Summary
Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.
Abstract
Whole-cell enregistrement patch-clamp est une technique électrophysiologique qui permet l'étude des propriétés électriques d'une partie substantielle du neurone. Dans cette configuration, la micropipette est en contact étroit avec la membrane cellulaire, ce qui empêche les fuites de courant et fournit ainsi des mesures de courant ionique plus précis que la méthode d'enregistrement de l'électrode utilisée précédemment intracellulaire forte. Classiquement, l'enregistrement de cellules entières peut être effectuée sur des neurones dans divers types de préparations, y compris les modèles de culture cellulaire, les neurones, les neurones dissociés dans des tranches de cerveau, et chez des animaux anesthésiés éveillés ou intacts. En résumé, cette technique a grandement contribué à la compréhension des propriétés biophysiques passives et actives de cellules excitables. Un avantage majeur de cette technique est qu'elle fournit des informations sur la façon spécifique manipulations (par exemple, pharmacologique, expérimentateur induite par la plasticité) peuvent altérer les fonctions ou c neuronales spécifiqueshannels en temps réel. En outre, l' ouverture importante de la membrane plasmique permet à la solution de pipette interne de se diffuser librement dans le cytoplasme, en fournissant des moyens pour médicaments en introduisant, par exemple, des agonistes ou des antagonistes des protéines intracellulaires spécifiques, et la manipulation de ces cibles , sans altérer leurs fonctions dans les cellules voisines. Cet article se concentrera sur l' enregistrement de cellules entières effectuées sur les neurones dans des tranches de cerveau, une préparation qui présente l'avantage d'enregistrer les neurones dans les circuits du cerveau relativement bien conservés, à savoir, dans un contexte physiologique pertinent. En particulier, lorsqu'il est combiné avec la pharmacologie appropriée, cette technique est un outil puissant permettant d'identifier neuroadaptations spécifiques qui se sont produits après tout type d'expériences, telles que l'apprentissage, l'exposition aux drogues d'abus, et le stress. En résumé, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp en tranches de cerveau fournissent des moyens pour mesurer des changements durables ex vivo préparationdans les fonctions neuronales qui ont développé chez les animaux éveillés intacts.
Introduction
La technique de patch-clamp, une technique électrophysiologique qui a été développé à la fin des années 1970 1,2, est un outil essentiel pour l' étude des fonctions simples ou multiples canaux ioniques dans les tissus vivants. Parmi les différentes configurations de raccordement qui peuvent être atteints, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp permettent l'étude du comportement électrique d'une partie substantielle du neurone. Classiquement, cette technique est réalisée in vitro , soit sur des coupes de cerveau, les neurones fraîchement dissociées, ou sur des modèles de culture cellulaire 3. Quand elle est réalisée sur des neurones dans des tranches de cerveau, cette technique présente plusieurs avantages. En particulier: (i) neurones sont enregistrés dans les circuits du cerveau relativement conservées que dans une certaine mesure, et comparées à des préparations de culture cellulaire, fournissent un environnement qui est physiologiquement pertinente 3. Ceci permet la capture précoce, ou même le suivi en temps réel, les événements cellulaires et moléculaires qui sont déclenchées par tout type de pharmacolog aiguëmanipulations iques - une résolution temporelle qui ne peut être réalisé en utilisant classique dans des conditions in vivo; (ii) la capacité d'identifier visuellement les régions du cerveau dans des tranches de cerveau permet une haute spécificité régionale 3 fois pour la région du cerveau étudié et pour les neurones spécifiques quand ils expriment des marqueurs fluorescents; (iii) l' accès à l'espace intracellulaire de la cellule par l' ouverture d' une partie importante de la membrane du plasma (contrairement à la perforation de la membrane avec une micropipette forte pour les enregistrements intracellulaires) 4. À son tour, cela permet à la teneur ou la concentration en ions spécifiques qui composent la solution interne à modifier les cibles moléculaires ou si les mécanismes cellulaires peuvent être étudiés dans des conditions différentes. Par exemple, lors de l' établissement configuration cellule entière, tout agent pharmacologique spécifique (par exemple, des antagonistes) que l' on peut ajouter à la micropipette d'enregistrement (patch pipette) solution directement diffuse dans le cytoplasme et agir en son putative cibles intracellulaires, sans altérer la fonction cible dans les cellules voisines. En outre, par rapport à l' enregistrement de micropipette forte, la grande ouverture à la pointe de l'électrode de patch-clamp offre une résistance plus faible, moins de bruit en concurrence, et donc un meilleur accès électrique à l'intérieur de la cellule 4. Toutefois, notez que la grande ouverture à la pointe de la pipette peut conduire à une dialyse cellulaire, et donc la perte de machinerie moléculaire intracellulaire qui peut être critique pour l'expression des phénomènes biologiques qui sont à l'étude 5,6. Dans ce cas, les enregistrements d'électrodes pointus peuvent être plus appropriés. Ce type d'enregistrement nécessite des micropipettes avec des pores qui est beaucoup plus petite que celles utilisées pour l'enregistrement de cellules entières, empêchant ainsi la majeure partie de l'échange d'ions entre l'espace intracellulaire et la solution de pipette interne.
Toute forme d'expérience (aiguë ou chronique), y compris l' apprentissage 7-10, l' exposition aux drogues 11,12, le stress 13,14, etc., peuvent modifier divers aspects de la fonction neuronale dans des régions spécifiques du cerveau. Parce que ces modifications nécessitent souvent le temps de développer (heures à quelques jours), des enregistrements de cellules entières dans des tranches de cerveau provenant d'animaux qui ont subi une expérience spécifique permettent aux chercheurs d'identifier ces changements. Fondamentalement, beaucoup (sinon la totalité) des composants qui participent à des fonctions neuronales (par exemple, les canaux ioniques activés par des ligands, des canaux ioniques voltage-dépendants, les transporteurs de neurotransmetteurs), et ainsi l' activité des circuits cérébraux et de comportement, peuvent être modifiés par l' expérience (dépendant de l' expérience plasticité) 10,15-17. Au niveau neuronal, l' activité des circuits cérébraux émerge des interactions constantes entre synaptique (par exemple, la transmission du glutamate) et les facteurs intrinsèques de l' excitabilité cellulaire (par exemple, les canaux ioniques axosomato-dendritique: sodium, Na +, potassium, K +, et de calcium, Ca 2+ ). Dans des conditions spécifiques en utilisant whole-cell patch-clamp techniques électrophysiologiques, des altérations de signaux provenant spécifiquement des changements de rapport synaptique excitabilité intrinsèque peut être isolé.
Dans la plupart des cas, l' excitabilité synaptique est évaluée en utilisant la technique de voltage-clamp à cellules entières. Ce mode d'enregistrement permet la mesure des courants ioniques [par exemple, médiée par des récepteurs d'acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique ( récepteurs AMPA) et des récepteurs N-méthyl-D-aspartique (récepteurs NMDA)] à travers la membrane plasmique des neurones tout en maintenant le potentiel de membrane à une tension de consigne. Ici, les expérimentateurs utilisent les solutions internes de micropipette qui contiennent du césium (Cs +), un large bloqueur des canaux K + (facteurs clés de l' excitabilité intrinsèques). Lors de l' établissement de la configuration de cellule entière, la diffusion de Cs + dans l' espace intracellulaire , bloque les canaux K +, et ainsi permettra à la fois un espace de serrage et de pré relativement efficacevent influence des facteurs d'excitabilité intrinsèques sur d'autres mesures. Questions Espace-clamp, à savoir la difficulté de voltage-clamp toute la cellule, se posent lors de l' enregistrement des cellules de forme irrégulière (par exemple, les neurones), et en particulier les neurones avec un dendritique vaste et complexe tonnelle 18,19. Parce que somatique de verrouillage de tension de contrôle mal la tension dans l'arbre dendritique des neurones, les divers aspects de signaux électriques dendritiques à l'étude sont déformées d'une manière dépendant de la distance dendritique. Combinés avec des outils pharmacologiques telles que la picrotoxine (acide gamma-aminobutyrique, le GABA Un antagoniste des récepteurs) ou de l' acide kynurénique (large bloqueur des récepteurs du glutamate) dissous dans la solution extracellulaire (liquide céphalo-rachidien artificiel, ACSF), cette technique permet la mesure du glutamate et un récepteur - GABA R-médiée courants , respectivement.
En revanche, l'excitabilité intrinsèque est généralement évaluée en mode d'enregistrement en cours-clamp.Par opposition à l'enregistrement voltage-clamp, ce mode d'enregistrement permet de mesurer les variations de potentiel de membrane induite par des courants d'ions circulant à travers la membrane plasmique des neurones. En règle générale, la modification de l'excitabilité intrinsèque est évaluée par des changements dans la capacité des neurones à générer des potentiels d'action, ce qui nécessite à la fois Na + et K canaux +. Par conséquent, lors de l' exécution des enregistrements de courant de serrage, les micropipettes sont remplies avec une solution interne qui contient K + au lieu de Cs +. Combinés avec des agents pharmacologiques qui bloquent le glutamate et le GABA A courants médiés par les récepteurs dissous dans le ACSF, ce modèle expérimental permet la mesure de la contribution des facteurs intrinsèques (par exemple, des canaux K +) à la décharge neuronale sans être contaminé par des changements potentiels de l' excitabilité synaptique facteurs.
Cet article décrit les étapes de la procédure de base nécessaires to (i) préparer des tranches de cerveau en bonne santé; (Ii) réaliser la configuration de cellule entière, et (iii) de surveiller les paramètres de base pour évaluer synaptique et excitabilité intrinsèque.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux UT Southwestern, et ont été choisis de manière à minimiser le stress, l'inconfort et la douleur ressentie par les animaux de laboratoire.
1. Solutions
Note: Préparer des solutions internes de micropipette à l'avance. Pour la plupart des fins expérimentales de base, deux types de solutions devraient suffire: des solutions à base de Cs + à base et K +.
- Solutions à base Utiliser Cs + (par exemple, solution Cs + gluconate, voir Matériaux) pour des expériences voltage-clamp. Préparer à la température ambiante.
- Préparer une solution 117 mM de gluconate Cs en mélangeant 4,62 g d'acide D-gluconique (~ 3,696 ml) avec du CsOH 3,54 g (~ 2,01 ml).
- Ajouter ddH 2 O à 90 ml et laisser équilibrer pendant 30 min.
- Ajouter les ingrédients solides (HEPES 20 = 0,476 g; mM EGTA 0,4 = 15,2 mg; mM NaCl 2,8 = 16,4 mg; 5 mM de tétraéthylammonium (TEA) Chlorure = 83 mg).
- Ajouter ddH 2 O à ~ 97 ml.
- Ajuster le pH de la solution à 50% de CsOH à 7/2 au 7/3.
- Vérifiez osmolarité et corriger si nécessaire avec ddH 2 O.
Remarque: Une bonne gamme est ~ 280-285 mOsm. osmolarité optimale devrait être 15 - 20 mOsm ci-dessous l'osmolarité du ACSF standard (généralement 300-310 mOsm, 300 mOsm dans notre laboratoire). Osmolarité peut varier en fonction des solutions des compositions spécifiques. - Aliquote à 1000 pi et conserver à -20 ° C ou moins.
- Préparer, aliquote, geler, et ajouter ATP / GTP à la solution interne le jour de l'enregistrement.
- Ajouter 64,63 mg ATP à 10 mg GTP et dissoudre dans 637.11 ul de ddH 2 O.
- Préparer 10 aliquotes et conserver à -20 ° C ou moins. Mélanger chaque aliquote 100x avec 1000 ul d'une solution interne, le jour de l'expérience. Une fois que l'ATP / GTP est ajouté à la solution interne, la maintenir sur de la glace pour empêcher degradati ATP / GTPsur.
- Solutions à base Utiliser K + (par exemple, la solution K-gluconate, voir Matériaux) pour les deux expériences courant et de tension-clamp où K + conductances restent fonctionnels de telle sorte que la décharge neuronale peut être évaluée. Préparer à la température ambiante.
- Peser tous les matériaux en fonction du volume final désiré. Pour la préparation de 90 ml de solution, 120 mM de K-gluconate = 2,81 g; 20 mM de KCl = 0,149 g; 10 mM HEPES = 0,238 g; 0,2 mM d'EGTA = 0,008 g; 2 mM de MgCl2 = 0,021 g.
- Utiliser suffisamment ddH 2 O pour atteindre 90% du volume final de la solution. Cela devrait veiller à ce que suffisamment de place est laissée pour le pH et l'ajustement de l'osmolarité.
- Après addition et mélange tous les ingrédients, assurez-vous que la solution est limpide avant de mesurer le pH.
- Tout en agitant constamment la solution, ajuster le pH à 7,2 à 7,3 en utilisant K + hydroxyde (KOH).
- Après ajustement du pH, utilisez le osmomètre et adjuste osmolarité à 280-285 mOsm.
Remarque: osmolarité optimale devrait être 15 - 20 mOsm ci-dessous l'osmolarité du ACSF standard (généralement 300-310 mOsm, 300 mOsm dans notre laboratoire). Osmolarité peut varier en fonction des solutions des compositions spécifiques. - Aliquote à 1000 pi et conserver à -20 ° C ou moins.
- Préparer, aliquote, geler, et ajouter ATP / GTP à la solution interne le jour de l'enregistrement (voir étape 1.1.8).
- Préparer 1 L de ACSF standard (voir Matériaux).
Note: Nous utilisons cette recette dans notre laboratoire lors de l'enregistrement des neurones épineux moyens (MSN) dans des tranches de cerveau, cependant, les recettes peuvent varier entre les laboratoires, et par conséquent, nous recommandons l'expérimentateur utiliser une recette qui est couramment utilisée lors de l'enregistrement de la région du cerveau d'intérêt . - Préparer le ACSF de dissection (solution à découpage, ~ 125 ml. Note: le volume exact dépendra de la taille de la chambre de découpe comme il se soit complètement immergé dans le cerveau) destiné à être utilisé dansétapes 02.02 à 02.08.
- Préparer 5 mM d'acide kynurénique (pour bloquer glutamate processus excitotoxicité induite par le récepteur) dans la norme ACSF dans un volume suffisant pour submerger le cerveau pendant le tranchage. Utilisez un sonicateur pour aider à dissoudre l'acide kynurénique.
Remarque: La durée de la sonication peut varier en fonction du volume et de la quantité de matières solides dans la solution. Les solutions doivent être claires à la fin du processus (environ 1 - 2 min dans nos conditions). - Refroidir tout en faisant barboter avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux dans un seau de glace jusqu'à ce que la température atteigne 0-2 ° C.
- Préparer 5 mM d'acide kynurénique (pour bloquer glutamate processus excitotoxicité induite par le récepteur) dans la norme ACSF dans un volume suffisant pour submerger le cerveau pendant le tranchage. Utilisez un sonicateur pour aider à dissoudre l'acide kynurénique.
- Préparer ACSF pour l'enregistrement.
- Prendre 1 L de type ACSF (ou ce qui reste de la solution préparée à l'étape 1.3), dans laquelle les agents pharmacologiques appropriés peuvent être ajoutés en fonction des expériences prévues.
- Par exemple, ajoutez 100 uM picrotoxine lors de l'enregistrement des courants post-synaptiques excitateurs ou potentiels (EPSCs ou RPEB), antagonistes des récepteurs de glutamate (kynurenic acide, 2 mM; ou une combinaison de D-APV 50 pM avec CNQX 10 uM) lors de l'enregistrement des courants d'inhibition post-synaptiques ou potentiels (CISP ou IPSP), et les antagonistes des récepteurs de picrotoxine et du glutamate lors de l'évaluation de la décharge neuronale en l'absence de toute influence des événements synaptiques.
- Prendre 1 L de type ACSF (ou ce qui reste de la solution préparée à l'étape 1.3), dans laquelle les agents pharmacologiques appropriés peuvent être ajoutés en fonction des expériences prévues.
2. Slice Préparation
- Construire ou obtenir une chambre de récupération de tranche.
Remarque: Le principe d'une chambre de récupération est simple et peut être réalisée dans le laboratoire (figure 1). En bref, la chambre est un récipient dans lequel est inséré un panier pour contenir les tranches de cerveau à un niveau qui est inférieur à la surface de l'ACSF. Diverses sociétés scientifiques vendent également des chambres de récupération de tranche.- A titre d'exemple, obtenir quatre anneaux (4 - 6 mm de haut) (Figure 1A, vue de côté; B, vue de dessus) en coupant une seringue de 30 cc. Ensuite, la colle tendue des filets (par exemple, couper à partir d' un hos en nylone) d'un côté des anneaux pour maintenir les tranches de cerveau (figure 1B) et coller les anneaux ensemble.
Remarque: un pistolet à colle peut être utilisé. - Une fois les quatre anneaux sont collés, coller un mur isocèle incurvée en plastique en forme de trapèze à deux des anneaux (figure 1A et B) pour détourner des bulles d'oxygène à partir des tranches de cerveau récupération (Figure 1C et D). Comme cela est représenté sur la figure 1D, insérer un système d'oxygène diffusant (ici, un tube de dispersion de gaz) sur le même côté que les parois en plastique.
- A titre d'exemple, obtenir quatre anneaux (4 - 6 mm de haut) (Figure 1A, vue de côté; B, vue de dessus) en coupant une seringue de 30 cc. Ensuite, la colle tendue des filets (par exemple, couper à partir d' un hos en nylone) d'un côté des anneaux pour maintenir les tranches de cerveau (figure 1B) et coller les anneaux ensemble.
- Avant de trancher, oxygéné (95% O 2/5% CO 2) et refroidir la solution de tranchage (voir étape 1.4) 0 - 2 ° C.
- Remplir la chambre de récupération personnalisée avec ACSF standard à RT. Assurez-vous que le ACSF est bien oxygéné (20 - 30 min, le temps peut varier en fonction du volume de la chambre) avant de placer les tranches dans la chambre de récupération. Veiller à ce que les bulles de gaz ne sont pas en con directetact avec les tranches ou les perturber.
- Tapisser le bac à glaçons vibratome avec de la glace et remplir avec de l'eau froide de sorte qu'un tiers à la moitié de la chambre de tranchage est immergée. Placez délicatement un système d'alimentation en oxygène (par exemple, gaz diffusant pierre) et une sonde de température dans la chambre de tranchage de sorte que ni l' article interfère avec le mouvement de la lame ou la manipulation de tranche.
- Préparer la zone de dissection et les outils nécessaires pour extraire le cerveau et disséquer la région du cerveau souhaitée.
Remarque: La dissection exacte réalisée dépendra de la région spécifique du cerveau étudié que différentes structures cérébrales nécessiteront tranchage à différents plans (par exemple, coronale, sagittale ou tranches horizontales.).- Placez les outils suivants sur un underpad: ciseaux de décapitation, scalpel, petits ciseaux à bout pointu droites, pinces navire de canulation (ou tout autre outil chirurgical avec une pointe large, tels que rongeurs, qui est plus approprié pour les crânes de rat), pinces hémostatiques courbées, tweezers, spatule, écopage spatule, papier filtre, boîte de Pétri, lame unique lame de rasoir, et colle cyanoacrylate.
- Lorsque la température atteint 0-2 ° C, transférer la solution de tranchage à la chambre de tranchage (bac tampon).
- Anesthésier la souris dans une chambre de dessiccation à l'isoflurane. quantité exacte peut varier en fonction de la taille de la chambre utilisée, mais pour une petite cage boîte à chaussures utiliser quelques gouttes (~ 3 - 4). Laissez la souris dans la cage jusqu'à immobile rendu (ne répondant pas aux stimuli tactiles; environ 15 s pour les conditions décrites ici). Effectuer des tests de la queue et les pieds presseurs pour assurer l'animal est profondément anesthésié, puis décapite avant que le cœur cesse de battre (améliore la viabilité des cellules).
Note: Avec une justification appropriée, certains laboratoires obtiennent l'autorisation d'effectuer la décapitation en direct afin de minimiser autant que les processus d'excitotoxicité possibles et d'améliorer la viabilité des cellules. - Effectuer la dissection.
Remarque: Le cerveau doit êtreextraire rapidement (<45 s).- En utilisant le scalpel coupé la peau superficielle sur le dessus du crâne du rostrale à caudale.
- Peler le cuir chevelu de chaque côté de la tête.
- L'utilisation de petits ciseaux à bout pointu droites, couper la plaque interparietal le long de la suture lambdoïde pour enlever le cervelet. Retirer l'os occipital.
- En utilisant les mêmes ciseaux, couper la suture sagittale.
- Faites glisser la pince navire de canulation (ou rongeurs se briser un crâne de rat) en dessous de chaque os pariétaux et tirer pour exposer le cerveau.
- En utilisant les pinces hémostatiques courbées, pincer les os frontaux pour les briser, puis utiliser des pinces ou des pinces de navire canulation pour enlever les os brisés. Couper et enlever la dure-mère aussi doucement que possible car il peut interférer avec la dissection.
- Faites glisser la spatule en dessous du cerveau et tirez doucement le cerveau sur le crâne pour le placer dans la chambre de tranchage (bac tampon) préalablement rempli de glace-froid ACSF. Que le cerveaurefroidir pendant 1 - 2 min.
- Préparer la plate-forme de dissection en remplissant une boîte de Pétri avec de la glace et de la glace d'eau pour permettre une plus grande surface de contact, couvrir avec son couvercle et placez un papier filtre sur le dessus. Mouiller le papier filtre avec ACSF froid.
- Une fois que le cerveau est refroidi, placez le cerveau sur la boîte de Pétri rempli de glace, et effectuer rapidement la dissection appropriée pour obtenir le plan désiré de tranchage.
- Pour obtenir des tranches sagittal contenant le noyau accumbens (NAc), utiliser un seul bord lame de rasoir pour couper et enlever les tubercules olfactifs et le cervelet si elles sont encore présentes. Ensuite, effectuer une coupe sagittale de 2 - 3 mm de la bordure latérale de l'hémisphère droit pour obtenir la surface plane qui sera collée sur le spécimen de maintien plaque (voir étape 2.8.11).
Note: Cutting seulement 2 - 3 mm de la bordure latérale de l'hémisphère permettra la collecte de tranches contenant le NAc des deux hémisphères. La dissection appropriée dépendradans la région du cerveau qui est étudiée. Ici, la dissection est effectuée neurones afin NAc peuvent être enregistrés dans des tranches de cerveau sagittal. - Rapidement la colle (avec de la colle cyanoacrylate appliquée sur la plaque d'échantillon de maintien), la surface de coupe plane du cerveau sur la plaque selon le plan de découpe désiré. Pour obtenir des tranches de cerveau sagittal voir l'étape 2.8.10.
- Immédiatement placer et fixer le spécimen de maintien plaque dans la chambre de tranchage de sorte que le cerveau est découpé rostro-caudale (pour la sécurité, mis en place le porte-lame que lorsque la plaque d'échantillon est fixé).
- Réglez le vibratome avec les paramètres appropriés de tranchage (paramètres utilisés dans le laboratoire pour le vibratome mentionné dans Matériaux: vitesse 3 - 4, 9-10 vibrations et tranche d' épaisseur 250 um).
- Lors de tranchage, utiliser une pipette de transfert en plastique garni pour transférer les tranches de cerveau à la chambre de récupération (à la température ambiante) (voir étape 2.3). Le temps de récupération peut varier en fonction du type de neurones qui est en cours d'étude(Typiquement 30-90 min).
3. Micropipettes Enregistrement et préparation de Rig
- Se reporter aux directives spécifiques du manuel de l'utilisateur de l'extracteur pour obtenir les propriétés désirées de micropipette.
Note: Pour MSN, nous utilisons une gamme de résistance à la pipette de 3,2 à 4,0 MQ. - Oxygéner l'ACSF et régler le débit à 2 ml / min. ACSF à vide en utilisant une pompe ou à vide péristaltiques lignes installées dans l'établissement.
- Allumez le contrôleur de chauffage de perfusion et d' ajuster les réglages de température afin d'obtenir la température désirée (par exemple, 31,8 à 32,2 ° C).
Remarque: la stabilité de la température dépend ayant à la fois un niveau de ACSF constante et la vitesse d'écoulement constante dans la chambre. Etant donné que plusieurs propriétés biophysiques des neurones (par exemple, la résistance d'entrée, R i, appelée aussi résistance de la membrane, R m) sont sensibles à la température, le maintien d' une température stable est importante. - Allumez compuamplificateur commandé ter, caméra, micromanipulateur et microscope fond clair. Si vous effectuez une expérience qui nécessite une stimulation électrique du tissu, tourner sur le contrôleur de relance et l'unité d'isolement.
Note: Certains amplificateurs de autres produits manufacturés recommander un "warm-up" avant de l'utiliser, il est donc recommandé de consulter le manuel pour le mode opératoire exact. - Lancer la capture de la caméra, l'acquisition du signal et le logiciel de l'amplificateur.
- Slice Placement et visualisation:
- En utilisant une pipette de transfert en plastique garni pointe, dessiner doucement dans une tranche de cerveau de la chambre de récupération.
- Placez la pipette de transfert dans la chambre d'enregistrement et presser doucement la tranche de la pipette sur la lamelle recouvrant le fond de la chambre.
Remarque: Tant qu'aucun débordement se produit, il est inoffensif pour avoir une certaine ACSF de la chambre de récupération se jeter dans le bain. - Utilisez une pince pour modifier la position de la tranche so la zone souhaitée sera placé exactement au centre de la chambre d'enregistrement. Utilisez le microscope de faible puissance (4X) objectif et l'oculaire de l'aide dans le positionnement.
- Après la position désirée a été atteinte, fixer la position de tranche de cerveau avec une retenue de tranche (également connue sous le nom de «harpe») dans la chambre.
- Passez à haute puissance (40X) objectif et abaisser doucement jusqu'à ce que le contact est formé avec l'ACSF dans la chambre.
- Utilisez la molette de réglage fin pour amener le tissu dans le foyer. Alors en contact avec l'ACSF, ne pas utiliser la molette de réglage grossier sur le microscope que l'abaissement de l'objectif trop peut écraser la tranche ou même briser la lamelle recouvrant le fond de la chambre, ce qui peut provoquer ACSF renverser sur le condenseur et endommager.
- Lorsque l'accent est mis au niveau des tissus, observer les cellules dans la région ciblée pour la forme. Les cellules mortes sont facilement identifiables par leur membrane plasmique gonflé et le noyau (<strong> Figure 1E). Les cellules saines devraient apparaître comme ronde, ovoïde ou structures homogènes elliptiques (Figure 1E).
- Recherchez une cellule cible. Marquez-le sur l'écran d'ordinateur afin d'aider à guider le micropipette d'enregistrement. Si vous utilisez des logiciels tels que QCapture, dessiner un carré autour de la cellule cible en maintenant le clic gauche.
- Augmenter la lentille d'objectif de sorte qu'il y aura suffisamment d'espace dans le cône formé par la lentille d'objectif étant en contact avec l'ACSF pour placer et déplacer la micropipette d'enregistrement.
- Micropipette Placement et positionnement
- En utilisant une seringue de 1 ml, une aiguille de microseringue non métallique, et un filtre dédié, remplir une micropipette avec la solution interne préparé à l' avance selon l'expérience prévue (K + à base ou Cs + à base de solution interne, voir les étapes 1.1., 1.2 et Matériaux pour la composition). Utilisez suffisamment de solution pour l'internela solution entre en contact avec l'électrode en fil revêtu de chlorure d'argent dans le porte-micropipette.
Remarque: L'électrode de fil d'argent peut être chlorée par trempage dans l'eau de Javel. triphosphates nucléosidiques (ATP et GTP) peuvent être ajoutés à la solution interne avant utilisation. Conserver la seringue contenant la solution sur la glace pour empêcher la dégradation de l'ATP / GTP. - Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la micropipette car ils peuvent sortir pendant que le micropipette est dans le tissu et obscurcissent la tranche.
- Placer le micro-pipette dans le porte-électrode de sorte que la solution est en contact avec l'électrode en fil revêtu de chlorure d'argent.
- Serrer le bouchon de la pipette de sorte que la rondelle de cône forme un joint autour de la micropipette.
- Appliquer une pression positive avant l'immersion de la micropipette dans le ACSF pour empêcher les débris de pénétrer dans la pipette.
- Placer le headstage dans la position verrouillée (tournée vers la chambre), et à l'aide du micromanipulateur guide vers le bas vers la chambre de sorte qu'il est à peu près sous le centre de l'objectif immergé.
- Tout en se déplaçant la micropipette avec le micromanipulateur (fixé à moyen et à grande vitesse), utilisez l'écran d'ordinateur pour localiser le micropipette et la guider vers l'emplacement de la cellule sur l'axe XY.
- Mesurer la résistance de micropipette en appliquant une étape de tension (par exemple, 4 mV pour 100 msec), qui peut être accompli manuellement ou automatiquement via un logiciel spécifique tel que le mode 'bain' si vous utilisez "Membrane Test" dans le logiciel Clampex (voir étape aussi 4) . Afin de faire en sorte qu'aucune bulle d'air ou d'autres objets étrangers bloquent la micropipette, appliquer une pression positive en utilisant la seringue remplie d'air (par exemple, 30 cc seringue) relié au support de micropipette avec des tuyaux en polyéthylène.
- Après avoir supprimé la micropipette, effectuer un décalage de tension pour réduire le courant de pipette à zéro, ce qui peut être réalisé manuellement ou par l'intermédiaire d'un logiciel spécifique tel que & #39; décalage 'sur l'amplificateur commandant commandé par ordinateur pipette.
Remarque: Cette fonction va compenser toute tension provoquée par les différences de concentration entre le bain et les solutions de micropipette (c. -à- liquide potentiel de jonction 20).
- En utilisant une seringue de 1 ml, une aiguille de microseringue non métallique, et un filtre dédié, remplir une micropipette avec la solution interne préparé à l' avance selon l'expérience prévue (K + à base ou Cs + à base de solution interne, voir les étapes 1.1., 1.2 et Matériaux pour la composition). Utilisez suffisamment de solution pour l'internela solution entre en contact avec l'électrode en fil revêtu de chlorure d'argent dans le porte-micropipette.
4. Membrane test
Remarque: Cette étape est à l'amplificateur mentionné dans les matériaux.
- Lors de l'utilisation d'un amplificateur commandant contrôlé par ordinateur, réglez toujours sur le mode voltage-clamp pour effectuer le test de la membrane.
Note: Lorsque le test de la membrane est définie en mode «bain», le test de la membrane permet la mesure de la résistance à la micropipette et la résistance d'étanchéité lorsque le joint est formé. - Une fois que la membrane est rompue (voir étape 5.8), passer le test de la membrane en mode "Cell" de telle sorte que la résistance série (R s) (résistance aussi appelé d'accès, R a), R i et de la capacité de la membrane (C p) peutêtre obtenu.
5. Approche finale, Formation Seal, et l'obtention de la configuration à cellules entières
- Utilisation de la roue mise au point fine, commencer à se concentrer vers le bas tout en abaissant la micropipette progressivement. Toujours se concentrer en premier, puis abaisser la micropipette vers le plan de mise au point. Cela permettra d'assurer que la pointe de micropipette ne pénètre brusquement dans la tranche.
- Lorsque le micropipette vient en contact avec la surface de la tranche, ralentir la vitesse de micromanipulateur en mode moyen-bas.
- Appliquer doucement la pression légère positive avec la seringue remplie d'air relié au porte-pipette pour effacer tous les débris de la trajectoire d'approche.
- Approcher la cellule, soit en alternance avec les boutons de commande XYZ, en se rapprochant ou en diagonale (si le modèle lui permet micromanipulateur) où les deux axes X, Z sont modifiés par la rotation du bouton de l'axe Z. Cette dernière méthode permet d'éviter la compression verticale des tissus.
Note: Ici, le but estd'approcher la cellule en infligeant des dégâts minimes à la tranche. Lorsque la micropipette est assez proche de la cellule affiche une fossette (un tour de décolorer la surface cellulaire provoquée par la pression positive appliquée à travers la pointe de la micropipette) (figure 2). - Lorsque la fossette apparaît (Figure 2-1), appliquer une aspiration faible et de courte durée à travers le tube qui est relié au tube d'aspiration du porte-pipette afin de créer le joint d' étanchéité (figure 2-2). Gardez le contrôle de l'essai de la membrane.
Remarque: si un joint d'étanchéité partielle est formée (<1 GQ), l'injection de courants négatifs en abaissant le potentiel de maintien (sur l'amplificateur commandant commandé par ordinateur) peut faciliter la formation du joint d'étanchéité et la portée gigaohms résistance ( "joint gigaohm" ou "gigaseal"> 1 - 5 GQ). La haute résistance du joint d'étanchéité (> 1 GQ) sera à la fois le bruit limite la contamination du signal enregistré et contribuer à la stabilité mécanique de lapièce. - Alors qu'un gigaseal se forme, utiliser l'amplificateur commandant commandé par ordinateur pour amener le potentiel de maintien de la cellule aussi proche que possible de physiologique potentiel de repos (V repos) afin d'éviter des changements brusques une fois que la membrane est rompue. Par exemple, MSNs sont généralement tension serrée à -70 ou -80 mV (physiologique V repos: -70 à -90 mV).
- Après la gigaseal est formée, pour compenser la capacité rapide et lente manuellement ou automatiquement. Si vous utilisez un amplificateur commandant contrôlé par ordinateur tels que Multiclamp commandant, appuyez sur 'Auto' pour 'rapide Cp' et 'Cp lent ".
- Si le joint reste stable et supérieure à 1 GQ (ou injecter moins de 10 - 20 pA pour maintenir la cellule au potentiel de membrane désiré), appliquer une mémoire et une forte aspiration à travers le même tube que dans 5,5 à la rupture de la membrane plasmique (figure 2 -3).
Remarque: Cela peut prendre plusieurs essais. Une bonne rupture de la membrane est réalisée wpoule aspiration est effectuée assez fort de sorte que la membrane rompue ne bouche pas la micropipette ( ce qui peut conduire à une augmentation de R s pendant l' enregistrement), mais assez faiblement pour ne pas dessiner dans une grande partie de la membrane ou de la cellule. - Après avoir obtenu une configuration de cellule entière réussie, surveiller régulièrement l'emplacement de micropipette pour évaluer et corriger la dérive importante car elle peut conduire à la perte du patch. Drift amplitude peut varier en fonction de plusieurs facteurs, par exemple, la qualité de l'installation de forage et des forces de traction sur le headstage. Idéalement, la dérive devrait être presque inexistante.
- En passant en mode "Cell" dans le test de la membrane, voir les différents paramètres de la cellule tels que R i, R s et C p. Surveiller ces paramètres lors de l'enregistrement.
Remarque: Tous ces paramètres peuvent aider à évaluer l'état de santé initial des cellules et types de cellules (voir la section «test de la membrane", étape 4). - Une fois the étapes ci - dessus sont terminées, restent en mode voltage-clamp pour mesurer les courants (par exemple, EPSCs, CISP), ou passer en mode courant-clamp si la planification de mesurer les variations de tension de la membrane (par exemple, l' action tir potentiel). Pour ce dernier, l'injection de courant positif ou négatif pour maintenir la cellule à la tension de la membrane désirée (pour effectuer cette étape, reportez-vous à l'amplificateur manuel d'utilisation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La température, un facteur qui est facilement contrôlée par l'expérimentateur, influe sur les propriétés biophysiques des canaux ioniques et des récepteurs, et ainsi la forme d' onde des courants postsynaptiques (PSC) (RPEC et CISP) et la capacité des neurones à susciter des pics. Figure 3 et la figure 4 montrent l'effet de la température sur la décharge neuronale et la pente de EPSCs évoqués (les eEPSCs) , respectivement. Le motif de tir (figure 3) (c. -à- temps de latence à la pointe 1 er pic nombre, la fréquence et l' action de forme d' onde potentielle) est façonnée par une ouverture et la fermeture des canaux spécifiques d'ions voltage-dépendants chronométré et coordonnée (Na +, Ca 2 + et K +), un processus sensible à la température. la figure 3 montre comment le nombre pic moyen augmente avec la température. Notez que dans les conditions expérimentales décrites ici (enregistrements MSN) bien que Freque picncy ne semble pas être modifiée à la température subphysiological (28 ° C), il augmente de manière significative lorsque la température atteint le niveau physiologiquement pertinente (32 ° C). La figure 4A montre un exemple de la façon dont la pente de eEPSCs, un paramètre qui est couramment utilisé pour évaluer la force synaptique, augmente avec la température.
Bien que R s ne peut être quelque peu contrôlée par l'expérimentateur, soit à travers une ouverture efficace de la membrane lors du passage d' un état d'étanchéité à la configuration de cellule entière, R s habituellement augmente lentement pendant l' enregistrement. Cela peut être le résultat de divers événements incontrôlables, par exemple, la membrane de refermeture ou de débris obstruant la pointe de la pipette lors de l'enregistrement. Une tentative de ré-ouvrir la membrane en appliquant une légère aspiration, même si elle risque de compromettre le patch, peut parfois aider à maintenir un R stable s. Dans tous les cas, parce que les changements R peuvent alter la forme d' onde du signal électrique à l'étude, il doit être soigneusement contrôlé, et plus particulièrement lors de l' enregistrement PSCs (mode voltage-clamp). La figure 4 montre que lorsque les augmentations de R (figure 4B), l' amplitude des courants médiés par les récepteurs du glutamate (eEPSCs ) diminue (figure 4C, D). En règle générale, les expérimentateurs rejettent les données lorsque des changements dans R s est supérieure à 15% (par exemple, ce laboratoire), mais certains laboratoires font à partir d' une variation de 20%. Ce critère doit être indiqué dans la section de la méthode de l'article.
Pour un neurone défini, R i peuvent être influencés par plusieurs facteurs, notamment la température, la santé des cellules, et la qualité de patch. Plus précisément, lorsque R i diminue, les amplitudes de la CFP ou la capacité des neurones pour générer des pics diminue également. Par exemple, la figure 4E montre que , lorsque R i ne varie pas de manière significative, enombre e de pointes restent relativement stables (Neuron 1); et lorsque R i augmente, le nombre de pics augmente également (Neuron 2). Par conséquent , et de façon similaire à R s, R i doit être soigneusement contrôlée, que 10% des modifications sont suffisantes pour les données de polarisation.
Comme cela est décrit ci - dessus, il est essentiel de contrôler ou de surveiller la température, R s et R i pendant les enregistrements. Par exemple, les changements dans le signal qui est à l'étude (PSCs ou tir) peut être due à des changements (ou un manque de contrôle) de ces facteurs plutôt que l'effet des manipulations expérimentales, par exemple, pré vs post-effets observés de l'application du bain de médicament.
Figure 1. Sur mesure Chambre (AD) et une image d'un Slice Brain 400X Affichage sain et Dead Neurones (E) de récupération. UN D)La procédure pour faire une chambre de récupération personnalisée est décrite à l' étape 2.1. E) Picture of NAc MSNs shell médial dans une tranche de cerveau à 400X montrant des exemples de (flèches rouges sains) contre les neurones morts (flèches bleues). Notez que bien que certaines cellules sont indiquées en bonne santé, leur aspect sphérique indiquent qu'ils peuvent ne pas être aussi bonne santé que désiré (flèches rouges avec des astérisques). L' état de santé final est évalué sur la base de V repos et R i après la réalisation de la configuration de cellule entière. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma représentant les étapes de procédure de base pour obtenir un Gigaseal et établir la configuration à cellules entières. Lorsque la micropipette est assez proche de the cellule pour créer une fossette dans la membrane plasmique (étape 1, approche), appliquer une aspiration brève et douce pour créer un contact étroit entre la micropipette et la membrane plasmique. Si effectué correctement, le contact se renforcer et la résistance va augmenter et atteindre 1 GQ (gigaseal) ou plus (étape 2, la formation de Seal). Une fois que le joint est stable et supérieure à 1 GQ, appliquer une aspiration brève et forte à la rupture de la membrane plasmique (étape 3, la configuration à cellules entières). La réalisation de la configuration de la cellule entière permet la continuité entre le cytoplasme et l'intérieur de la micropipette. Pour plus de détails, voir le protocole étape 5/1 à 5/8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Neuronal Firing (Intrinsic excitabilité) est évalué dans Current-clam Mode p. Ici, une série prédéfinie et progressive des étapes en cours est donnée afin d'obtenir des changements de la tension de la membrane, et déclencher ainsi des potentiels d'action. A) Nombre moyen de pic augmente avec B) Exemples de traces température. à 280 pA de NAc MSNs shell médian à trois températures différentes (24 ° C, n = 9; 28 ° C, n = 5 et 32 ° C, n = 6). La température dans la chambre d'enregistrement affecte directement la fréquence de pic. Toutefois, notez que, bien que la fréquence pic ne semble pas être modifiée à la température subphysiological, elle augmente de manière significative lorsque la température atteint 32 ° C, une température physiologiquement pertinente. Neurones sont maintenus à -80 mV. Deux voies ANOVA: interaction, p <0,0001; effet de la température, p = 0,0041; les tests post hoc: 24 ° C et 28 ° C sont à la fois significativement différent de 32 ° C, ** p <0,01. Les données sont représentées en moyenne ± SEM. Étalonnage: 200 msec, 50 mV.jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effet de la température, R s et R i sur la forme d' onde de l'exemple du signal électrique à l' étude. A) de eEPSC amplitude à partir d' une seule coque MSN NAc. Augmentation de la température 24-28 ° C et à 32 ° C augmente la pente de eEPSCs. Notez que les modifications induites par la température dans eEPSCs pente se produisent rapidement. Ici, eEPSCs pente est évaluée en mode voltage-clamp. Calibration: 5 msec, 100 pA BD) Exemple de eEPSCs pente à partir d' une seule coque MSN NAc.. Lorsque les augmentations de R (B), la pente diminue eEPSCs (C). D) Une analyse de corrélation de pente eEPSC en fonction de Rs. R de Pearson = -0,5717, p <0,0001. Les neurones sont la tension bloquée à -80 mV. E) Exemple de traces à partir de deux neurones montrant l'effet de R i sur l'aptitude du neurone à générer des pointes. Les neurones sont en cours-serré, et maintenu à -80 mV. Calibration:. 200 msec, 50 mV S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit la procédure de base pour effectuer des cellules entières expériences de patch-clamp sur les neurones dans des tranches de cerveau. Cependant, la complexité, le potentiel et la sensibilité de cette technique ne peuvent pas être décrits en détail dans cet article. Ici, nous avons essayé de définir les étapes les plus élémentaires et de souligner les paramètres importants qui doivent être contrôlés pour réaliser des enregistrements de cellules entières avec succès et rigoureux. Pour plus d' apprentissage théorique, de nombreux livres et articles ont été publiés à la fois sur des cellules entières d' enregistrement patch-clamp en tranches de cerveau 3,21-24 et sur les méthodes qui peuvent affiner les solutions utilisées 25-27 afin d'améliorer la viabilité des cellules. Afin d'effectuer régulièrement des enregistrements appropriés, l'amélioration des compétences techniques par la pratique intensive est nécessaire. heures Néanmoins, avec l'application correcte des étapes mentionné, les cellules peuvent être patchés post-mortem, en fournissant des informations importantes sur les changements dans les fonctions synaptiques et excitabi intrinsèquelité.
En général, outre l'importance de préparer soigneusement les deux solutions ACSF et micropipette interne, chaque étape de la dissection du cerveau, le tranchage, la réalisation de la configuration cellule entière réussie, et l'obtention de données rigoureuse et impartiale exige de la pratique intensive. En premier lieu, il est essentiel de générer des tranches de cerveau en bonne santé. En bref, la dissection rapide du cerveau (idéalement <45 sec), maintien d'une température basse - solutions de tranchage appropriées (0 2 ° C), tandis que le tranchage, et jouent tous un rôle important pour garantir la santé des cellules. Il convient de mentionner que les solutions de tranchage peuvent différer entre les laboratoires et en fonction du type cellulaire et / ou de la région du cerveau qui sera étudié. Lorsque le tranchage le striatum NAc ou dorsale, notre laboratoire et d' autres utilisent l' acide kynurénique pour la solution de tranchage pour minimiser les processus d' excitotoxicité 28-33, cependant, d' autres méthodes peuvent également être utilisés, tels que les solutions à base de saccharose 34, élevée Mg 2+ Ca2 solutions 35, etc. Ce ne sont que quelques exemples et peuvent être ajustées en fonction de la sensibilité du cerveau ou la région à des processus d' excitotoxicité (par exemple, en raison de l' âge). Pour de plus amples informations sur les solutions et la viabilité des cellules, s'il vous plaît voir 25-27. En fin de compte, la concentration des anions, des cations et d' autres médicaments (par exemple, l' ascorbate, les antagonistes des récepteurs du glutamate) qui forment des solutions à trancher est déterminée de sorte qu'il imite le liquide céphalorachidien et réduit autant que possible les processus d' excitotoxicité qui se produisent pendant la coupe. Le protocole présenté dans cet article décrit des solutions standard qui ont été couramment utilisés dans les études antérieures des auteurs 28-31 lors de l' enregistrement de MSNs dans le NAc ou le striatum dorsal dans des tranches de cerveau. En outre, le bon réglage de l'osmolarité pour les deux solutions ACSF et micropipette interne sont essentiels pour la formation d'étanchéité réussie et l'entretien de conf cellule entièreiguration. Pour créer un gradient de concentration de la solution extracellulaire à la solution intra-pipette, ACSF osmolarité devrait être supérieur à celui des solutions de micropipette internes. Idéalement, la différence peut être comprise entre 10 et 30 mOsm.
La réalisation d'une configuration de cellule entière réussie est une autre étape importante pour la réalisation des enregistrements efficaces. Tout d'abord, une pipette de capacité peut être réglée une fois que la pipette est placé dans le bain. Bien que les réglages automatiques sont généralement correctement réglé, il est conseillé d'utiliser des ajustements rapides et lents de capacité cellulaire avec prudence car ils peuvent endommager la cellule lorsqu'ils ne sont pas effectuées de manière appropriée. Deuxièmement, brève aspiration de membrane qui est nécessaire pour rompre la membrane conduira à une ouverture importante de la membrane, et ainsi permettre une bonne communication entre intracellulaire et intra-micropipette milieu. Cela garantira que R s restera relativement stable tout au long de l'enregistrement. Si vous utilisez une solution de micropipette à base de Cs,le potentiel de membrane au repos doit être évaluée immédiatement après la mise en place de la configuration de cellule entière (voir étape 5.8). En effet, la diffusion de Cs + dans la cellule provoque la perte du potentiel membranaire de repos. Pour déterminer le potentiel de repos proprement dit , le potentiel de jonction liquide doit être évaluée 20. Toutefois, l'expérimentateur peut signaler le potentiel de repos qui est observée après la rupture de la membrane (après l'étape 5.8) et de choisir de ne pas ajuster le potentiel de jonction liquide. Dans tous les cas, il doit être mentionné dans la section de la méthode de l'article. Lors de l' établissement de la configuration de cellule entière, C p peut également être obtenu et peut être utilisé comme un paramètre indirect pour évaluer la santé des cellules et / ou du type cellulaire. Troisièmement, lorsque les enregistrements ont commencé, d'autres paramètres doivent être rigoureusement surveillés. Les facteurs critiques qui doivent être contrôlés lors de l' évaluation de l' excitabilité neuronale sont la température, R s et R i.
Commementionné ci - dessus, R i et C p peuvent être une indication de la santé des cellules et / ou du type cellulaire. Par exemple, la membrane plasmique, agissant comme un isolant, sépare la charge (résultant de la composition différente de la solution intracellulaire et extracellulaire), qui constituent ensemble la capacité de la membrane. Plus la surface de la membrane (spécifique neuronale), plus la capacité. Il est donc pas surprenant que les types neuronaux spécifiques exposition C p et R i (mathématiquement liée à C p) qui sont dans la même gamme. R s est directement liée à la taille de la pointe de pipette, et par conséquent est généralement indicative de la qualité ou de la taille de l' ouverture de la membrane. En bref, lors de l'établissement de la configuration de cellule entière, le cytoplasme est en continuité électrique avec la solution dans la micropipette et complètement isolé du milieu extérieur. (Ou R ' A) R provient de la résistance aux current à l'écoulement de la pipette au cytoplasme. Pour certaines conditions d'enregistrement (par exemple, le mode courant-clamp ou d' enregistrement voltage-clamp des courants ioniques voltage-dépendants), R s doivent être compensés correctement (voir Ref. 3,21-24 ou amplificateur manuel d' utilisation pour l'indemnisation des bon R) .
Comme décrit dans la figure 4, R s est particulièrement importante car elle peut considérablement affecter la forme d' onde du signal électrique, par exemple, RPEC amplitude. Néanmoins, R s doit être soigneusement contrôlé pour des interprétations hors ligne de tous les effets observés. Dans le cas où la membrane n'a pas été rompue correctement, pointe de micropipette colmatage ou re-fermeture de la membrane peut se produire, dans lequel les augmentations et les biais de cas R la forme d' onde du signal électrique à l'étude (figure 4B-D). En résumé, de nombreux problèmes peuvent être rencontrés lors de l'enregistrement, et ceux qui tombent généralement en trois catégories: i) tissus connexes, Par exemple, l' augmentation de la mortalité des cellules due à une mauvaise dissection, l' inadaptation des ACSF osmolarité, et l' hypoxie; ii) liée à l' équipement, par exemple, le bruit et la terre problèmes, contrôle de la température, tranche et micropipette positionnement, etc.; et iii) l' interprétation des données, par exemple, les changements observés peuvent être le résultat d'artefacts expérimentaux indésirables sollicitant les données telles que les modifications des paramètres de forme d'onde altérant électriques (R i, voir R s, température Figure 3 et 4) , plutôt que le résultat d' une expérimentation manipulations.
Bien que l'enregistrement de cellules entières dans des tranches de cerveau est une technique puissante pour l'évaluation de l'expérience de la plasticité, cette approche limite l'interprétation des données. En particulier, trois importantes limitations de la technique d'enregistrement de cellules entières sont les suivantes: (i) les changements dans la fonction et l' expression des niveaux de protéines spécifiques (par exemple, les canaux ioniques) ne peuvent pas être distingués; (Ii) parce que cettetechnique évalue le flux de courant à travers l'ensemble de la membrane (ou une partie importante), il ne fournit pas subcellulaire une localisation précise des courants ioniques ou des changements qui sont observés; et (iii) l'invasivité de la configuration de cellule entière conduit à la dialyse, le contenu des cellules, et donc à la perturbation des mécanismes moléculaires intracellulaires nécessaires à certains phénomènes à développer ou à exprimer. Une façon d'éviter la dialyse est d'utiliser des enregistrements d'électrodes pointus ou la technique de patch perforé 3,21,23. En ce qui concerne ces derniers, les molécules antibiotiques porogènes tels que la nystatine peut être ajouté à la solution de la pipette. La formation de ces pores permettra l'enregistrement des courants sans perturber les mécanismes de second messager dans la cellule. Néanmoins, les récents progrès en nanotechnologie et le développement de nanoélectrodes 36 fournissent des outils puissants pour améliorer les enregistrements neuronaux. Cette avancée technologique en neurosciences sont encore en développement et sont en train de mettre à notre portée la possibilité d'effectuer patch-clamp et intracellulaires des enregistrements avec invasivité minimale, à savoir, en gardant le milieu intracellulaire intact, et d' enquêter sur les fonctions des canaux ioniques dans les compartiments sous-cellulaires qui étaient jusqu'à présent pas accessible avec classique électrodes de patch-clamp 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun des auteurs ont des intérêts concurrents ou des intérêts contradictoires.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des fonds de démarrage UT Southwestern (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4•H2O, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H2O, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , Oxford University Press. (2013).
- Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
- Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
- Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
- Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
- McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
- Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
- Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
- Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
- Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E.
- Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
- Defelice, L. J. Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , Plenum Press. (1997).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
- Neher, E., Sakmann, B.
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
- Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
- Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
- Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
- Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
- Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).
