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Medicine

Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

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La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo, incluyendo los Estados Unidos, donde es responsable de más de 780.000 muertes al año. 1 calcificación de las arterias coronarias y la calcificación aórtica son características de la enfermedad aterosclerótica y sirven como fuertes predictores de eventos cardiovasculares. 2- 4 Dos tipos principales de la calcificación vascular han sido reportados en adultos: la calcificación de la íntima, asociada con la aterosclerosis, y medial (también conocido como Mönckeberg) calcificación, asociada con la enfermedad renal crónica y diabetes 5 calcificación intimal se produce en el contexto de la acumulación de lípidos y de los macrófagos. infiltración en la pared del vaso. 5,6 calcificación de la pared medial se produce independientemente de la calcificación de la íntima, se localiza en las fibras de elastina o de células musculares lisas, y no está asociada con la deposición de lípidos o la infiltración de macrófagos. 5,7,8 estudios sobre los mecanismos moleculares decalcificación vascular se han basado en sistemas de modelos basados ​​en células y animales. Modelos de roedores para la enfermedad atherocalcific incluyen ratones deficientes en cualquiera de apolipoproteína E (ApoE) 9,10 o receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) 11 alimentados con una dieta alta en grasas, mientras que los modelos de calcificación de la media incluyen ratones con la proteína Gla de la matriz (MGP), la deficiencia 12 o ratas que desarrollan uremia, ya sea por la nefrectomía casi total (el 5 / sexto modelo de nefrectomía) o por exposición a una dieta alta en adenina. 13

Aquí, el modelo de la calcificación vascular medial asociada con la deficiencia de MGP se centra en. MGP es una proteína extracelular que inhibe la calcificación arterial. 12 mutaciones en el gen MGP se han identificado en el síndrome de Keutel, una enfermedad humana rara caracterizada por calcificación del cartílago difusa además de brachytelephalangy, pérdida de audición, y estenosis pulmonar periférica. 14-18 Aunque no se observado a menudo, 19calcificación concéntrica de múltiples arterias se ha descrito en el síndrome Keutel. 20 polimorfismos comunes en el gen MGP humana están asociados con un mayor riesgo para la calcificación de las arterias coronarias, 21-23, mientras que altos niveles circulantes de uncarboxylated MGP, biológicamente inactivo predicen la mortalidad cardiovascular. 24 A diferencia de los seres humanos con el síndrome de Keutel, los ratones con deficiencia de MGP desarrollan un fenotipo vascular severa que consiste en una calcificación arterial generalizada espontánea a partir de las dos semanas de edad y morir 6-8 semanas después del nacimiento debido a la ruptura aórtica. 12

A diferencia de ApoE - / - y LDLR - / - ratones alimentados con una dieta alta en grasas, que se desarrollan calcificación vascular de la íntima con la inflamación inducida por macrófagos asociados, MGP - / -. Ratones desarrollan calcificación vascular medial en ausencia de la infiltración de macrófagos 11,25 Aunque estos hallazgos sugieren diferentes estímulos subyacentes para intimal y la calcificación medial, no hay superposición en los mecanismos de señalización que median en ambas formas de calcificación. 26 vías de señalización múltiples han sido identificados que contribuyen a la calcificación vascular incluyendo mediadores inflamatorios tales como factor de necrosis tumoral-α y la IL-1 y los factores pro-osteogénicas tales como Notch, Wnt, y la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización. 27,28 Estas vías de señalización aumentan la expresión de los factores de transcripción factor de transcripción relacionados con runt-2 (Runx2) y osterix, que a su vez aumentan la expresión de proteínas relacionadas con los huesos ( . por ejemplo, osteocalcina, esclerostina, y fosfatasa alcalina) en la vasculatura que median la calcificación 28-30 Nosotros y otros han demostrado que la calcificación vascular observada en ApoE - / - y LDLR - / - ratones alimentados con una dieta alta en grasas y la espontánea calcificación vascular observada en MGP - / - ratones, todos dependen de la proteína morfogenética ósea (BMP) SIgnaling, y es esta vía que se centra en aquí. 11,25,31 BMP son factores osteogénicos potentes necesarios para la formación de hueso y se sabe que presentan una mayor expresión en la aterosclerosis humana. 32-34 Los estudios in vitro han implicado en la regulación de la señalización de BMP la expresión de factores osteogénicos tales como Runx2. 35-37 la sobreexpresión del ligando BMP, BMP-2, acelera el desarrollo de la calcificación vascular en ratones ApoE deficientes alimentados con una dieta alta en grasas. 38 por otra parte, el uso de inhibidores específicos BMP tales señalización como LDN-193189 (LDN) 39,40 y / o ALK3-Fc impide el desarrollo de la calcificación vascular tanto en LDLR - / - ratones alimentados con una dieta alta en grasas y los ratones con deficiencia de MGP 11,25.

Células del músculo liso vascular (CMLV) tienen un papel crítico en el desarrollo de la calcificación vascular. 30,41,42 La calcificación vascular medial que se desarrolla en MGP ratones deficientes es caracracterizado por una transdiferenciación de CMLV a un fenotipo osteogénico. La pérdida de la MGP en disminución en la expresión de marcadores de CMLV incluyendo miocardina y alfa actina de músculo liso, con el consiguiente incremento de los marcadores osteogénicos tales como la osteopontina y Runx2. Estos cambios coinciden con el desarrollo de la calcificación vascular. 25,43,44

Calcificación de la aorta y la inflamación en los ratones se evalúan típicamente utilizando técnicas histoquímicas tales como la actividad de la fosfatasa alcalina para la calcificación temprana y la actividad osteogénica, von Kossa y alizarina tinción roja para fines de calcificación y protocolos de inmunohistoquímica que se dirigen a los marcadores de proteínas de macrófagos (por ejemplo., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Sin embargo, estas técnicas de imagen estándar requiere el procesamiento de los tejidos aórticos en secciones transversales, que es lento y imperfecta tiempo debido al sesgo de muestreo, y están limitados en su capacidad de cuantificar la inflamación y calcificatION en toda la aorta. Este protocolo describe un método para visualizar y cuantificar toda la calcificación arterial aórtica y medianas y la acumulación de macrófagos utilizando fluorescente del infrarrojo cercano (NIR) de formación de imágenes molecular ex vivo. También se proporciona un método para la recolección y el cultivo de CMLV aórticas primarias de ratones y la inducción de la calcificación de murino y CMLV humanas in vitro con el fin de determinar los mecanismos moleculares que subyacen a la calcificación vascular. Estas técnicas proporcionan el investigador con tanto in vivo y métodos in vitro para el estudio de la enfermedad atherocalcific.

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Protocol

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Se realizaron todos los estudios con ratones en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Vivienda y todos los procedimientos de los ratones descritos en este estudio fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comités del Hospital General de Massachusetts (Subcomité de Investigación Animal Care). Todos los procedimientos se llevaron a cabo con cuidado para minimizar el sufrimiento.

1. Preparación de los reactivos

  1. Infrarrojo Cercano imagen de fluorescencia de Whole aortas
    Nota:. Un bisfosfonato derivados, infrarrojo cercano sonda de imagen fluorescente se puede utilizar para marcar la actividad osteogénica en la vasculatura mediante la unión a la hidroxiapatita 46,47 Una sonda de formación de imágenes fluorescentes catepsina-activado puede servir como un marcador para proteolítica de macrófagos y la actividad elastolítica en . la vasculatura 9 Para permitir el uso simultáneo de ambas sondas fluorescentes, es importanteutilizar sondas que son espectralmente distinta. El calcio notación NIR se utiliza para indicar la sonda de imagen fluorescente y catepsina infrarrojo cercano NIR-calcificación específica para indicar la sonda de imagen fluorescente catepsina específico de la actividad en el infrarrojo cercano.
    1. Preparar las soluciones de calcio y catepsina NIR NIR. De acuerdo con los protocolos del fabricante, añadir 1,2 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS) al vial que contiene 24 nmol de calcio NIR o catepsina NIR y agitar suavemente.
      Nota: Según el fabricante, una vez reconstituido con PBS, las soluciones NIR NIR calcio y catepsina permanecen estables durante 14 días cuando se almacena en la oscuridad a 2-8 ° C.
  2. El aislamiento y la calcificación de las CMLV aórtica murino
    1. Aórtica solución de digestión:
      1. Preparar una solución fresca (~ 3-5 ml por aorta cosechado) con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contenía 175 U / ml de tipo 2 colagenasa y 1,25 U / ml de elastasa. Esterilizar la solución won un sistema de filtración de vacío impulsada por 0,22 micras y mantener la solución en hielo hasta su uso.
    2. Medios Cell:
      1. Suplemento 500 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de comunicación a 37 ° C antes de su uso.
    3. Calcificación de los medios de comunicación:
      1. La calcificación de Medios A (NaPhos, que se utiliza en las líneas celulares de ratón):
        1. Suplemento 100-500 ml de DMEM (volumen según sea necesario) con 10% de suero fetal bovino, fosfato de sodio 2 mM, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de comunicación a 37 ° C antes de su uso.

          O
      2. La calcificación de Medios B (βGP / Asc / DEX; utilizado tanto en líneas celulares humanas o de ratón):
        1. Suplemento 100-500 ml de DMEM (volumen según sea necesario) con suero bovino fetal 10%, disódico 10 mM β-glicerofosfato, / ml de ácido L-ascórbico 50 mg, 10dexametasona nM, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de comunicación a 37 ° C antes de su uso.

2. vena de la cola de inyección

  1. Antes de la inyección de cola, calentar los ratones bajo una lámpara de calentamiento suave durante 5 min.
  2. Restringir el ratón en un soporte de roedores tubo. Desinfectar la cola con un algodón con alcohol.
  3. Utilizar una aguja de 30 G para inyección en vena de cola. venas de la cola están situados lateralmente.
    1. Aplicar una cantidad suave de presión hacia adelante en la jeringa cuando la aguja se introduce en la cola. Se accede a la vena una vez que la resistencia a la inyección ya no está presente.
    2. Inyectar un volumen de 100 l de calcio NIR y / o 100 l de catepsina NIR a un ritmo constante. Al final de la inyección, después de una pausa de 5 segundos, retire la aguja.
  4. Cosechar las aortas (véase la sección 3) 3-24 horas después de la inyección.

3. La disección de ratón

  • La eutanasia del ratón con una inyección de 200 mg / kg intraperitoneal pentobarbital.
  • Coloque la supina animal en la tabla de disección y estabilizar con cinta adhesiva cada pata a la placa. Utilizando un microscopio de disección y tijeras pequeñas, hacer una incisión en la línea que se extiende desde la parte inferior del abdomen a la parte superior del tórax.
  • Pelar la piel con pinzas y retirar el peritoneo, revelando los órganos abdominales. Retire los órganos gastrointestinales, teniendo cuidado de no seccionar la aorta.
  • Haga una incisión lateral en el diafragma anterior y continuar la incisión a través del abdomen. Usando tijeras de disección, suelte la caja torácica cortando a través de los lados de los nervios y eliminando el tejido blando adherente a la parte superior del esternón. Retire la caja torácica, dejando al descubierto los pulmones.
  • Deja el corazón en el lugar inicialmente (a la ayuda en la identificación y disección de la aorta proximal) y retirar con cuidado los pulmones. Retire el timo, tráquea y esófago con cuidado, ensuring de que la aorta se mantiene intacta.
  • El uso de pinzas y tijeras finas recta micro-disección, eliminar el tejido blando que rodea la aorta desde la bifurcación ilíaca al arco aórtico, prestando especial atención al retirar la grasa peri-aórtica (Figura 1A). Retire la grasa y el tejido blando que rodea a los restantes grandes ramas del cayado aórtico (es decir, las arterias, braquiocefálica, carótida común y subclavia, Figura 1B).
    Nota: Es importante eliminar la grasa de la aorta porque la grasa puede aumentar la señal de fondo cuando se realiza imágenes de fluorescencia.
  • Retire el corazón de la cavidad torácica, separando cuidadosamente de la aorta proximal, y desechar. Seccionar la aorta distal a la bifurcación ilíaca. Usando una aguja de insulina, inyectar solución salina normal en la aorta desde el arco aórtico para lavar células sanguíneas restantes. Separar la aorta junto con los vasos del cayado aórtico, eliminando por completodel cuerpo.
  • Coloque la aorta en solución salina normal en hielo hasta que esté listo para la imagen.
  • 4. Imaging aórtica

    1. Aortas Image ex vivo inmediatamente después de la cosecha mediante formación de imágenes de fluorescencia de reflectancia en el infrarrojo cercano. 25
      1. Establecer el generador de imágenes de fluorescencia a las longitudes de onda de múltiples canales apropiados para cuantificar las intensidades de señal de fluorescencia de las aortas de calcio NIR y ratones catepsina NIR-inyectado, como se ha descrito previamente. 25 Según el fabricante, NIR de calcio puede ser excitado por ~ 650-678 nm de luz con una emisión máxima en el rango de 680-700 nm ~. Catepsina NIR puede ser excitado por ~ 745-750 nm de luz con una emisión máxima a ~ 770 nm.

    5. Aislamiento de vasculares de aorta primaria murino células del músculo liso

    1. Realice los pasos 3.1 a 3.7 como se describe anteriormente.
    2. Coloque aortas en HBSS fría hasta que las disecciones se han completado. Corte con cuidado cualquier remaining grasa periaortic y el tejido blando, dejando sólo la aorta.
    3. Bajo una campana de cultivo de tejido estéril, transferir las aortas a la solución de digestión aórtica en 35 mm x 10 mm placas de cultivo de tejidos. Colocar en una incubadora a 37 ° C durante 30 minutos con agitación intermitente suave. Después de la digestión, las aortas exhiben una apariencia estirada o deshilachado.
    4. Con el microscopio de disección y pinzas estériles, eliminar la capa externa de la adventicia de la aorta, manteniendo intacta la capa media. Una de las técnicas para la eliminación de la adventicia es para despegar la capa externa de la aorta en un extremo y sacarlo de la capa media subyacente como un calcetín podría desprendió y se retira.
    5. Una vez que la capa adventicia se ha eliminado, coloque la aorta restantes en una nueva placa de cultivo de tejidos con medios de cultivo celular y se almacena a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2-4 horas.
    6. Bajo una campana estéril y con unas tijeras de disección micro-estériles de 3 mm, cortar la aorta hasta 1-2 mm de anchoanillos.
    7. Coloque estos anillos en una nueva placa de cultivo de tejido aórtico con solución de digestión y se incuba a 37 ° C con suave balanceo intermitente durante 120 minutos. Pipetear la solución hacia arriba y abajo varias veces durante la incubación para volver a suspender las células.
    8. Añadir 5 ml de medio de cultivo celular caliente a la solución de la digestión y la transferencia a un tubo cónico de 15 ml.
    9. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 200 x g.
    10. Aspirar los medios de comunicación y Resuspender las células en el volumen deseado de medio de cultivo celular (por ejemplo, 5 ml).
    11. Placa de la cantidad total de células aisladas de cada aorta en un 25 cm matraz de cultivo de 2 células y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Propagar las células usando técnicas estándar, como se describe anteriormente. 25,48 Durante los primeros 7-10 días de incubación, cambiar los medios de comunicación cada 72 a 96 hr. A medida que las células se aproximan a la confluencia, reponer los soportes con más frecuencia (cada 48 horas).
      Nota: Puede tomar varias semanas para hacer crecer un sine qua suficientesntity de las células.
    12. Una vez confluentes, las células con tripsina de paso que se calienta a 37 ° C.
      1. Añadir 0,5-1,0 ml de tripsina a cada frasco de cultivo y se incuba durante 3-5 minutos; golpee suavemente el lateral del matraz cada 30 a 60 segundos, según sea necesario para separar las células de la superficie.
      2. Una vez que las células se separan de la parte inferior del frasco, añadir 10 ml de medio de células a las células en tripsina. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. Aspirar los medios de comunicación y la tripsina del sedimento celular. Resuspender las células en la cantidad deseada de medio de células fresco (por ejemplo, 5 a 10 ml) y la transferencia a un nuevo matraz (con algunas células transferidas a un portaobjetos de cámara).
    13. En el primero paso de las células, confirmar el linaje de células de músculo liso con técnicas de inmunocitoquímica estándar, como se describe anteriormente, 49 el uso de un anticuerpo dirigido contra actina de músculo α-liso.

    6. Inducción de calcificación de músculo liso cultivadasCélulas

    1. células de la placa obtuvieron a partir de 5,12 en un formato de 6 pocillos. Nota: A partir de las células de 1 x 10 5 / pocillo en un volumen total de 2,0 ml de medio de células por se recomienda también.
    2. Permiten que las células crezcan en la calcificación de Medios A o B durante al menos 7 días en un formato de placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO 2.
    3. Cambio de medio de células cada 48 horas.

    7. Evaluación de VSMC Calcificación Uso de la Kossa tinción von Método

    Nota:. El método de von Kossa para la medición de la calcificación de la matriz extracelular de los tejidos o células cultivadas se basa en la sustitución de los iones de calcio unido a fosfato con los iones de plata 50 En presencia de compuestos ligeros y orgánicos, los iones de plata se reducen y se visualizan como metálico plata. Cualquier plata sin reaccionar se elimina por tratamiento con tiosulfato de sodio 50 El protocolo para la tinción de von Kossa es el siguiente.:

    1. Aspirar los medios de cu celularlture placas.
    2. Fijar las células colocándolos en 1 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Eliminar la formalina y lavar las células fijadas con agua destilada durante 5 min.
    4. Se incuban las células en 1 ml de solución de nitrato de plata 5% bajo una bombilla de 60 a 100 W durante 1-2 horas.
    5. Aspirar la solución de nitrato de plata y lavar con agua destilada durante 5 min.
    6. Retire plata sin reaccionar mediante la colocación de las células en 1 ml de tiosulfato de sodio al 5% de solución en agua destilada durante 5 min (v / w).
    7. Enjuagar las células con agua destilada durante 5 min. Se repite 3 veces lavados. La tinción de von Kossa está listo para la imagen con el microscopio de luz invertida estándar.
    8. Paso opcional: contratinción con 1 ml de rojo nuclear durante 5 minutos. Siga esto con tres lavados con agua destilada (5 min cada uno).

    O

    8. La evaluación de CMLV con calcificación de imagen fluorescente del infrarrojo cercano

    Nota: Al igual que su capacidadpara identificar la calcificación dentro de aortas de ratones, calcio NIR se une fácilmente mineral calcificada depositada por las células cultivadas. Usando esta técnica, microscopía fluorescente y lectores de placas con filtros de longitud de onda larga puede imagen y cuantificar la calcificación in vitro, respectivamente. La larga longitud de onda de emisión del calcio NIR permite la utilización simultánea de fluoróforos que emiten longitud de onda inferior a detectar otras características. El protocolo para el calcio NIR tinción es la siguiente:

    1. Como se describe en la Sección 1.1.1, añadir 1,2 ml de 1x PBS al vial que contiene 24 nmol de calcio NIR.
    2. Diluir el calcio NIR stock 1: 100 en los medios de calcificación o de control apropiadas.
    3. Aspirar medio de células de placas de cultivo y reemplazar con el calcio NIR que contiene medio de cultivo.
    4. Se incuban las placas de cultivo con medios NIR de calcio durante la noche a 37 ° C.
    5. Aspirar los medios de los pocillos y lavar los pocillos una vez con PBS.
      Nota: En este punto,los medios de cultivo original se puede añadieron a los pocillos, y las células se pueden obtener imágenes en vivo. De lo contrario, continúe con los pasos siguientes.
    6. Fijar las células colocándolos en 1 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 min.
    7. Eliminar la formalina y lavar las células fijadas con agua destilada durante 5 min. Se repite 3 veces lavados.
    8. Paso opcional:. Realizar la tinción de inmunofluorescencia u otros contratinciones de proteínas de interés 8,9
    9. Imagen o detectar la mancha NIR de calcio utilizando longitudes de onda de excitación de fluorescencia apropiada (por ejemplo, calcio NIR puede ser excitado por la luz 650-678 nm) y filtros de emisión (~ 680-700 nm).

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    Representative Results

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    Calcificación aórtica en MGP - / - y de tipo salvaje ratones se midió utilizando imágenes de fluorescencia NIR calcio. No se detectó señal NIR calcio en las aortas de ratones de tipo salvaje, que indica la ausencia de calcificación (Figura 2). Se ha detectado una señal de calcio NIR fuerte en las aortas de los ratones con deficiencia de MGP, lo cual es consistente con la calcificación vascular avanzada. Las secciones de tejido de aortas de tipo salvaje y MGP - / - ratones se tiñeron con rojo de alizarina 25 (Figura 3A - B), lo que confirma la extensa calcificación vascular observado en ratones con deficiencia de MGP sin calcificación detectada en los ratones de tipo salvaje. Para determinar si la calcificación vascular asociada con la deficiencia de MGP es dependiente de la señalización de BMP, MGP - / - ratones fueron tratados con LDN, ALK3-Fc, o vehículo empezando en el día 1 de la vida. Estos ratones fueron inyectados con calcio NIR en día 27 yaortas se recogieron al día siguiente. La inhibición farmacológica de la señalización de BMP reduce la calcificación aórtica detectado con calcio NIR (Figura 2). De manera similar a los hallazgos con calcio NIR, las aortas de LDN- y ALK3-tratadas-Fc MGP - / - ratones se habían reducido alizarina mancha roja de calcio en comparación con los tratados con vehículo MGP - / - ratones (Figura 3B - D). Estos resultados indican que se requiere la señalización de BMP para la calcificación vascular observada en MGP - / - ratones.

    LDLR - / - ratones alimentados con una dieta alta en grasas desarrollar tanto la inflamación de los macrófagos y la calcificación de la pared arterial 11 de inyección en vena de cola simultánea de calcificada y catepsina específica sondas NIR en pop -. / - Ratones se realizó para determinar si la calcificación vascular de Pop -deficiency se asocia con la acumulación de macrófagos 25 LDLR -. / - ratones alimentadosun alto ratones de la dieta y de tipo salvaje de grasa se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Aortas de ratones de tipo salvaje mostraron prácticamente ninguna señal de calcio o NIR NIR catepsina, como se esperaba (Figura 4A). Calcio y NIR NIR catepsina señales co-localizada que favorecieron la región arco aórtico se observaron en el LDLR - / - ratones, lo que indica una fuerte asociación entre la infiltración de macrófagos y la calcificación vascular en este modelo de aterosclerosis de la íntima. Aunque se observó una señal difusa y NIR fuerte calcio en las aortas de MGP - / - ratones, la señal de la catepsina NIR no era diferente de la de los ratones de tipo salvaje. Estos hallazgos indican que la calcificación vascular en la deficiencia de MGP se produce en ausencia de la acumulación de macrófagos. Para confirmar estos hallazgos, aortas de tipo salvaje, MGP - / -, y LDLR - / - ratones se recogieron, se seccionaron, y se tiñeron con un anticuerpo específico para el marcador de macrófagos MAC-2 ( - / - ratones demostraron abundante MAC-2 tinción; no había detectable MAC-2 tinción en las aortas de MGP - / - ratones, lo que indica una ausencia de macrófagos vasculares.

    Para modelar la calcificación vascular in vitro, CMLV aórticos fueron aislados de tipo salvaje y MGP - / - ratones y se cultivan en alta fosfato que contiene medios de comunicación, usando el protocolo descrito anteriormente. Para determinar el papel de MGP en la modulación de la calcificación de las CMLV en cultivo, se utilizó un adenovirus que expresa MGP (Ad.MGP) para restaurar MGP en CMLV de aorta de MGP - / - ratones. CMLV MGP deficientes infectadas con un adenovirus que expresa la proteína verde fluorescente (Ad.GFP) se utilizaron como control. Además, para determinar el efecto de la eliminación de la expresión de MGP de CMLV en la calcificación subsiguiente, las CMLV de la aorta de los ratones de tipo salvaje se trataron con siRNA dirigido contra MGP (siMGP) o control siRNA (SISC). La calcificación se indujo en CMLV en cultivo por cultivo de las células en la calcificación de medios A durante 7 días. Las células se fijaron y se tiñeron posteriormente para el calcio utilizando el método de von Kossa. Restauración de pop con Ad.MGP reduce la calcificación de MGP - / - CMLV en comparación con las células control tratadas con adenovirus (Figura 5 A - B, E). El tratamiento de tipo salvaje CMLV de aorta con siMGP, lo que resulta en> 95% desmontables expresión de pop, de 25 años aumentó la calcificación en comparación con las células tratadas con SISC (Figura 5C - D, F). Estos resultados indican que este modelo in vitro de calcificación imita CMLV los resultados en ratones con deficiencia de MGP y demuestra que la MGP modula la calcificación de las CMLV en cultivo.

    Un método alternativo para la detección de calcificación de las CMLV en cultivo es con calcio NIR. Para modelar la calcificación vascular en v itro, CMLV de las arterias coronarias humanas se adquirieron y se cultivaron durante 21 días en la calcificación de Medios B. Tras el periodo de tratamiento, la calcificación se identificó utilizando el método NIR calcio y los cultivos fueron contrastados con una sonda personalizada verde fluorescente colágeno 51 y el colorante Hoechst (1 g / ml durante 5 min después de la fijación en formalina al 10%) (Figura 6). Núcleos CMLV se observaron con azul de fluorescencia Hoechst por microscopía confocal (Figura 6A). Una sección óptica representativa muestra mineral calcificada manchado-NIR de calcio dentro de la matriz de colágeno producido por el CMLV (Figura 6B). Reconstrucciones tridimensionales de z-pilas ópticas ilustran las capas creadas en cultivo como las CMLV de la parte inferior del pozo producir una matriz de colágeno en el que el mineral calcificada depositado queda atrapado (Figura 6C - D).

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    Figura 1:. Representante disección de una aorta de un ratón de tipo salvaje (A) Una imagen de la aorta torácica y abdominal se extiende hasta la bifurcación de la arteria ilíaca común se representa después de la eliminación de los órganos superpuestos y grasa peri-aórticos. (B) Una vista del arco aórtico se centró con la braquiocefálico, arteria carótida común izquierda, y la arteria subclavia izquierda. Las barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2: La calcificación vascular en MGP - / - ratones depende de la señalización de BMP MGP - / - ratones fueron tratados con intraperitoneal (ip) inyecciones de cinco. ratones hículo, LDN-193189 (LDN, 2,5 mg / kg / día), o ALK3-Fc (2 mg / kg cada dos días) y de tipo salvaje fueron tratados con inyecciones ip de vehículo comenzando el día 1 de la vida hasta el día 28 . en el día 27, los ratones fueron inyectados con NIR de calcio a través de la vena de la cola. Aortas se recogieron el día 28 y la imagen con fluorescencia en el infrarrojo cercano. Las imágenes son con el mismo aumento en los cuatro paneles con la barra de escala indica 3 mm. De tipo salvaje aortas de ratones no mostraron calcio señal NIR mientras aortas de MGP - / - ratones tenían una señal de NIR de calcio fuerte. En comparación con los tratados con vehículo MGP - / - ratones, las aortas de MGP - / - ratones tratados con LDN o ALK3-Fc redujo significativamente exhibieron señales NIR de calcio. Esta cifra se ha tomado de referencia 25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Figura 3: farmacológica La inhibición de la calcificación aórtica BMP señalización Previene en ratones MGP deficientes en ratones de tipo salvaje fueron tratados con inyecciones ip de vehículo (A) y MGP - / - ratones fueron tratados con inyecciones ip de vehículo (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / día), o ALK3-Fc (D, 2 mg / kg cada dos días) comenzando el día 1 de la vida hasta el día 28. Las aortas se cosecharon, seccionadas y teñidas para el calcio con rojo de alizarina. Las imágenes fueron tomadas con el mismo aumento en los cuatro paneles con la barra de escala indica 400 micras. Similar a las señales NIR de calcio en la Figura 2, la tinción con rojo de alizarina demuestra una pesada carga de la calcificación en las aortas de MGP tratado con vehículo - / - ratones. / - - Ratones MGP calcificación disminuye en las aortas de LDN- y ALK3-Fc-tratada. Esta cifra se ha tomado dereferencia 25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    . Figura 4: Determinación simultánea de calcificación aórtica y macrófagos de infiltración con calcio NIR y catepsina NIR (A) de tipo salvaje, MGP - / -, y LDLR - / - ratones alimentados con una dieta alta en grasas se inyectaron con calcio NIR y catepsina NIR mediante inyección en la vena de la cola. Aortas se cosecharon 24 horas más tarde y se evaluaron con imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano. Las imágenes son con la misma ampliación con la barra de escala indica 3 mm. los ratones de tipo salvaje exhiben prácticamente ninguna calcificación aórtica o la presencia de macrófagos. Las aortas de LDLR - / - ratones tienen calcificación extensa que co-localiza con la acumulación de macrófagos. Por el contrario, MGP - / - Ratones han calcificación aórtica que se produce en ausencia de la infiltración de macrófagos. (B) Las aortas fueron cosechadas a partir de tipo salvaje, MGP - / -, y LDLR - / - ratones alimentados con una dieta alta en grasas. Estos aortas se seccionaron y se tiñeron para los macrófagos con un anticuerpo específico para MAC-2. Los núcleos se tiñeron con DAPI. La superficie luminal es hacia la derecha en cada panel. Las imágenes fueron tomadas con el mismo aumento en los tres paneles con la barra de escala indica 100 micras. Similar a los resultados en (A), que no había evidencia de la acumulación de macrófagos en las aortas de MGP - / - ratones. Esta figura es una versión modificada de una figura de referencia 25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    . Figura 5: MGP Protege CMLV cultivadas de calcificación CMLV aórticas cultivadas fueron aisladas de MGP - / - ratones y se infectaron con adenovirus que expresan GFP (A) o MGP (B). CMLV de aorta aislados de ratones de tipo salvaje fueron transfectadas con cualquiera de los controles revueltos siRNA (C) o siRNA dirigidos MGP (D). Las células fueron cultivadas en la calcificación de medios A durante 7 días y posteriormente se fijaron y se tiñeron con von Kossa. Las imágenes fueron tomadas con el mismo aumento en los cuatro paneles (A - D) con la barra de escala indica 200 micras. Campos de serie de vista fueron fotografiados y cuantificados para la tinción de calcio utilizando software de imagen J después de la sustracción del fondo (E y F), con barras de error indican la SEM. Esta figura es una versión modificada de una figura de referencia 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 6
    Figura 6:. El calcio NIR Identifica calcificación en asociación con la matriz extracelular in vitro (A) CMLV de las arterias coronarias humanas cultivadas en la calcificación de Medios B durante 21 días fueron identificadas por tinción nuclear utilizando colorante Hoechst. (B) Una sección óptica obtenida por microscopía confocal de la tinción de NIR de calcio (rojo) en combinación con una sonda de colágeno verde fluorescente muestra mineral calcificada por toda la matriz de colágeno. Imágenes de A - B fueron tomadas con la misma ampliación con la barra de escala indica 10 micras. (C y D) reconstrucciones tridimensionales muestran el atrapamiento de mineral calcificada dentro de tque la matriz de colágeno. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

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    La calcificación arterial es un importante factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular en los seres humanos y puede contribuir directamente a la patogénesis de los eventos cardiovasculares. Se ha propuesto 1,5,52 depósito de calcio en la íntima de las delgadas cubierta fibrosa de la enfermedad aterosclerótica para aumentar el estrés biomecánico local y contribuir a ruptura de la placa. 53,54 calcificación medial impactos resultados clínicos mediante el aumento de la rigidez arterial, lo que puede inducir hipertrofia cardiaca y afectar la función cardíaca. 55 por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la calcificación vascular proporcionará información importante sobre las enfermedades humanas y potencialmente identificar nuevos objetivos para terapia.

    Aquí, se describe un método para detectar la calcificación aórtica y la acumulación de macrófagos en modelos murinos de la aterosclerosis y la calcificación vascular utilizando formación de imágenes NIRF. 9 Es crítico para inyectar con precisión el NIRagentes F en la vena de la cola. Esta es una técnica que requiere una práctica considerable antes de que se alcanza la maestría. 56 Además, es importante para eliminar toda la grasa peri-aórtica de la aorta, como esta grasa puede causar una señal autofluorescente en la misma longitud de onda que el calcio NIR y catepsina señales NIR. El uso de agentes NIRF tiene muchas ventajas importantes sobre los métodos histológicos estándar de evaluación de la calcificación vascular y la inflamación. En contraste con las técnicas histológicas convencionales, estos agentes permiten la cuantificación de la calcificación aórtica conjunto y la infiltración de macrófagos. Además, proporcionan un método más sensible para detectar cambios tempranos asociados con el desarrollo de la calcificación aórtica que la tinción histológica y por lo tanto pueden ofrecer conocimientos sobre mecánica en etapas tempranas de la enfermedad. 9 Sitios de señal NIR calcio temprana están asociados con marcadores de formación ósea incluyendo una mayor la actividad de la fosfatasa alcalina como well como expresión Runx2 y osteopontina gen. Por otra parte, el uso simultáneo de sondas espectralmente distintas para la calcificación y la actividad de la catepsina permite la cuantificación y la asociación de la progresión espacio-temporal de dos enfermedad ateromatosa y calcificada. 9

    La identificación de las características espaciales y temporales de la calcificación vascular e inflamación ayudas en nuestra comprensión de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de la enfermedad vascular. Por ejemplo, el uso de agentes NIRF ha demostrado que en los modelos de la calcificación de la íntima (ApoE - / - y LDLR - / - ratones con una dieta alta en grasas), calcificación co-localiza a los sitios de acumulación de macrófagos vascular (Figura 4) y que la calcificación sigue la acumulación de macrófagos temporalmente. 9,11 Curiosamente, no acumulación de macrófagos con catepsina NIR se detectó en la calcificación vascular medial encontrado en ratones MGP-deficientes. 25 jue.s, a partir de experimentos que utilizan agentes NIRF, se puede concluir que a pesar de la acumulación de macrófagos se asocia con calcificación de la íntima vascular, no es necesario para la calcificación vascular medial.

    De manera similar a su papel en la formación de imágenes y el estudio de la enfermedad vascular, formación de imágenes NIRF se ha utilizado para estudiar la enfermedad de la válvula aórtica. 47 enfermedad de la válvula aórtica está marcada por lesiones de macrófagos y calcificación cargados de lípidos en la válvula y presenta mecanismos moleculares subyacentes similares y los determinantes genéticos como la aterosclerosis . 57-59 calcificación de la válvula aórtica causa deterioro de la función de la lámina y es la principal causa de la estenosis aórtica clínica en los ancianos. El único tratamiento disponible actualmente para la estenosis aórtica sintomática es el reemplazo de la válvula. Es necesario un mejor entendimiento de los mecanismos moleculares de la enfermedad de la válvula aórtica para evitar que la fase tardía de complicaciones clínicas de la calcificación de la válvula aórtica progresiva. La utilización de NIAgentes de RF como herramientas de imagen molecular en modelos animales proporciona un método sensible para la evaluación de la enfermedad de la válvula aórtica en sus primeras etapas. 60

    Las técnicas estándar para visualizar las placas de las arterias coronarias se han centrado en la gravedad de la estenosis, sin embargo, la mayoría de los síndromes coronarios agudos el resultado de la ruptura de placas sin flujo limitativo. 6 Los procesos biológicos dentro de placas, tales como la inflamación, sirven como mejores predictores de la ruptura de la placa que el grado de estenosis. 61 a diferencia de las técnicas de imagen convencionales, formación de imágenes NIRF proporciona una oportunidad para medir la actividad celular (es decir, la actividad proteolítica de macrófagos con una metaloproteinasa de matriz (MMP) agente activable, la actividad proteolítica y elastolytic con catepsina NIR, y la actividad osteogénica con NIR de calcio). 9 Este método, por tanto, proporciona una evaluación funcional y anatómica simultánea de la enfermedad cardiovascular. NIRF de imágenes utiliza correolongitudes de onda xcitation en el rango de 650 a 900 nm, que tiene la ventaja de una mayor penetración en el tejido en comparación con la luz a una longitud de onda más baja, permitiendo así una mayor evaluación en profundidad de las lesiones de la enfermedad. 60 También se reduce autofluorescent señal de fondo del tejido vascular en la cerca infrarrojo de longitud de onda. Aunque este protocolo se centra en el uso de NIRF de imágenes ex vivo, las imágenes NIRF también representa una plataforma útil para formación de imágenes molecular longitudinal en vivo. De formación de imágenes 9 NIRF, cuando se combina con microscopía intravital, puede tener aplicaciones de diagnóstico futuros en los seres humanos. 61 Sin embargo, una limitación de las imágenes NIR de calcio en sentido longitudinal es que la sonda bisfosfonato derivado puede alterar el propio proceso fisiológico de la calcificación. 62

    Calcificación cardiovascular es un proceso regulado de forma activa que consiste en la transdiferenciación de las CMLV a un fenotipo osteogénico. 25,41,42 63 y ha alcanzado un número suficiente de células por aorta murino para llevar a cabo estudios in vitro (Figura 5). Una alternativa míthod para el aislamiento CMLV no implica la digestión enzimática, sino más bien el cultivo directo de los anillos aórticos explantados; esta técnica se ha descrito para producir un menor número de células que la técnica de la utilización de la digestión enzimática. 63,64

    Dos medios de calcificación diferentes, ya sea con βGP / Asc / DEX 65,66 o NaPhos, 25,43 se describen que se puede utilizar para inducir la calcificación de las CMLV. Ambos tipos de medios de comunicación se han utilizado para calcificar CMLV murinos con éxito equivalente. Mientras que los medios de comunicación que contiene la calcificación βGP / Asc / DEX se ha utilizado para calcificar CMLV humanas (Figura 6), los medios de comunicación que contiene NaPhos no ha sido eficaz en la calcificación de las CMLV humanas en nuestra experiencia. Por otra parte, 21 - 28 días de cultivo de CMLV humanas en la calcificación de Medios B pueden ser requeridos antes de detectar la calcificación. Calcificación de las CMLV de tipo salvaje in vitro se incrementó cuando los niveles de expresión de MGP se redujeron con siRNA y calcificatien se redujo en MGP - / - CMLV cuando la expresión MGP se restauró (Figura 5). Estos hallazgos son consistentes con la calcificación aórtica observada en MGP - / - ratones y sugieren que este método in vitro de VSMC calcificación sirve como un modelo útil de la calcificación in vivo. Es importante señalar, sin embargo, que hay limitaciones en la elaboración de conclusiones con respecto a los vasos sanguíneos intactos de CMLV en cultivo. CMLV en cultivo pueden perder sus propiedades contráctiles en vivo, sobre todo en los pasajes más altos, además de desarrollar cambios en los patrones de expresión génica, la morfología y la rigidez. 67-70 CMLV cultivaron en la calcificación de los medios de comunicación no diferenciar a un linaje osteoblástico antes de la calcificación, pero no lo hacen exhibir un intermedio chondrocytic que se observa a menudo en vivo. 71 es por lo tanto importante que las conclusiones extraídas de mecanicistas células cultivadas ser validados en sistemas in vivo. Ene método potencial de superar esta limitación es el estudio de CMLV en su estado in vivo usando un anillo de recipiente intacto cultivadas. 70

    Dos métodos diferentes se presentan para la detección de calcificación de las CMLV en cultivo, el método de von Kossa (figura 5) y la tinción NIR de calcio (Figura 6). Aunque se utiliza con frecuencia para evaluar la calcificación, el método de von Kossa está algo limitada por su reducida especificidad para cristales de calcio. 50 Calcio NIR se siente que es específica para la calcificación y es particularmente ventajosa ya que permite la tinción simultánea con fluorescente espectralmente distinta adicional agentes. 9 aplicaciones futuras de este protocolo utilizando NIR de calcio con sondas moleculares adicionales pueden proporcionar importantes conocimientos sobre los mecanismos de calcificación y pueden permitir la rápida evaluación de inhibidores de molécula pequeña de la calcificación de las CMLV en una forma de alto rendimiento, para identify potenciales nuevas terapias para la calcificación vascular.

    En resumen, la calcificación cardiovascular es un factor de riesgo importante para el contribuyente y el potencial de la enfermedad clínica. El conocimiento de los mecanismos de calcificación cardiovascular y la enfermedad aterosclerótica se basa tanto en los modelos basados ​​en células animales y. Metodologías para evaluar la calcificación in vivo, ex vivo e in vitro modelos son fundamentales para avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades cardiovasculares.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación
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    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

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