הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח
Summary
פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.
Abstract
הקלטה כל תא מהדק תיקון היא טכניקה אלקטרו המאפשרת חקר את התכונות החשמליות של חלק ניכר של הנוירון. בתצורה זו, את micropipette נמצא בקשר הדוק עם קרום התא, אשר מונע דליפה נוכחית ובכך מספק מדידות זרם יוניות מדויקות יותר מאשר שיטת הקלטת אלקטרודה חד התאית השתמשה בעבר. קלאסי, הקלטה כל תא יכול להתבצע על נוירונים בסוגים שונים של ההכנות, כולל דגמים תרבית תאים, נוירונים ניתק, נוירונים פרוסות המוח, בבעלי חיים שלמים בהרדמה או ער. לסיכום, טכניקה זו תרמה מאוד להבנת מאפייני biophysical פסיביים ואקטיביים של תאים להתרגש. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא בכך שהוא מספק מידע על איך מניפולציות ספציפיות (למשל, תרופתית, הנסיין נגרמת פלסטיות) רשאיות לשנות פונקציות עצביות ספציפיות או גhannels בזמן אמת. בנוסף, פתיחה משמעותית של קרום הפלזמה מאפשרת פתרון פיפטה הפנימי לפזר בחופשיות לתוך הציטופלסמה, מתן אמצעים לתרופות מציגות, למשל, אגוניסטים או אנטגוניסטים של חלבונים תאיים ספציפיים, מניפולצית מטרות אלה מבלי לשנות את תפקידיהן תאי שכנים. מאמר זה יתמקד הקלטה כל התא מבוצע על נוירונים פרוסות מוח, הכנה כי יש את היתרון של קלטת הנוירונים מעגלים עצביים במוח השתמרות טובה יחסית, כלומר, בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בפרט, כאשר הוא משולב עם פרמקולוגיה מתאים, טכניקה זו היא כלי רב עצמה המאפשר זיהוי של neuroadaptations הספציפי שאירע לאחר כל סוג של חוויות, כגון למידה, חשיפה לתרופות של התעללות, ומתח. לסיכום, כל תא הקלטות תיקון- clamp פרוסות המוח לספק אמצעים למדוד כהכנה vivo לשעבר שינויים ארוכי טווחבפונקציות עצביות שהתפתח חיות ערות ללא פגע.
Introduction
טכניקת תיקון- clamp, טכניקת אלקטרו אשר פותחה בסוף שנתי ה -1970 1,2, היא כלי עיקרי ללימוד פונקציות ערוץ יון בודדים או מספר רבות של רקמת חיה. בין תצורות תיקון השונות שניתן להשיג, כל תא הקלטות תיקון- clamp לאפשר בחקר ההתנהגות החשמלית של חלק ניכר של הנוירון. קלאסי, טכניקה זו מבוצעת במבחנה או על פרוסות המוח, נוירונים ניתק טרי, או על מודלים תרבית תאים 3. כאשר מבוצע על נוירונים פרוסות המוח, טכניקה זו מציגה מספר יתרונות. בפרט: (i) נוירונים נרשמים מעגלים במוח נשמרו יחסית כי במידה מסוימת, ולעומת הכנות תרבית תאים, לספק סביבה כי היא פיזיולוגית 3 רלוונטית. זה מאפשר לכיד מוקדם, או אפילו ניטור בזמן אמת, אירועים תאיים ומולקולריים שמופעלים על ידי כל סוג של pharmacolog החריפהמניפולציות iCal – החלטה זמנית כי לא יכול להיות מושגת באמצעות קלסי בתנאי vivo; (ii) יכולת לזהות באופן ויזואלי איזורים במוח אצל פרוסות מוח מאפשרת סגולי תיכון אזורי 3 הם באזור המוח למד נוירונים ספציפיים כשהם מבטאים סמני ניאון; (iii) גישה למרחב התאי של התא על ידי פתיחת חלק ניכר של קרום הפלזמה (בניגוד ניקוב הקרום עם micropipette חדה להקלטות תאיות) 4. לעומת זאת, זה מאפשר את התוכן או הריכוז של יונים ספציפיים להלחין הפתרון הפנימי להיות שונה כל כך מטרות מולקולריות או מנגנונים תאיים ניתן ללמוד בתנאים שונים. לדוגמה, על הקמת תצורה כל תא, כל סוכן תרופתי ספציפי (למשל, אנטגוניסטים) כי אחד יכול להוסיף את micropipette הקלטה (פיפטה תיקון) פתרון יהיה מפוזר ישירות לתוך הציטופלסמה ולפעול על putat שלהive מטרות תאיות מבלי לשנות את פונקצית יעד תאי שכנים. בנוסף, לעומת הקלטת micropipette חדה, הפתיחה הגדולה בקצה האלקטרודה מהדק תיקון מספקת התנגדות נמוכה, פחות רעש מתחרות, ולכן גישת חשמל טובה יותר לחלק הפנימי של התא 4. עם זאת, יש לציין כי הפתח הגדול בקצה פיפטה עלול להוביל דיאליזת תא, ובכך אובדן המנגנון מולקולרי תאי שעשויה להיות קריטי עבור הביטוי של התופעות הביולוגיות שאינן תחת 5,6 מחקר. במקרה זה, הקלטות אלקטרודה חד עשויות להיות מתאימות יותר. סוג זה של הקלטות דורש micropipettes עם נקבוביות כי הוא הרבה יותר מאלו המשמשים להקלטות כל תא, ובכך למנוע את רוב חילוף היונים בין שטח תאיים הפתרון פיפטה הפנימי.
כל צורה של ניסיון (אקוטי או כרוני), כולל לימוד 7-10, חשיפה לתרופות של התעללות 11,12, מתח 13,14, וכו ', יכול לשנות היבטים שונים של תפקוד עצבי באזורי מוח ספציפיים. בגלל שינויים אלה לעתים קרובות דורשים זמן לפתח (שעות עד ימים), כל תא הקלטות פרוסות מוח מחיות שעברו חוויה ספציפית מאפשרות לחוקרים לזהות את השינויים האלה. בעיקרון, רב (אם לא כל) רכיבים להשתתף פונקציות עצביות (למשל, תעלות יונים המופעל ליגנד, תעלות יונים מגודרות מתח, מובילי הנוירוטרנסמיטר), ובכך מוח מעגל פעילות והתנהגות, ניתן לשנות על ידי ניסיון (ניסיון תלוי פלסטיות) 10,15-17. ברמה העצבית, פעילות במעגל המוח עולה מן האינטראקציות מתמידות בין הסינפטי (למשל, העברת גלוטמט) וגורם רגישות הסלולר מהותית (למשל, תעלות יונים הדנדריטים-axosomato: נתרן, Na +; אשלגן, K +; וסידן, Ca 2 + ). בתנאים ספציפיים באמצעות וולדואר התא תיקון- clamp טכניקות אלקטרו, שינויי אות שמקורם במיוחד משינויים הרגישים מהותי לעומת הסינפטי יכול להיות מבודד.
ברוב המקרים, רגישות הסינפטי נבחנת באמצעות טכניקת מתח- clamp כל התא. מצב הקלטה זה מאפשר מדידה של זרמי יון [למשל, בתיווכו של קולטני חומצת α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic ( קולטני AMPA) ואת הקולטנים חומצה N-Methyl-D-אספרטית (קולטני NMDA)] דרך הממברנה פלזמה העצבית תוך כדי לחיצה על פוטנציאל הממברנה במתח סט. הנה, הנסיינים להשתמש בפתרונות micropipette פנימיים המכילים צזיום (Cs +), חוסם רחב של K + ערוצים (גורמים רגישים מהותיים מפתח). עם הקמתה של תצורה כל תא, דיפוזיה של Cs + בחלל תאי תחסום K + ערוצים, ובכך תאפשר גם מהדק שטח יעיל יחסית וטרוםלפרוק השפעת הגורמים רגישים מהותיים על מדידות אחרות. סוגיות שטח מהדק, כלומר, קושי מתח- clamp התא כולו, להתעורר בעת הקלטת תאים בצורה סדירה (למשל, נוירונים), ובמיוחד נוירונים עם הדנדריטים עצומים ומורכב סוכת 18,19. כיוון שבקרות גרועות מהדק מתח סומטיים מתח בעץ הדנדריטים של נוירונים, היבטים שונים של אותות חשמליים הדנדריטים נחקרים מעוותים באופן מרחק תלויה הדנדריטים. בשילוב עם כלים תרופתיים כגון (חומצת גמא-aminobutyric, GABA אנטגוניסט לקולטן) picrotoxin או חומצת kynurenic (חוסם רחב של קולטני גלוטמט) מומסים הפתרון התאי (נוזל מלאכותי שדרת Cerebro, ACSF), טכניקה זו מאפשרת המדידה של גלוטמט receptor- ו GABA A R בתיווך זרמים בהתאמה.
לעומת זאת, רגישות מהותית בדרך כלל נבחנת במצב הקלטה הנוכחית מהדקת.בניגוד הקלטת מתח- clamp, מצב הקלטה זו מאפשר המדידה של וריאציות פוטנציאלי קרום המושרים על ידי זרמי יון זורמים דרך קרום התא העצבי. בדרך כלל, שינוי ב רגישות מהותית נבחן באמצעות שינויי יכולת נוירונים כדי ליצור פוטנציאל פעולה, מחייב הוא Na + ו- K + ערוצים. לכן, בעת ביצוע הקלטות מהדק הנוכחי, micropipettes מלא פתרון פנימי המכיל K + במקום Cs +. בשילוב עם סוכנים תרופתיים החוסמות גלוטמט GABA A זרמי קולטן בתיווך מומס ACSF, תכנון הניסוי הזה מאפשר מדידת התרומה של גורמים פנימיים (למשל, K + ערוצים) כדי ירי עצבי מבלי מזוהם שינויים פוטנציאליים רגיש הסינפטי גורמים.
מאמר זה יתאר את השלבים פרוצדורליים צורך בסיסי to (i) להכין פרוסות מוח בריאות; (Ii) להשיג תצורת כל תא, וכן (iii) לפקח פרמטרים בסיסיים להעריך הסינפטי רגיש מהותי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את ההליך הבסיסי ביצוע ניסויים תיקון- clamp כל תא על נוירונים פרוסות המוח. עם זאת, המורכבות, הפוטנציאל והרגישות של הטכניקה הזו לא יכולים להיות מתוארת בצורה מושלמת במאמר זה. הנה, יש לנו ניסינו להתוות את הצעדים הבסיסיים ביותר מדגיש פרמטרים חשובים חייבים לה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי קרנות ההפעלה Southwestern UT (SK).
Materials
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4-H20, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H20, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , (2013).
- Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
- Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
- Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
- Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
- McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
- Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
- Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
- Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
- Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. Plasticity of inhibition. Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).
- Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
- Defelice, L. J. . Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , (1997).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
- Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
- Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
- Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
- Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
- Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).
