Summary
Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.
Abstract
Whole-cell patch-clamp de gravação é uma técnica electrofisiológico que permite o estudo das propriedades eléctricas de uma parte substancial do neurónio. Nesta configuração, a micropipeta está em contacto apertado com a membrana celular, o que evita a fuga de corrente e, assim, fornece medições mais precisas corrente iónica do que o método de gravação eléctrodo afiado intracelular previamente utilizado. Classicamente, a gravação de células inteiras pode ser realizada sobre os neurónios em vários tipos de preparações, incluindo modelos de cultura celular, os neurónios dissociados, neurónios em fatias de cérebro e em animais anestesiados intactos ou acordado. Em resumo, esta técnica tem imensamente contribuído para a compreensão das propriedades biofísicas passivas e activas das células excitáveis. Uma importante vantagem desta técnica é que ele proporciona informação sobre a forma específica manipulações (por exemplo, farmacológico, plasticidade induzida pelo experimentador) podem alterar ou C funções neuronais específicashannels em tempo real. Além disso, a abertura significativa da membrana plasmática permite que a solução da pipeta interna para difundir livremente no citoplasma, proporcionando meios para a introdução de medicamentos, por exemplo, agonistas ou antagonistas de proteínas intracelulares específicos, e manipular esses alvos, sem alterar as suas funções em células vizinhas. Este artigo incidirá sobre gravação de célula inteira executada em neurónios em fatias de cérebro, uma preparação que tem a vantagem de gravação de neurónios no cérebro circuitos relativamente bem conservados, isto é, num contexto fisiologicamente relevante. Em particular, quando combinado com farmacologia disso, esta técnica é uma ferramenta poderosa que permite a identificação de neuroadaptações específicas que ocorreram na sequência de qualquer tipo de experiências, como a aprendizagem, a exposição a drogas de abuso, e stress. Em resumo, as gravações de células inteiras de patch-clamp em fatias de cérebro fornecer meios para medir em ex vivo de preparação de mudanças de longa duraçãoem funções neuronais que se desenvolveram em animais acordados intactas.
Introduction
A técnica de patch-clamp, uma técnica eletrofisiológica que tem sido desenvolvido no final de 1970 1,2, é a principal ferramenta para o estudo de funções de canal de iões simples ou múltiplas no tecido vivo. Entre as diferentes configurações de patch que podem ser obtidos, gravações de célula inteira de patch-clamp permitir o estudo do comportamento eléctrico de uma parte substancial do neurónio. Classicamente, esta técnica é realizada in vitro, quer em fatias de cérebro, os neurónios dissociados de fresco, quer em modelos de cultura de células 3. Quando realizada em neurônios em fatias de cérebro, esta técnica apresenta várias vantagens. Em particular: (i) os neurónios são registados nos circuitos do cérebro relativamente conservadas que, em certa medida, e em comparação com as preparações de cultura de células, proporcionam um ambiente que é fisiologicamente relevante 3. Isto permite a captura precoce, ou mesmo de monitoramento em tempo real, eventos celulares e moleculares que são acionados por qualquer tipo de pharmacolog agudamanipulações iCal - uma resolução temporal que não pode ser conseguido usando clássica em condições in vivo; (ii) capacidade de identificar visualmente as regiões do cérebro em fatias de cérebro permite alta especificidade regional 3, tanto para a região do cérebro estudada e para os neurônios específicos quando eles expressam marcadores fluorescentes; (iii) o acesso ao espaço intracelular da célula através da abertura de uma parte significativa da membrana de plasma (em contraste com a perfuração da membrana com uma micropipeta afiado para gravações intracelulares) 4. Por sua vez, isto permite que o conteúdo ou concentração de iões específicos que constituem a solução interna de ser modificado de modo alvos moleculares ou mecanismos celulares pode ser estudada em condições diferentes. Por exemplo, ao estabelecer a configuração de célula inteira, qualquer agente farmacológico específico (por exemplo, antagonistas) que se pode adicionar ao micropipeta de gravação (remendo pipeta) solução difundirá directamente para o citoplasma e agir sobre a sua Putative alvos intracelulares, sem alterar a função alvo em células vizinhas. Além disso, em comparação com a gravação micropipeta afiada, a grande abertura na ponta do eléctrodo de patch clamp proporciona uma resistência mais baixa, menos ruído concorrentes, e, assim, um melhor acesso eléctrico para o interior da célula 4. No entanto, note que o da grande abertura na ponta da pipeta podem levar a célula de diálise, e, assim, a perda da maquinaria molecular intracelular que pode ser crítico para a expressão dos fenómenos biológicos que estão sob 5,6 estudo. Neste caso, as gravações de eléctrodos afiadas pode ser mais adequado. Este tipo de gravações requer micropipetas com uma poro que é muito menor do que os utilizados para as gravações de células inteiras, evitando deste modo a maior parte da permuta iónica entre o espaço intracelular e a solução da pipeta interna.
Qualquer forma de experiência (aguda ou crónica), incluindo a aprendizagem 7-10, exposição a drogas de abuso 11,12, o stress 13,14, etc, pode alterar diversos aspectos da função neuronal em regiões específicas do cérebro. Porque estas alterações, muitas vezes exigem tempo para se desenvolver (horas ou dias), gravações de célula inteira em fatias de cérebro de animais que tenham sido submetidos a uma experiência específica permitir aos pesquisadores identificar essas mudanças. Basicamente, muitos (se não todos) os componentes que participam de funções neuronais (por exemplo, canais iónicos activados por ligandos, canais de iões dependentes da voltagem, transportadores de neurotransmissores), e assim a actividade circuito cerebral e comportamento, pode ser alterada por experiência (experiência-dependente plasticidade) 10,15-17. A nivel neuronal, a actividade circuito cerebral surge a partir de interacções constantes entre sináptica (por exemplo, glutamato) de transmissão e os factores de excitabilidade celular intrínseco (por exemplo, canais iónicos axosomato-dendrítica: de sódio, Na +, potássio, K +, e de cálcio, Ca 2+ ). Sob condições específicas, utilizando whole de células de patch-clamp técnicas electrofisiológicas, alterações de sinal específica das alterações na excitabilidade sináptica vs intrínseca pode ser isolado.
Na maioria dos casos, a excitabilidade sináptica é avaliada utilizando a técnica de tensão-grampo de célula inteira. Este modo de gravação permite a medição de correntes de iões [por exemplo, mediados por receptores do ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ( os receptores de AMPA) e receptores de N-metil-D-aspártico (NMDA)] receptores através da membrana plasmática neuronal, enquanto que prendem o potencial de membrana a uma voltagem conjunto. Aqui, os experimentadores usar soluções internas micropipeta que contêm césio (Cs +), um bloqueador ampla de canais de K + (principais fatores de excitabilidade intrínsecas). Após o estabelecimento da configuração de célula inteira, a difusão de Cs + no espaço intracelular irá bloquear os canais de K +, e, assim, vai permitir que ambos um espaço relativamente eficiente e pré-braçadeiradesabafar influência de fatores intrínsecos excitabilidade sobre outras medidas. Questões de espaço-clamp, ou seja, a dificuldade de tensão-clamp toda a célula, surgem quando a gravação de células irregular em forma (por exemplo, neurônios), e particularmente neurônios com um dendrítica vasto e complexo Arbor 18,19. Por causa da braçadeira de tensão somática controles mal tensão na árvore dendrítica de neurônios, vários aspectos de sinais elétricos dendríticas em estudo são distorcidos de uma forma dendrítica dependente da distância. Combinado com ferramentas farmacológicas tais como picrotoxina (ácido gama-aminobutírico, o GABA Um antagonista do receptor) ou ácido quinur�ico (largo bloqueador de receptores de glutamato) dissolvido na solução extracelular (fluido cérebro-espinal artificial, ACSF), esta técnica permite a medição de glutamato receptor- e correntes de GABA A R-mediada, respectivamente.
Em contraste, a excitabilidade intrínseca é normalmente avaliado em modo de gravação actual-clamp.Ao contrário de gravação voltagem-grampo, este modo de gravação permite a medição de variações no potencial de membrana induzidas por correntes de iões que fluem através da membrana plasmática neuronal. Normalmente, a alteração na excitabilidade intrínseca é avaliado através de alterações na capacidade de neurônios para gerar potenciais de ação, o que requer Na + e canais de K +. Portanto, quando se realiza gravações de corrente-clamp, micropipetas são preenchidos com uma solução interna que contém K + em vez de Cs +. Combinados com agentes farmacológicos que bloqueiam a glutamato e GABA A correntes mediadas pelo receptor dissolvidos em ACSF, este delineamento experimental permite a medição da contribuição de factores intrínsecos (por exemplo, canais de K +) para o disparo neuronal sem serem contaminados por potenciais alterações na excitabilidade sináptica factores.
Este artigo irá descrever as etapas básicas necessárias processuais to (i) preparar fatias cerebrais saudáveis; (Ii) obter uma configuração de célula inteira, e (iii) monitorar os parâmetros básicos para avaliar sináptica e excitabilidade intrínseca.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a UT Southwestern, e foram escolhidos de modo a minimizar o estresse, desconforto e dor experimentada pelos animais experimentais.
1. Soluções
Nota: Preparar soluções internas micropipeta com antecedência. Para a maioria dos fins experimentais básicas, dois tipos de soluções deve ser suficiente: CS + baseada e K + soluções baseadas.
- Use Cs + soluções baseadas (por exemplo, a solução de gluconato de Cs +, veja Materiais) para experiências de tensão-clamp. Prepare à TA.
- Prepare mM solução de 117 Cs-Gluconate misturando 4,62 g de ácido D-glucónico (~ 3.696 ml) com 3,54 g CsOH (~ 2,01 ml).
- Adicionar DDH 2 O a 90 ml e deixou-se equilibrar durante 30 min.
- Adicionar os ingredientes sólidos (HEPES 20 mM = 0,476 g; EGTA a 0,4 mM = 15,2 mg; NaCl 2,8 mM = 16,4 mg; 5 mM de tetraetilamónio (TEA) De cloreto de = 83 mg).
- Adicionar ddH2O para ~ 97 ml.
- Ajustar o pH da solução com 50% de CsOH a 7,2-7,3.
- Verifique osmolaridade e se necessário corrigir com DDH 2 O.
Nota: Uma boa variedade é ~ 280-285 mOsm. osmolaridade ideal deve ser de 15 - 20 mOsm abaixo da osmolaridade de ACSF padrão (geralmente 300-310 mOsm, de 300 mOsm no nosso laboratório). Osmolaridade pode variar dependendo soluções composições específicas. - Alíquota a 1000 ul e armazenar a -20 ° C ou abaixo.
- Prepare, alíquota, congelar, e adicionar ATP / GTP à solução interna no dia da gravação.
- Adicionar 64,63 mg de ATP a 10 mg de GTP e dissolver em 637.11 ul de ddH 2 O.
- Preparar 10 mL alíquotas e armazenam-se a -20 ° C ou abaixo. Misturar cada aliquota com 100x 1.000 ul de solução interna no dia da experiência. Uma vez que o ATP / GTP é adicionado à solução interna, mantê-lo em gelo para evitar degradati ATP / GTPem.
- Use K + soluções baseadas (por exemplo, a solução de K-gluconato, veja Materiais) para ambos os experimentos observação de correntes e tensão-clamp, onde K + conductances permanecem funcionais de modo a que o disparo neuronal pode ser avaliada. Prepare à TA.
- Pesar todos os materiais de acordo com o volume final desejado. Para a preparação de 90 ml de solução, 120 mM de K-gluconato = 2,81 g; KCl 20 mM = 0,149 g; HEPES 10 mM = 0,238 g; EGTA 0,2 mM = 0,008 g; 2 mM de MgCl 2 = 0,021 g.
- Use suficiente ddH2O para atingir 90% do volume final da solução. Isso deve garantir que espaço suficiente é deixado para pH e ajuste de osmolaridade.
- Depois de adicionar e misturar todos os ingredientes, certifique-se a solução é clara antes de medir o pH.
- Enquanto constantemente agitação da solução, ajustar o pH a 7,2-7,3 utilizando hidróxido de K + (KOH).
- Depois de ajustar o pH, usa o osmómetro e adapenas osmolaridade de 280-285 mOsm.
Nota: osmolaridade óptima deve ser de 15 - 20 mOsm abaixo da osmolaridade de ACSF padrão (geralmente 300-310 mOsm, de 300 mOsm no nosso laboratório). Osmolaridade pode variar dependendo soluções composições específicas. - Alíquota a 1000 ul e armazenar a -20 ° C ou abaixo.
- Prepare, alíquota, congelar, e adicionar ATP / GTP à solução interna no dia da gravação (veja o passo 1.1.8).
- Prepare 1 litro de ACSF padrão (veja Materiais).
Nota: Nós usamos esta receita em nosso laboratório durante a gravação de neurônios espinhosos médios (MSNs) em fatias de cérebro, no entanto, as receitas podem variar entre laboratórios, e, portanto, recomendamos o experimentador usar uma receita que é rotineiramente usado ao gravar a região do cérebro de interesse . - Prepara-se o ACSF dissecção (solução corte, ~ 125 ml. Nota: volume exacto dependerá do tamanho da câmara de corte, uma vez que deve submergir completamente o cérebro) para uso emas etapas de 2,2-2,8.
- Prepare 5 mM de ácido cinurênico (para bloquear glutamato induzida por receptores processos exocitotóxica) em ACSF padrão em um volume suficiente para submergir o cérebro durante o corte. Use um sonicador para ajudar a dissolver o ácido cinurênico.
Nota: O comprimento de sonicação pode variar dependendo do volume e a quantidade de sólidos na solução. As soluções deve ser claro até ao final do processo (cerca de 1 - 2 minutos nas nossas condições). - Arrefecer, enquanto borbulhando com 95% de O2, 5% de gás CO 2 em um balde de gelo até que a temperatura atinge 0 - 2 ° C.
- Prepare 5 mM de ácido cinurênico (para bloquear glutamato induzida por receptores processos exocitotóxica) em ACSF padrão em um volume suficiente para submergir o cérebro durante o corte. Use um sonicador para ajudar a dissolver o ácido cinurênico.
- Prepare ACSF para a gravação.
- Tomar 1 L de ACSF normal (ou qualquer que seja a esquerda a partir da solução preparada no passo 1.3) para que os agentes farmacológicos adequados podem ser adicionados dependendo experiências planeadas.
- Por exemplo, adicione 100 M picrotoxina ao gravar correntes pós-sináptica excitatória ou potenciais (EPSCS ou EPSPS), antagonistas do receptor de glutamato (kynurenic ácido, 2 mM; ou uma combinação de D-APV 50 uM com CNQX 10 uM) durante a gravação de correntes de inibidores pós-sinápticos ou potenciais (IPSCs ou IPSPs), e ambos os antagonistas do receptor de picrotoxina e glutamato quando se avalia o disparo neuronal na ausência de qualquer influência de eventos sinápticos.
- Tomar 1 L de ACSF normal (ou qualquer que seja a esquerda a partir da solução preparada no passo 1.3) para que os agentes farmacológicos adequados podem ser adicionados dependendo experiências planeadas.
2. Preparação Slice
- Construir ou obter uma câmara de recuperação fatia.
Nota: O princípio para uma câmara de recuperação é simples e pode ser feita em laboratório (Figura 1). Em resumo, a câmara é um receptáculo em que é inserido um cesto para conter as fatias de cérebro num nível que é mais baixo do que a superfície de ACSF. Várias empresas científicas também vendem câmaras de recuperação fatia.- Como exemplo, obter quatro toques (4-6 mm de altura) (Figura 1A, vista lateral; B, vista superior) por corte de uma seringa de 30 cc. Em seguida, cola esticado redes (por exemplo, corte de um hos de nylone) para um lado dos anéis para realizar as fatias de cérebro (Figura 1B) e colar os anéis juntos.
Nota: uma pistola de cola pode ser utilizado. - Uma vez que os quatro anéis são coladas, cola uma parede de plástico em forma de trapézio isósceles curvada para dois dos anéis (Figura 1A e B) para desviar as bolhas de oxigénio a partir de fatias de cérebro de recuperação (Figura 1C e D). Tal como mostrado na Figura 1D, inserir um sistema de difusão de oxigénio (aqui, de um tubo de dispersão de gás) no mesmo lado que as paredes de plástico.
- Como exemplo, obter quatro toques (4-6 mm de altura) (Figura 1A, vista lateral; B, vista superior) por corte de uma seringa de 30 cc. Em seguida, cola esticado redes (por exemplo, corte de um hos de nylone) para um lado dos anéis para realizar as fatias de cérebro (Figura 1B) e colar os anéis juntos.
- Antes de cortar, oxigenado (95% O2 / 5% de CO 2) e arrefecer a solução de corte (veja o passo 1.4), 0 - 2 ° C.
- Encha a câmara de recuperação personalizado com ACSF normal à temperatura ambiente. Certifique-se de que o ACSF é bem oxigenada (20 - 30 min, o tempo pode variar de acordo com o volume da câmara) antes de colocar fatias na câmara de recuperação. Certifique-se que as bolhas de gás não entrem em con diretatacto com as fatias ou perturbar-los.
- Linha de bandeja de gelo do vibratome com gelo e encher com água fria de modo que um terço a metade da câmara de corte está submersa. Com cuidado, coloque um sistema de fornecimento de oxigênio (por exemplo, difusão de gás de pedra) e uma sonda de temperatura na câmara de corte de modo que nenhum item de interfere com o movimento da lâmina ou manipulação fatia.
- Prepare a área de dissecção e as ferramentas necessárias para extrair o cérebro e dissecando a região do cérebro desejado.
Nota: A dissecção exacta realizado dependerão da região específica do cérebro estudada como diferentes estruturas cerebrais exigirá corte em diferentes planos (por exemplo,, ou fatias horizontais sagital coronal.).- Coloque as seguintes ferramentas em um underpad: tesouras decapitação, escalpelo, pequenas retas tesoura ponta afiada, fórceps de punção embarcação (ou qualquer outra ferramenta cirúrgica com uma grande ponta, tais como fórceps, o que é mais adequado para crânios de rato), pinça hemostática curvas, tweezers, espátula, escavando espátula, papel de filtro, placa de Petri, lâmina fio da navalha single, e cola de cianoacrilato.
- Quando a temperatura atinge 0 - 2 ° C, transferir a solução de corte a (bandeja de tampão) da câmara de corte.
- Anestesiar o mouse em uma câmara de dessecação usando isoflurano. quantidade exacta pode variar de acordo com o tamanho da câmara utilizado, mas para uma gaiola pequena caixa de sapatos usar algumas gotas (~ 3-4). Deixe o rato na gaiola até imóveis prestados (não respondendo a estímulos táteis, em torno de 15 segundos para as condições aqui descritas). Realizar testes de cauda e pitada pé para assegurar que o animal está profundamente anestesiados e depois decapitar antes do coração parar de bater (aumenta a viabilidade celular).
Nota: Com justificação adequada, alguns laboratórios obter a autorização para realizar a decapitação ao vivo, a fim de minimizar tanto quanto possível os processos de excitotoxicidade e melhorar a viabilidade celular. - Realizar a dissecção.
Nota: O cérebro deve serextraiu-se rapidamente (<45 segundos).- Usando o bisturi cortar a pele superficial na parte superior do crânio a partir de rostral para caudal.
- Descascar o couro cabeludo de cada lado da cabeça.
- Com uma tesoura pequena ponta afiada em linha reta, cortar a placa interparietal ao longo da sutura lambdoid para remover o cerebelo. Remover o osso occipital.
- Usando as mesmas tesouras, cortar a sutura sagital.
- Deslize a pinça de punção embarcação (ou fórceps se quebram um crânio de ratos) abaixo de cada ossos parietais e puxe para expor o cérebro.
- Usando a pinça hemostática curvas, apertar os ossos frontais para quebrá-las, em seguida, use uma pinça ou fórceps de punção navio para remover os ossos quebrados. Cortar e remover a dura-máter o mais suavemente possível, pois ele pode interferir com a dissecção.
- Deslize a espátula abaixo do cérebro e puxe o cérebro fora do crânio para colocá-lo na câmara de corte (bandeja de tampão) previamente preenchido com ACSF gelado. Deixe o cérebroesfriar por 1-2 min.
- Prepare a plataforma dissecção, preenchendo uma placa de Petri com gelo e água gelada para permitir uma maior superfície de contato, cubra com a tampa e colocar um papel de filtro no topo. Molhar o papel de filtro com ACSF frio.
- Uma vez que o cérebro é arrefecida, colocar o cérebro no prato de Petri cheio de gelo, e executar rapidamente a dissecção apropriado para a obtenção do plano de corte desejado.
- Para obter fatias sagital contendo o núcleo accumbens (NAC), use uma única lâmina de barbear de ponta para cortar e remover os tubérculos olfactivos e o cerebelo se eles ainda estão presentes. Em seguida, execute um corte sagital de 2 - 3 mm da borda lateral do hemisfério direito de obter a superfície plana que será colado no espécime segurando placa (veja o passo 2.8.11).
Nota: corte apenas 2-3 mm a partir da borda lateral do hemisfério permitirá a recolha de fatias contendo o Nac de ambos os hemisférios. A dissecção apropriado dependerána região do cérebro que é investigado. Aqui, a dissecção é realizada neurônios tão Nac podem ser gravados em fatias de cérebro sagital. - Rapidamente cola (utilizando cola de cianoacrilato aplicado a placa de sujeição de amostra) a superfície de corte plana do cérebro sobre a placa de acordo com o plano de corte desejado. Para obter fatias de cérebro sagital veja o passo 2.8.10.
- Imediatamente coloque e fixe o espécime segurando placa na câmara de corte de modo que o cérebro é cortado rostro-caudal (para a segurança, configurar o suporte da lâmina somente quando a placa de amostra é garantido).
- Defina o vibratome com parâmetros adequados de corte (parâmetros utilizados no laboratório para o vibratome mencionado em Materiais: velocidade 3-4, vibração 9-10, e fatia de espessura de 250 um).
- No momento do corte, use uma pipeta de transferência de plástico cortado para transferir as fatias de cérebro para a câmara de recuperação (à temperatura ambiente) (veja o passo 2.3). O tempo de recuperação pode variar dependendo do tipo neuronal que está sob estudo(Tipicamente 30-90 min).
3. Gravação Micropipetas e Preparação Rig
- Consulte as orientações específicas do manual do usuário extrator para obter as propriedades desejadas micropipeta.
Nota: Para MSNs, usamos uma gama de resistência pipeta de 3,2-4,0 mohms. - Oxigenar o ACSF e ajustar o fluxo de 2 ml / min. ACSF vácuo utilizando um peristálticas linhas de bomba de vácuo instalado ou na instalação.
- Ligue o controlador de aquecedor a perfusão e ajustar as regulações da temperatura, a fim de se obter a temperatura desejada (por exemplo, 31,8-32,2 ° C).
Nota: A estabilidade térmica depende de ter tanto a nível ACSF constante e velocidade de fluxo constante na câmara. Uma vez que várias propriedades biofísicas dos neurónios (por exemplo, a resistência de entrada, Ri, também chamado de resistência da membrana, Rm) são sensíveis à temperatura, a manutenção de uma temperatura estável é importante. - Ligue compuamplificador controlado-ter, câmera, micromanipulador e luz de fundo microscópio. Se executando uma experiência que requer estimulação elétrica do tecido, ligue controlador de estímulo e a unidade de isolamento.
Nota: Alguns amplificadores de outros fabricantes recomendam um "warm-up" antes de usar, por isso, recomenda-se consultar o manual para o procedimento de operação exata. - Comece captura da câmera, a aquisição de sinal e software amplificador.
- Fatia Colocação e Visualização:
- Usando uma transferência pipeta de plástico-aparado ponta, desenhe delicadamente em uma fatia do cérebro da câmara de recuperação.
- Coloque a pipeta de transferência na câmara de gravação e apertar suavemente a fatia para fora da pipeta para a lamela que reveste a parte inferior da câmara.
Nota: Enquanto não estouro está ocorrendo, é inofensivo para ter algum ACSF da câmara de recuperação de derrame para o banho. - Utilize uma pinça para alterar a posição da fatia so A área desejada irá ser colocada exactamente no centro da câmara de gravação. Use o microscópio de baixa potência (4X) lente objetiva e da ocular para a assistência no posicionamento.
- Depois de a posição desejada tenha sido atingida, garantir a posição da fatia de cérebro com um porão para baixo fatia (também conhecido como um "harpa") na câmara.
- Mudar para alta potência (40x) lente objetiva e baixe suavemente até que o contato é formado com a ACSF na câmara.
- Use a roda de ajuste fino para trazer o tecido em foco. Enquanto em contato com a ACSF, não use a roda de ajuste grosseiro no microscópio como abaixar a lente objetiva excessivamente pode esmagar a fatia ou até mesmo quebrar a lâmina de cobertura que reveste o fundo da câmara, o que pode causar ACSF para derramar no condensador e danificá-lo.
- Quando o foco é em nível tecidual, observar células na região alvo de forma. As células mortas são facilmente identificáveis pela sua membrana plasmática inchou e núcleo (<strong> Figura 1E). As células saudáveis deve aparecer como redondo, oval, ou estruturas homogêneas elípticas (Figura 1E).
- Procure uma célula alvo. Marcá-lo na tela do computador, a fim de ajudar a guiar a micropipeta gravação. Se estiver usando um software como o QCapture, desenhar um quadrado em torno da célula-alvo, mantendo o botão esquerdo do mouse.
- Elevar a lente objectiva de modo que haverá espaço suficiente no cone formado pela lente objectiva estar em contacto com o ACSF para colocar e deslocar a micropipeta gravação.
- Micropipeta colocação e posicionamento
- Usando uma seringa de 1 mL, uma agulha microsseringa não metálico, e um filtro dedicado, preencher uma micropipeta com a solução interna preparado antecipadamente de acordo com a experiência planeada (K + Cs + ou com base na solução baseados interno, ver passos 1.1., 1.2 e Materiais para a composição). Use solução suficiente para que o internosolução entra em contacto com o eléctrodo de fio de prata revestido por cloreto de dentro do suporte da micropipeta.
Nota: O eletrodo de fio de prata pode ser clorada por imersão em água sanitária. trifosfatos de nucleósido (ATP e GTP) pode ser adicionado à solução antes da utilização interna. Manter a seringa contendo a solução em gelo para evitar a degradação do ATP / GTP. - Certifique-se de que não há bolhas de ar na micropipeta como eles podem sair enquanto a micropipeta é no tecido e obscurecer a fatia.
- Coloque a micropipeta no suporte de eléctrodo de modo que a solução entra em contacto com o eléctrodo de fio de prata revestido cloreto.
- Apertar a tampa da pipeta de modo a que a anilha de cone irá formar uma vedação em torno da micropipeta.
- Aplicar pressão positiva antes da imersão da micropipeta em ACSF para evitar que os detritos entrem na pipeta.
- Colocar o andar de entrada na posição de bloqueio (de frente para a câmara), e utilizando o micromanipulador, gUIA-o para baixo em direcção à câmara pelo que é mais ou menos por baixo do centro do objectivo imerso.
- Ao mover-se a micropipeta com a micromanipulador (fixado em média a alta velocidade), utilizar o ecrã do computador para localizar a micropipeta e guiá-lo para o local da célula no eixo XY.
- Medir a resistência micropipeta pela aplicação de um passo de tensão (por exemplo, 4 mV para 100 ms), que pode ser realizada manualmente ou automaticamente através do software específico, tal como o modo de 'banho' se usando o "Teste de Membrana" no software Clampex (ver também o passo 4) . A fim de se certificar não há bolhas de ar ou quaisquer outros objectos estranhos bloquear a micropipeta, aplicar pressão positiva utilizando a seringa cheia de ar (por exemplo, 30 cc seringa) ligado ao titular da micropipeta com tubagem de polietileno.
- Depois de limpar a micropipeta, realizar um deslocamento para reduzir a corrente de pipeta para zero de tensão, que pode ser realizado manualmente ou através de software específico, tais como & #39; compensado "no comandante amplificador controlado por computador pipeta.
Nota: Esta função irá compensar qualquer tensão causada por diferenças de concentração entre a banheira e as soluções micropipeta (ou seja, o potencial de junção líquida 20).
- Usando uma seringa de 1 mL, uma agulha microsseringa não metálico, e um filtro dedicado, preencher uma micropipeta com a solução interna preparado antecipadamente de acordo com a experiência planeada (K + Cs + ou com base na solução baseados interno, ver passos 1.1., 1.2 e Materiais para a composição). Use solução suficiente para que o internosolução entra em contacto com o eléctrodo de fio de prata revestido por cloreto de dentro do suporte da micropipeta.
4. Membrana de Teste
Nota: Este passo aplica-se ao amplificador mencionado nos Materiais.
- Ao usar um comandante amplificador controlado por computador, sempre defini-lo em modo de tensão-clamp para realizar o teste de membrana.
Nota: Quando o teste da membrana é ajustado no modo de "banho", a membrana de teste permite a medição da resistência de micropipeta e a resistência do selo, quando o selo é formado. - Uma vez que a membrana é rompido (veja o passo 5.8), mude o teste de membrana para o modo "Cell", de modo que a resistência série (R s) (também chamado de resistência de acesso, R a), R i e capacitância de membrana (C p) podeser obtido.
5. Aproximação final, formação de selo, e obter a configuração de célula inteira
- Usando a roda de foco fino, começar a se concentrar para baixo, baixando o micropipeta gradualmente. Sempre o foco para baixo primeiro e depois baixar a micropipeta para baixo para o plano de foco. Isto irá assegurar que a ponta da micropipeta não penetrará abruptamente na fatia.
- Quando a micropipeta entra em contato com a superfície da fatia, diminuir a velocidade micromanipulador para o modo de médio-baixo.
- Gentilmente aplicar pressão positiva leve com a seringa cheia de ar ligado ao titular da pipeta para limpar todos os detritos da trajetória de aproximação.
- Abordagem a célula quer alternando com os botões de controle XYZ, ou aproximando-se na diagonal (se o modelo micromanipulador permite que ele), onde ambos os eixos XZ são alterados com a rotação do botão do eixo Z. O último método vai evitar a compressão vertical de tecido.
Nota: Aqui, o objectivo épara se aproximar da célula por infligir danos mínimos à fatia. Quando a micropipeta está suficientemente perto para a célula aparece uma ondulação (uma descoloração rodada de superfície celular causada pela pressão positiva aplicada através da ponta da micropipeta) (Figura 2). - Quando a cavidade (Figura 2-1), aplicar uma sucção fraca e breve através do tubo que está ligado ao tubo de sucção titular da pipeta, de modo a criar a vedação (Figura 2-2). Manter o controlo da membrana de teste.
Nota: Se uma vedação parcial é formado (<1 GÊ), injetando correntes negativas, diminuindo a retenção potencial (no comandante amplificador controlado por computador) pode facilitar a formação de selo e chegar gigaohms de resistência ( "selo gigaohm" ou "gigaseal"> 1 - 5 GÊ). A alta resistência do selo (> 1 GÊ) vai tanto a contaminação por ruído limite para o sinal gravado e contribuir para a estabilidade mecânica dopatch. - Enquanto está a formar uma gigaseal, utilizar o comandante amplificador controlado por computador para trazer potencial de exploração da célula tão próximo quanto possível fisiológico potencial de repouso (resto V), a fim de evitar alterações súbitas uma vez que a membrana é rompida. Por exemplo, MSNs são geralmente a -70 ou -80 mV (fisiológica V resto: -70 a -90 mV) fixada tensão.
- Após a gigaseal formou, compensar a capacitância rápido e lento manualmente ou automaticamente. Se estiver usando um comandante amplificador controlado por computador, tais como comandante Multiclamp, pressione 'Auto' para 'Cp rápido' e 'Cp lenta ".
- Se o vedante mantém-se estável e, acima de 1 GÊ (ou injecção de menos do que 10-20 pA para manter a célula no potencial de membrana desejada), aplicam-se uma breve e forte sucção através do mesmo tubo como em 5.5 a ruptura da membrana do plasma (Figura 2 -3).
Nota: Isso pode levar várias tentativas. Uma boa ruptura da membrana é conseguida Wsucção galinha é realizada com força suficiente de modo que a membrana rompida não obstruir a micropipeta (o que pode levar a um aumento em I s durante a gravação), mas fracamente o suficiente, a fim de não extrair de uma grande parte da membrana ou da célula. - Depois de atingir uma configuração de célula inteira de sucesso, controlar regularmente a localização micropipeta para avaliar e corrigir desvio significativo, pois pode levar à perda do patch. Deriva amplitude pode variar de acordo com vários factores, por exemplo, a qualidade da instalação do equipamento e forças puxando o headstage. Idealmente, a deriva deve ser quase inexistente.
- Ao mudar para o modo "Cell" no teste de membrana, visualizar diferentes parâmetros da célula, tais como R i, R s e C p. Monitorar esses parâmetros durante a gravação.
Nota: Todos estes parâmetros podem ajudar a avaliar o estado de saúde inicial das células e tipos de células (ver "teste Membrane" seção, passo 4). - Uma vez the acima etapas forem concluídas, permanecem em modo de tensão-clamp para medir correntes (por exemplo, EPSCS, IPSCs), ou mudar para o modo atual-clamp se o planejamento para medir alterações na voltagem da membrana (por exemplo, potencial de ação de tiro). Para este último, injectar corrente positiva ou negativa para manter a célula na voltagem da membrana desejada (para executar este passo, referir-se ao amplificador guia manual).
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Representative Results
Temperatura, um fator que é facilmente controlada pelo experimentador, influencia as propriedades biofísicas de canais iônicos e receptores, e, assim, a forma de onda de correntes pós-sinápticas (PSCs) (EPSC e iPSCs) e a capacidade dos neurônios para provocam picos. Figura 3 e a Figura 4 mostram o efeito da temperatura sobre o disparo neuronal e a inclinação da EPSCS evocados (eEPSCs), respectivamente. O padrão de disparo (Figura 3) (ie, latência para o pico 1 st, spike número, frequência, e ação de forma de onda potencial) é formada por uma abertura e fechamento de canais específicos de iões dependentes da voltagem programada e coordenada (Na +, Ca 2 +, e K +), um processo sensível à temperatura. a Figura 3 mostra como o número médio de pico aumenta com a temperatura. Note-se que nas condições experimentais descritas aqui (gravações MSNs), embora Freque picoO NCY não parecem ser alterado à temperatura subfisiológica (28 ° C), aumenta significativamente quando a temperatura atinge o nível fisiologicamente relevante (32 ° C). A Figura 4A mostra um exemplo de como a inclinação da eEPSCs, um parâmetro que é comumente utilizada para avaliar a força sináptica, aumenta com a temperatura.
Embora R s pode ser um pouco controlada pelo experimentador, ou seja, através de uma abertura de membrana eficiente quando a transição de estado vedação à configuração de célula inteira, R é normalmente aumenta lentamente durante a gravação. Isso pode ser o resultado de vários eventos incontroláveis, por exemplo, membrana re-fechamento ou detritos entupimento da ponta da pipeta durante a gravação. Uma tentativa de re-abrir a membrana através da aplicação de uma leve sucção, embora possa comprometer o patch, às vezes pode ajudar a manter um R s estável. Em todos os casos, porque as alterações de P S pode alTer a forma de onda do sinal eléctrico em estudo, deve ser cuidadosamente monitorada, e particularmente quando a gravação de unidades (modo de tensão-grampo). A Figura 4 mostra que, quando aumenta RS (Figura 4B), amplitude de correntes mediadas pelo receptor de glutamato (eEPSCs ) diminui (Figura 4C, D). Normalmente, os experimentadores descartar os dados quando mudanças em R s superior a 15% (por exemplo, este laboratório), no entanto, alguns laboratórios de fazê-lo a partir de uma mudança de 20%. Este critério deve ser indicada na secção de método do artigo.
Para um neurônio definido, R i pode ser influenciada por vários fatores, incluindo a temperatura, a saúde celular, e qualidade de patch. Especificamente, quando R i diminui, amplitudes PSC ou capacidade dos neurônios para gerar picos também diminui. Por exemplo, a Figura 4E mostra que quando R i não varia significativamente, the número de espigas permanecem relativamente estáveis (Neuron 1); e quando R I aumenta, o número de espigas aumenta também (Neuron 2). Assim, e de forma semelhante a R s, R i devem ser cuidadosamente monitorizados, como 10% mudanças são suficientes para dados de polarização.
Tal como descrito acima, é fundamental para controlar ou monitorizar a temperatura, Rs, R e i durante gravações. Por exemplo, as mudanças observadas no sinal que está sob estudo (PSCs ou disparo) pode ser devido a alterações (ou a falta de controle) desses fatores, em vez de o efeito de manipulações experimentais, por exemplo, pré vs. pós-efeitos de aplicação de banho de drogas.
Figura 1. Custom-made Recovery Câmara (AD) e uma imagem de uma fatia do cérebro em 400X Mostrando saudável e Dead Neurônios (E). DE ANÚNCIOS)O procedimento para fazer uma câmara de recuperação personalizado é descrito no passo 2.1. E) Imagem do NAC MSNs shell medial em uma fatia do cérebro em 400X, mostrando exemplos de saudáveis (setas vermelhas) vs. neurônios mortos (setas azuis). Observe que, embora algumas células são indicados como saudável, seu aspecto esférico indicam que eles podem não ser tão saudável como desejado (setas vermelhas com asteriscos). Estado de saúde final é avaliada com base em V descanso e R i depois de conseguir a configuração de célula inteira. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Diagrama que representa as fases processuais básicas para a obtenção de um Gigaseal e estabelecer a configuração de célula inteira. Quando a micropipeta está perto o suficiente para the celular para criar uma covinha na membrana plasmática (passo 1, Abordagem), aplicar uma sucção breve e suave para criar um contacto apertado entre a micropipeta e a membrana plasmática. Se realizada corretamente, o contato irá fortalecer e a resistência vai aumentar e chegar a 1 GÊ (gigaseal) ou mais (passo 2, a formação de Seal). Uma vez que o selo é estável e, acima de 1 GÊ, aplicar uma sucção breve e forte para romper a membrana plasmática (passo 3, a configuração de célula inteira). Atingir a configuração de célula inteira vai permitir a continuidade entre o citoplasma e o interior da micropipeta. Para mais detalhes, veja o passo protocolo de 5,1-5,8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Neuronal Firing (Intrínseca Excitabilidade) é avaliado em Current-clam Modo P. Aqui, uma série de pré-definida e incremental de passos corrente é dada, a fim de provocar alterações na tensão da membrana, e assim desencadear potenciais de acção. A) Número médio pico aumenta com a temperatura. vestígios B) Amostra a 280 Pa do NAc MSN escudo mediais em três configurações diferentes de temperatura (24 ° C, n = 9; 28 ° C, n = 5; e 32 ° C, n = 6). A temperatura na câmara de gravação afecta directamente a frequência de pico. No entanto, note que, embora a frequência de pico não parece ser alterada a temperatura subfisiológica, ele aumenta significativamente quando a temperatura atinge 32 ° C, uma temperatura fisiologicamente relevante. Os neurônios são realizadas a -80 mV. Two-way ANOVA: interação, p <0,0001; efeito da temperatura, p = 0,0041; Testes post hoc: 24 ° C e 28 ° C são ambos significativamente diferente de 32 ° C, ** p <0,01. Os dados estão representados como a média ± SEM. Calibração: 200 mseg, 50 mV.jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeito da Temperatura, Rs, R e I na forma de onda do Exemplo sinal eléctrico em Estudo. A) de eEPSC amplitude a partir de uma única concha MSN NAc. O aumento da temperatura de 24 a 28 ° C e a 32 ° C aumenta o declive da eEPSCs. Observe que as alterações induzidas pela temperatura em eEPSCs inclinação ocorrer rapidamente. Aqui, eEPSCs inclinação é avaliada em modo de tensão-clamp. Calibração: 5 ms, 100 pA BD) Exemplo de eEPSCs inclinação de um único escudo MSN Nac.. Quando aumenta a R s (b), a inclinação de eEPSCs diminui (C). D) Análise da correlação entre eEPSC inclinação como uma função de rs. R de Pearson = -0,5717, p <0,0001. Os neurónios são Exemplo de vestígios de dois neurónios que mostram o efeito de R i na capacidade do neurónio para gerar picos a -80 mV. E apertada-tensão). Os neurônios são atuais pinçada e realizada a -80 mV. Calibração:. 200 ms, 50 mV Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve o procedimento básico para a realização de experiências de célula inteira de patch-clamp em neurónios em fatias de cérebro. No entanto, a complexidade, o potencial e sensibilidade desta técnica não pode ser totalmente descrito neste artigo. Aqui, tentamos delinear os passos mais básicos e sublinhado parâmetros importantes que devem ser controlados para alcançar gravações de células inteiras de sucesso e rigorosos. Para mais aprendizado teórico, muitos livros e artigos foram publicados em ambas de células inteiras de gravação de patch-clamp em fatias de cérebro 3,21-24 e em métodos que podem refinar as soluções utilizadas 25-27 a fim de reforçar a viabilidade celular. Para realizar rotineiramente gravações próprias, melhoria das competências técnicas através da prática intensiva é necessária. horas, no entanto, com a correcta aplicação das medidas mencionadas, as células podem ser corrigidas post-mortem, fornecendo informações importantes sobre mudanças nas funções sinápticas e excitabi intrínsecalidade.
Em geral, além da importância de se preparar cuidadosamente ambas as soluções ACSF e micropipeta interna, cada passo da dissecção cérebro, cortando, alcançando a configuração de célula inteira de sucesso, e obtenção de dados rigorosa e imparcial exige prática intensiva. Em primeiro lugar, é essencial para gerar fatias de cérebro saudável. Resumidamente, dissecção rápida do cérebro (de preferência <45 seg), a manutenção da baixa temperatura (0-2 ° C), enquanto cortando, e soluções de corte adequados, todos desempenham um papel importante no sentido de garantir a saúde das células. É digno de nota mencionar que as soluções que cortam podem diferir entre laboratórios e de acordo com o tipo de célula e / ou a região do cérebro que irá ser investigado. Ao cortar o striatum dorsal ou Nac, nosso laboratório e outros usam ácido quinur�ico para a solução corte para minimizar processos de excitotoxicidade 28-33, no entanto, outros métodos podem também ser utilizados, tais como soluções à base de sacarose 34, Mg2 + elevado de Ca2 + 35, etc. Estes são apenas alguns exemplos e podem ser ajustados de acordo com a sensibilidade do cérebro ou do cérebro região para processos de excitotoxicidade o (por exemplo, devido à idade). Para mais informações sobre as soluções e viabilidade celular, consulte 25-27. Em última análise, a concentração de aniões, catiões, e outras drogas (por exemplo, ascorbato, antagonistas do receptor de glutamato) que compõem soluções de corte em fatias é determinada de modo que ela imita o fluido cerebrospinal e minimiza tanto quanto possíveis processos de excitotoxicidade que ocorrem durante o corte. O protocolo apresentado neste artigo descreve soluções padrão que foram usados rotineiramente em estudos anteriores dos autores 28-31 quando estou gravando de MSNs no CAN ou o striatum dorsal em fatias de cérebro. Além disso, o ajuste adequado da osmolaridade para ambas as soluções ACSF e micropipeta interna são essenciais para a formação de vedação bem sucedida e manutenção de conf de células inteirasiguration. Para criar um gradiente de concentração a partir da solução a uma solução extracelular intra-pipeta, ACSF osmolaridade deve ser mais elevado do que para as soluções internas micropipeta. Idealmente, a diferença pode variar de 10 a 30 mOsm.
Alcançar uma configuração de célula inteira de sucesso é mais um passo importante para a realização de gravações eficientes. Em primeiro lugar, pipeta capacitância pode ser ajustado uma vez que a pipeta é colocado no banho. Embora as configurações automáticas são geralmente fixados corretamente, é aconselhável a utilização de ajustes rápidos e lentos de capacitância celular com cuidado, pois estes podem danificar o celular quando não for realizada de forma adequada. Em segundo lugar, a sucção membrana breve que é necessária para romper a membrana irá conduzir a uma abertura significativa da membrana e, assim, permitir uma boa comunicação entre intracelular e meio intra-micropipeta. Isto irá assegurar que R s permanecerá relativamente estável durante a gravação. Se utilizando uma solução de base micropipeta-Cs,o potencial de repouso da membrana deve ser avaliada imediatamente após a criação da configuração de célula inteira (ver passo 5.8). Com efeito, a difusão de Cs + dentro da célula causa a perda de potencial de membrana de repouso. Para determinar o potencial de repouso apropriado, o potencial de junção líquida deve ser avaliado 20. No entanto, o experimentador pode reportar o potencial de repouso, que é observada após a quebra da membrana (após o passo 5.8) e escolher não para ajustar o potencial de junção líquida. Em todos os casos, deve ser indicado na secção de método do artigo. Após a criação da configuração de célula inteira, C P também pode ser obtido e pode ser utilizado como um parâmetro para avaliar a saúde indirecta de células e / ou tipo de célula. Em terceiro lugar, quando começou a gravação, outros parâmetros devem ser rigorosamente monitorizados. Fatores críticos que devem ser controlados ao avaliar a excitabilidade neuronal são a temperatura, R s, e R i.
Comomencionado acima, R i e C P pode ser um indicativo da saúde das células e / ou tipo de célula. Por exemplo, a membrana do plasma, actua como um isolante, separa carga (resultante de diferenças na composição do intracelular e soluções extracelulares), que em conjunto constituem a capacitância da membrana. Quanto maior for a superfície da membrana (específico neuronal), quanto maior a capacitância. É então não é surpreendente que tipos neuronais específicos para exposições C p e R i (matematicamente relacionados com a C p) que estão dentro da mesma gama. Rs está directamente relacionado com o tamanho da ponta da pipeta, e, portanto, é geralmente indicativo da qualidade ou o tamanho de abertura da membrana. Resumidamente, ao estabelecer a configuração de célula inteira, o citoplasma torna-se electricamente contínua com a solução na micropipeta e completamente isolado do meio externo. R S (ou R a) origina a partir da resistência para os Current a fluir a partir de uma pipeta para o citoplasma. Para algumas condições de gravação (por exemplo, o modo de corrente-clamp ou gravação de tensão-clamp de correntes de iões dependentes da voltagem), R s deve ser compensada adequadamente (ver a Ref. 3,21-24 ou amplificador guia manual para uma compensação adequada R s) .
Conforme descrito na Figura 4, s R é particularmente importante, uma vez que pode afectar dramaticamente a forma de onda de sinal eléctrico, por exemplo, EPSC amplitude. No entanto, R s devem ser cuidadosamente monitorizados para interpretações fora de linha de quaisquer efeitos observados. No caso de a membrana não foi rompido corretamente, entupimento ponta da micropipeta ou re-fechamento da membrana pode ocorrer, em que aumenta e viés processo R s A forma de onda do sinal elétrico em estudo (Figura 4B-D). Em resumo, muitos problemas podem ser encontrados durante a gravação, e aqueles geralmente caem em três categorias: i) o tecido relacionada com a, Por exemplo, o aumento da mortalidade das células devido à má dissecção, desajuste da osmolaridade ACSF, e hipóxia; ii), por exemplo, problemas de ruído e de aterramento, controle de temperatura, fatia e micropipeta posicionamento relacionados com o equipamento, etc.; e iii) a interpretação dos dados, por exemplo, observadas alterações podem ser o resultado de artefactos experimentais indesejáveis polarização os dados como as alterações nos parâmetros de alteração de forma de onda eléctricas (R i, R s, da temperatura, ver Figura 3 e 4) em vez do resultado de experimental manipulações.
Embora a gravação de célula inteira em fatias de cérebro é uma técnica poderosa para avaliar dependente da experiência de plasticidade, esta abordagem limita a interpretação dos dados. Em particular, três limitações importantes da técnica de gravação de célula inteira são os seguintes: (i) as alterações na função e expressão níveis de proteínas específicas (por exemplo, canais de iões) não podem ser diferenciadas; (Ii) porque estatécnica avalia o fluxo de corrente através de toda a membrana (ou parte substancial), ela não fornece sub-celular localização precisa das correntes iónicas ou alterações que são observadas; e (iii) capacidade de invasão de configuração de célula inteira leva à diálise do conteúdo da célula, e assim, para a interrupção da maquinaria molecular intracelular necessário para alguns fenómenos de desenvolver ou para ser expressa. Uma maneira de evitar a diálise é a utilização de gravações de eletrodos pontiagudos ou a técnica de patch perfurada 3,21,23. Relativamente a este último, moléculas de antibióticos formadores de poros, tais como nistatina pode ser adicionado à solução da pipeta. A formação destes poros permitirá a gravação de correntes sem perturbar os mecanismos segundo mensageiro no interior da célula. No entanto, os recentes avanços na nanotecnologia e desenvolvimento de nanoeletrodos 36 fornecem ferramentas poderosas para melhorar gravações neuronais. Tal avanço tecnológico em neurociência ainda estão sob development e agora estão colocando em nosso alcance a possibilidade de realizar patch-clamp e intracelulares gravações com capacidade de invasão mínima, ou seja, mantendo o meio intracelular intacto, e investigar as funções dos canais de íons no interior de compartimentos sub-celulares que eram até agora não acessíveis com clássico eletrodos de patch-clamp 37.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por fundos de inicialização UT Southwestern (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4•H2O, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H2O, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
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