner på dag 1 av liv inntil dag 28. Aorta ble høstet, seksjonert og farget for kalsium med Alizarin-rødt. Bilder ble tatt på samme forstørrelse i alle fire paneler med målestokken som indikerer 400 mikrometer. I likhet med kalsium NIR signalene i figur 2, viser Alizarin røde flekker en tung byrde av forkalkning i Aorta av bærer-behandlede MGP - / - mus. Forkalkning er redusert i Aorta av LDN- og ALK3-Fc-behandlet MGP - / - mus. Dette tallet er hentet frareferere 25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    . Figur 4: Samtidig Fastsettelse av Aorta Forkalkning og makrofagin med kalsium NIR og Cathepsin NIR (A) Wild-type, MGP - / - og LDLR - / - mus matet en fettrik diett ble injisert med kalsium NIR og cathepsin NIR via halevenen injeksjon. Aorta ble høstet 24 timer senere, og vurderes med nær-infrarød fluorescens bildebehandling. Bildene er på samme forstørrelse med målestokken som indikerer 3 mm. Villtype mus utviser praktisk talt ingen forkalkning aorta- eller nærvær makrofag. Aortaene fra LDLR - / - mus har omfattende forkalkninger som co-lokaliserer med makrofag akkumulering. I motsetning til dette, MGP - / - Mus har aorta forkalkning som oppstår i fravær av makrofag infiltrering. (B) Aorta ble høstet fra villtype, MGP - / - og LDLR - / - mus matet en fettrik diett. Disse Aorta ble seksjonert og farget for makrofager med et antistoff som er spesifikt for MAC-2. Kjerner ble farget med DAPI. Den lumenal overflate er mot høyre i hvert panel. Bilder ble tatt på samme forstørrelse i alle tre paneler med den målestokk som angir 100 um. I likhet med funnene i (A), var det ingen tegn til makrofag ansamling i Aorta av MGP - / - mus. Dette tallet er en modifisert versjon av en figur fra referanse 25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    .jpg "/>
    . Figur 5: MGP Beskytter Kultur VSMCs fra Forkalkning Kultur aorta VSMCs ble isolert fra MGP - / - mus og infisert med adenovirus uttrykker enten GFP (A) eller MGP (B). Aorta VSMCs isolert fra villtype-mus ble transfektert med enten kontroll egge siRNA (C) eller siRNA målretting MGP (D). Cellene ble dyrket i Forkalkning Media A i 7 dager og deretter fiksert og farget med von Kossa. Bilder ble tatt på samme forstørrelse i alle fire paneler (A - D) med målestokken som indikerer 200 mikrometer. Serie synsfelt ble fotografert og kvantifisert for kalsium flekker ved hjelp av image J programvare etter bakgrunn subtraksjon (E og F), med feilfelt som indikerer SEM. Dette tallet er en modifisert versjon av en figur fra referanse 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6:. Kalsium NIR Identifiserer Forkalkning i forbindelse med den ekstracellulære matrise in vitro (A) Menneskelige koronar VSMCs dyrket i Forkalkning Media B for 21 dager ble identifisert ved nukleær farging hjelp Hoechst fargestoff. (B) En optisk seksjon erholdt ved konfokal mikroskopi av kalsium NIR farging (rød) i kombinasjon med et grønt-fluorescerende probe kollagen viser calcific mineral hele kollagenmatriksen. Bilder fra A - B ble tatt på samme forstørrelse med målestokken som indikerer 10 mikrometer. (C og D) Tredimensjonale rekonstruksjoner viser innfanging av calcific mineral i than kollagen matrise. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Arteriell forkalkning er en viktig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom hos mennesker og kan bidra direkte til patogenesen av kardiovaskulære hendelser. 1,5,52 intima kalsium deponering i tynne fiber caps av aterosklerotisk sykdom har vært foreslått å øke lokal biomekanisk stress og bidra til plakk ruptur. 53,54 Mediale forkalkning konsekvenser kliniske resultater ved å øke arteriell stivhet, som kan forårsake hjertehypertrofi og påvirke hjertefunksjon. 55 Derfor forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn vaskulære forkalkning vil gi viktig innsikt i menneskelig sykdom og potensielt identifisere nye mål for terapi.

    Her er en metode for å detektere aorta forkalkning og makrofag-akkumuleringen i murine modeller av aterosklerose og vaskulær forkalkning anvendelse NIRF avbildning beskrevet. 9. Det er viktig å nøyaktig injisere NIRF midler i halevenen. Dette er en teknikk som krever betydelig praksis før mestring er oppnådd. 56 I tillegg er det viktig å fjerne alt av det peri-aorta fett fra aorta, da dette fett kan føre til en autofluorescent signal ved den samme bølgelengde som kalsium NIR og cathepsin NIR signaler. Anvendelsen av NIRF midler har mange viktige fordeler sammenlignet med standard histologiske metoder for å vurdere vaskulær forkalkning og inflammasjon. I motsetning til konvensjonelle histologiske teknikker, disse midler tillater kvantifisering av hele aorta forkalkning og makrofaginfiltrering. Dessuten gir de en mer sensitiv metode for å detektere tidlige forandringer assosiert med utvikling av aorta forkalkning enn histologisk farging og kan derfor tilby mekanistiske innsikt i tidligere stadier av sykdommen. 9 steder av tidlig kalsium NIR signal er assosiert med markører for bendannelse inkludert øket alkalisk fosfatase aktivitet som well som Runx2 og osteopontin genuttrykk. Videre samtidig bruk av spektralt forskjellige prober for forkalkninger og cathepsin aktivitet muliggjør kvantifisering og forening av tid og rom progresjon av både ateromatøst og calcific sykdom. 9

    Identifisere de romlige og tidsmessige karakteristikker av vaskulære forkalkning og betennelse hjelpemidler i vår forståelse av de underliggende patofysiologiske mekanismer for vaskulær sykdom. For eksempel har bruken av NIRF agenter viste at i modeller av intima forkalkning (ApoE - / - og LDLR - / - mus på en fettrik diett), vaskulær forkalkninger co-lokaliserer til områder av makrofag opphopning (figur 4) og at forkalkning følger akkumulering av makrofager timelig. 9,11 Interessant nok ingen makrofag-akkumuleringen med cathepsin NIR ble detektert i den mediale vaskulær forkalkning funnet i MGP-manglende mus. 25 tos, fra eksperimenter som anvender NIRF midler, kan det konkluderes med at selv om makrofag-akkumuleringen er forbundet med vaskulær intima forkalkning, er det ikke nødvendig for vaskulær medial forkalkninger.

    I likhet med sin rolle i bildebehandling og studere vaskulær sykdom, har NIRF bildebehandling blitt benyttet til å studere aortaklaffen sykdom. 47 aortaklaffen sykdom er preget av lipid-laden makro og forkalkede lesjoner på ventilen og viser tilsvarende underliggende molekylære mekanismer og genetiske determinanter som aterosklerose . 57-59 aortaklaffen forkalkning forårsaker svekkelse av pakningsvedlegget funksjon og er den primære årsaken til klinisk aortastenose hos eldre. Den eneste behandlingen for tiden tilgjengelig for symptomatisk aortastenose er ventil erstatning. En bedre forståelse av de molekylære mekanismer for aortaventilen sykdom er nødvendig for å hindre sent stadium kliniske komplikasjoner som følge av progressiv aorta forkalkninger. Utnyttelse av NIRF-agenter som molekylære tenkelig verktøy i dyremodeller gir en sensitiv metode for å vurdere aortaklaffen sykdom på de tidligste stadier. 60

    Standard teknikker for å visualisere koronar plaque har fokusert på alvorlighetsgraden av stenose, men de fleste av akutte koronarsyndromer resultat av ruptur av ikke-strømnings-begrensende plakk. 6 Biologiske prosesser i plakk, så som betennelse, tjene som bedre indikatorer av plaque ruptur enn den grad av stenose. 61 i motsetning til konvensjonelle avbildningsteknikker, gir NIRF avbildning en mulighet til å måle cellulær aktivitet (dvs. makrofag proteolytisk aktivitet med en matrise-metalloproteinase (MMP) aktiverbart middel, proteolytisk og elastolytic aktivitet med cathepsin NIR, og osteogen aktivitet med kalsium NIR). 9 Denne metoden gir derfor samtidig funksjonell og anatomisk vurdering av hjerte- og karsykdommer. NIRF bildebehandling benytter excitation bølgelengder på 650-900 nm, som har fordelen av øket vevspenetrasjon sammenlignet med lys ved en lavere bølgelengde, noe som tillater en større dybde vurdering av sykdoms lesjoner. 60 Det er også redusert autofluorescent bakgrunnssignal av vaskulært vev i nær -infrared bølgelengdeområde. Selv om denne protokollen fokuserer på bruk av NIRF avbildning ex vivo, NIRF avbildning representerer også en nyttig plattform for langsgående molekylær avbildning in vivo. 9 NIRF avbildning, når kombinert med intravital mikroskopi, kan ha fremtidige diagnostiske anvendelser i mennesker. 61 Imidlertid er en begrensning av kalsium NIR avbildning i lengderetningen, er at den bisfosfonat-avledet probe kan i seg selv forandre den fysiologiske prosess med forkalkning. 62

    Cardiovascular forkalkning er et aktivt regulert prosess som involverer transdifferensiering av VSMCs til en osteogene fenotype. 25,41,42 63 og har oppnådd et tilstrekkelig antall celler pr murine aorta for å utføre in vitro-studier (figur 5). Et alternativ megthod for VSMC isolasjon innebærer ikke enzymatisk fordøyelse, men heller direkte kultur eksplanterte Aortaringene; Denne teknikken har blitt rapportert til å gi færre celler enn den teknikk som benytter enzymatisk oppslutning. 63,64

    To forskjellige forkalkning media, enten med βGP / Asc / DEX 65,66 eller NaPhos, 25,43 beskrives som kan brukes til å indusere forkalkning av VSMCs. Begge typer medier har blitt brukt til å forkalke murine VSMCs med tilsvarende suksess. Mens forkalkning media inneholder βGP / Asc / DEX har blitt brukt til forkalke menneskelige VSMCs (figur 6), har media som inneholder NaPhos ikke vært effektiv i calcifying menneskelige VSMCs i vår erfaring. Videre 21 - kanskje 28 dager med kultur av humane VSMCs i Forkalkning Media B være nødvendig før forkalkning blir oppdaget. Forkalkning av villtype VSMCs in vitro ble økt da uttrykk nivåer av MGP ble redusert med siRNA og calcificatipå ble redusert i MGP - / - VSMCs når MGP uttrykk ble restaurert (figur 5). Disse funn er i overensstemmelse med den aortiske forkalkning observert i MGP - / - mus, og tyder på at denne in vitro-fremgangsmåte for å VSMC forkalkning tjener som en nyttig modell for in vivo forkalkning. Det er viktig å merke seg at det er begrensninger i å trekke konklusjoner angående intakte blodkar fra dyrkede VSMCs. Dyrkede VSMCs kan miste deres in vivo kontraktile egenskaper, særlig ved høyere passasjer, i tillegg til å utvikle endringer i genuttrykksmønster, morfologi og stivhet. 67-70 VSMCs dyrket i media calcifying differensierer til en osteoblastisk avstamning før forkalkning, men ikke gjør viser en chondrocytic mellom som ofte observert in vivo. 71 Det er derfor viktig at mekanistiske konklusjonene fra dyrkede celler valideres i in vivo-systemer. Påe potensiell metode for å overvinne denne begrensningen er å studere VSMCs i deres in vivo tilstand ved hjelp av en kultivert intakt fartøy ring. 70

    To forskjellige metoder er presentert for å detektere forkalkning av dyrkede VSMCs, von Kossa-metoden (figur 5) og kalsium NIR-farging (figur 6). Selv om det brukes ofte for å vurdere for forkalkning, blir von Kossa metode noe begrenset av den reduserte spesifisitet for kalsium krystaller. 50 Kalsium NIR er kjente for å være spesifikk for forkalkning og er særlig fordelaktig ved at det gir mulighet for samtidig farging med ytterligere spektralt-distinkt fluorescerende midler. 9 fremtidige anvendelser av denne protokollen utnytte kalsium NIR med flere molekylære prober kan gi viktig innsikt i mekanismene for forkalkninger og kan muliggjøre rask vurdering av små molekyl hemmere av VSMC forkalkning i en high-throughput måte, for å Identify potensielle nye behandlinger for vaskulær forkalkninger.

    Oppsummert er hjerte- forkalkning en viktig risikofaktor for og potensiell bidragsyter til klinisk sykdom. Kunnskap om mekanismene for hjerte- forkalkning og aterosklerotisk sykdom er avhengig av både dyr og cellebaserte modeller. Metoder for å vurdere forkalkning i in vivo, ex vivo og in vitro modeller er avgjørende for å fremme vår forståelse av hjerte- og karsykdommer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103, (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114, (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291, (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47, (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3, (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119, (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116, (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14, (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31, (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96, (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21, (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24, (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142, (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48, (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9, (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17, (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6, (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55, (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65, (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10, (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4, (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25, (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109, (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97, (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107, (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91, (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23, (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586, (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20, (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283, (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199, (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18, (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19, (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104, (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110, (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89, (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67, (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19, (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115, (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56, (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350, (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99, (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12, (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39, (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312, (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368, (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90, (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108, (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101, (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59, (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308, (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49, (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104, (6), 710-711 (2009).
    Forkalkning av vaskulære glatte muskelceller og avbildning av Aorta forkalkninger og betennelser
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter