Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Summary

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Abstract

Whole-cell patch-clamp de gravação é uma técnica electrofisiológico que permite o estudo das propriedades eléctricas de uma parte substancial do neurónio. Nesta configuração, a micropipeta está em contacto apertado com a membrana celular, o que evita a fuga de corrente e, assim, fornece medições mais precisas corrente iónica do que o método de gravação eléctrodo afiado intracelular previamente utilizado. Classicamente, a gravação de células inteiras pode ser realizada sobre os neurónios em vários tipos de preparações, incluindo modelos de cultura celular, os neurónios dissociados, neurónios em fatias de cérebro e em animais anestesiados intactos ou acordado. Em resumo, esta técnica tem imensamente contribuído para a compreensão das propriedades biofísicas passivas e activas das células excitáveis. Uma importante vantagem desta técnica é que ele proporciona informação sobre a forma específica manipulações (por exemplo, farmacológico, plasticidade induzida pelo experimentador) podem alterar ou C funções neuronais específicashannels em tempo real. Além disso, a abertura significativa da membrana plasmática permite que a solução da pipeta interna para difundir livremente no citoplasma, proporcionando meios para a introdução de medicamentos, por exemplo, agonistas ou antagonistas de proteínas intracelulares específicos, e manipular esses alvos, sem alterar as suas funções em células vizinhas. Este artigo incidirá sobre gravação de célula inteira executada em neurónios em fatias de cérebro, uma preparação que tem a vantagem de gravação de neurónios no cérebro circuitos relativamente bem conservados, isto é, num contexto fisiologicamente relevante. Em particular, quando combinado com farmacologia disso, esta técnica é uma ferramenta poderosa que permite a identificação de neuroadaptações específicas que ocorreram na sequência de qualquer tipo de experiências, como a aprendizagem, a exposição a drogas de abuso, e stress. Em resumo, as gravações de células inteiras de patch-clamp em fatias de cérebro fornecer meios para medir em ex vivo de preparação de mudanças de longa duraçãoem funções neuronais que se desenvolveram em animais acordados intactas.

Introduction

A técnica de patch-clamp, uma técnica eletrofisiológica que tem sido desenvolvido no final de 1970 ^1,2, é a principal ferramenta para o estudo de funções de canal de iões simples ou múltiplas no tecido vivo. Entre as diferentes configurações de patch que podem ser obtidos, gravações de célula inteira de patch-clamp permitir o estudo do comportamento eléctrico de uma parte substancial do neurónio. Classicamente, esta técnica é realizada in vitro, quer em fatias de cérebro, os neurónios dissociados de fresco, quer em modelos de cultura de células ^3. Quando realizada em neurônios em fatias de cérebro, esta técnica apresenta várias vantagens. Em particular: (i) os neurónios são registados nos circuitos do cérebro relativamente conservadas que, em certa medida, e em comparação com as preparações de cultura de células, proporcionam um ambiente que é fisiologicamente relevante ^3. Isto permite a captura precoce, ou mesmo de monitoramento em tempo real, eventos celulares e moleculares que são acionados por qualquer tipo de pharmacolog agudamanipulações iCal – uma resolução temporal que não pode ser conseguido usando clássica em condições in vivo; (ii) capacidade de identificar visualmente as regiões do cérebro em fatias de cérebro permite alta especificidade regional ^3, tanto para a região do cérebro estudada e para os neurônios específicos quando eles expressam marcadores fluorescentes; (iii) o acesso ao espaço intracelular da célula através da abertura de uma parte significativa da membrana de plasma (em contraste com a perfuração da membrana com uma micropipeta afiado para gravações intracelulares) ^4. Por sua vez, isto permite que o conteúdo ou concentração de iões específicos que constituem a solução interna de ser modificado de modo alvos moleculares ou mecanismos celulares pode ser estudada em condições diferentes. Por exemplo, ao estabelecer a configuração de célula inteira, qualquer agente farmacológico específico (por exemplo, antagonistas) que se pode adicionar ao micropipeta de gravação (remendo pipeta) solução difundirá directamente para o citoplasma e agir sobre a sua Putative alvos intracelulares, sem alterar a função alvo em células vizinhas. Além disso, em comparação com a gravação micropipeta afiada, a grande abertura na ponta do eléctrodo de patch clamp proporciona uma resistência mais baixa, menos ruído concorrentes, e, assim, um melhor acesso eléctrico para o interior da célula ^4. No entanto, note que o da grande abertura na ponta da pipeta podem levar a célula de diálise, e, assim, a perda da maquinaria molecular intracelular que pode ser crítico para a expressão dos fenómenos biológicos que estão sob ^5,6 estudo. Neste caso, as gravações de eléctrodos afiadas pode ser mais adequado. Este tipo de gravações requer micropipetas com uma poro que é muito menor do que os utilizados para as gravações de células inteiras, evitando deste modo a maior parte da permuta iónica entre o espaço intracelular e a solução da pipeta interna.

Qualquer forma de experiência (aguda ou crónica), incluindo a aprendizagem ^7-10, exposição a drogas de abuso ^11,12, o stress ^13,14, etc, pode alterar diversos aspectos da função neuronal em regiões específicas do cérebro. Porque estas alterações, muitas vezes exigem tempo para se desenvolver (horas ou dias), gravações de célula inteira em fatias de cérebro de animais que tenham sido submetidos a uma experiência específica permitir aos pesquisadores identificar essas mudanças. Basicamente, muitos (se não todos) os componentes que participam de funções neuronais (por exemplo, canais iónicos activados por ligandos, canais de iões dependentes da voltagem, transportadores de neurotransmissores), e assim a actividade circuito cerebral e comportamento, pode ser alterada por experiência (experiência-dependente plasticidade) ^10,15-17. A nivel neuronal, a actividade circuito cerebral surge a partir de interacções constantes entre sináptica (por exemplo, glutamato) de transmissão e os factores de excitabilidade celular intrínseco (por exemplo, canais iónicos axosomato-dendrítica: de sódio, Na ^+, potássio, K ^+, e de cálcio, Ca ²⁺ ). Sob condições específicas, utilizando whole de células de patch-clamp técnicas electrofisiológicas, alterações de sinal específica das alterações na excitabilidade sináptica vs intrínseca pode ser isolado.

Na maioria dos casos, a excitabilidade sináptica é avaliada utilizando a técnica de tensão-grampo de célula inteira. Este modo de gravação permite a medição de correntes de iões [por exemplo, mediados por receptores do ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ( os receptores de AMPA) e receptores de N-metil-D-aspártico (NMDA)] receptores através da membrana plasmática neuronal, enquanto que prendem o potencial de membrana a uma voltagem conjunto. Aqui, os experimentadores usar soluções internas micropipeta que contêm césio (Cs ^+), um bloqueador ampla de canais de K ⁺ (principais fatores de excitabilidade intrínsecas). Após o estabelecimento da configuração de célula inteira, a difusão de Cs ⁺ no espaço intracelular irá bloquear os canais de K ^+, e, assim, vai permitir que ambos um espaço relativamente eficiente e pré-braçadeiradesabafar influência de fatores intrínsecos excitabilidade sobre outras medidas. Questões de espaço-clamp, ou seja, a dificuldade de tensão-clamp toda a célula, surgem quando a gravação de células irregular em forma (por exemplo, neurônios), e particularmente neurônios com um dendrítica vasto e complexo Arbor ^18,19. Por causa da braçadeira de tensão somática controles mal tensão na árvore dendrítica de neurônios, vários aspectos de sinais elétricos dendríticas em estudo são distorcidos de uma forma dendrítica dependente da distância. Combinado com ferramentas farmacológicas tais como picrotoxina (ácido gama-aminobutírico, o GABA _Um antagonista do receptor) ou ácido quinur�ico (largo bloqueador de receptores de glutamato) dissolvido na solução extracelular (fluido cérebro-espinal artificial, ACSF), esta técnica permite a medição de glutamato receptor- e correntes de GABA _A R-mediada, respectivamente.

Em contraste, a excitabilidade intrínseca é normalmente avaliado em modo de gravação actual-clamp.Ao contrário de gravação voltagem-grampo, este modo de gravação permite a medição de variações no potencial de membrana induzidas por correntes de iões que fluem através da membrana plasmática neuronal. Normalmente, a alteração na excitabilidade intrínseca é avaliado através de alterações na capacidade de neurônios para gerar potenciais de ação, o que requer Na ⁺ e canais de K ^+. Portanto, quando se realiza gravações de corrente-clamp, micropipetas são preenchidos com uma solução interna que contém K ⁺ em vez de Cs ^+. Combinados com agentes farmacológicos que bloqueiam a glutamato e GABA _A correntes mediadas pelo receptor dissolvidos em ACSF, este delineamento experimental permite a medição da contribuição de factores intrínsecos (por exemplo, canais de K ⁺⁾ para o disparo neuronal sem serem contaminados por potenciais alterações na excitabilidade sináptica factores.

Este artigo irá descrever as etapas básicas necessárias processuais to (i) preparar fatias cerebrais saudáveis; (Ii) obter uma configuração de célula inteira, e (iii) monitorar os parâmetros básicos para avaliar sináptica e excitabilidade intrínseca.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a UT Southwestern, e foram escolhidos de modo a minimizar o estresse, desconforto e dor experimentada pelos animais experimentais. 1. Soluções Nota: Preparar soluções internas micropipeta com antecedência. Para a maioria dos fins experimentais básicas, dois tipos de soluções deve ser suficiente: CS + baseada e K + soluções baseadas. Use…

Representative Results

Temperatura, um fator que é facilmente controlada pelo experimentador, influencia as propriedades biofísicas de canais iônicos e receptores, e, assim, a forma de onda de correntes pós-sinápticas (PSCs) (EPSC e iPSCs) e a capacidade dos neurônios para provocam picos. Figura 3 e a Figura 4 mostram o efeito da temperatura sobre o disparo neuronal e a inclinação da EPSCS evocados (eEPSCs), respectivamente. O padrão de disparo (Figura 3)</str…

Discussion

Este protocolo descreve o procedimento básico para a realização de experiências de célula inteira de patch-clamp em neurónios em fatias de cérebro. No entanto, a complexidade, o potencial e sensibilidade desta técnica não pode ser totalmente descrito neste artigo. Aqui, tentamos delinear os passos mais básicos e sublinhado parâmetros importantes que devem ser controlados para alcançar gravações de células inteiras de sucesso e rigorosos. Para mais aprendizado teórico, muitos livros e artigos foram public…

Materials

Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4-H20, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H20, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375