Summary
Denne protokollen beskriver grunnleggende prosedyretrinn for å utføre hel-celle patch-clamp opptak. Denne teknikken tillater studiet av det elektriske oppførsel av neuroner, og når den utføres i hjerneskiver, tillater vurdering av forskjellige nevronale funksjoner fra nevroner som fremdeles er integrert i forholdsvis godt bevart hjernen kretser.
Abstract
Hel-celle patch-clamp-opptak er en elektrofysiologisk teknikk som tillater studiet av de elektriske egenskapene til en vesentlig del av nervecellen. I denne konfigurasjonen er den mikropipette i tett kontakt med cellemembranen, noe som forhindrer strømlekkasje, og dermed gir mer nøyaktige ioniske strømmålinger enn den tidligere brukte intracellulære skarp elektrode opptaksmetode. Klassisk, kan hel-celle-opptak bli utført på neuroner i forskjellige typer av preparater, inkludert cellekultur modeller, dissosierte nevroner, nevroner i hjerneskiver, og i intakte bedøvede eller våkne dyr. Oppsummert har denne teknikken umåtelig bidratt til forståelsen av passive og aktive biofysiske egenskapene hissige celler. En stor fordel med denne teknikken er at den gir informasjon om hvordan spesifikke manipulasjoner (f.eks farmakologiske, experimenter-indusert plastisitet) kan endre spesifikke nevronale funksjoner eller channels i sanntid. I tillegg er betydelige åpning av plasmamembranen tillater den indre pipetten løsningen for å diffundere fritt inn i cytoplasma, noe som gir middel for å innføre medikamenter, for eksempel, agonister eller antagonister av spesifikke intracellulære proteiner, og manipulering av disse målene uten å endre deres funksjon i nabocellene. Denne artikkelen vil fokusere på hel-celle opptak utført på nevroner i hjernen skiver, en forberedelse som har fordelen av å spille inn nevroner i relativt godt bevart hjernen kretser, dvs. i en fysiologisk relevant sammenheng. Spesielt når det kombineres med riktig farmakologi, er denne teknikken et kraftig verktøy som tillater identifisering av spesifikke neuroadaptations som skjedde etter alle typer opplevelser, for eksempel læring, eksponering for narkotika av misbruk, og stress. I sammendraget, hel-celle patch-clamp opptak i hjernen skiver sørge for midler til tiltak i ex vivo forberedelse varige endringeri nervefunksjoner som har utviklet seg i intakte våken dyr.
Introduction
Den patch-clamp teknikk, en elektrofysiologisk teknikk som har blitt utviklet i slutten av 1970-tallet 1,2, er et primært verktøy for å studere enkelte eller flere ionekanal funksjoner i levende vev. Blant de forskjellige koblings konfigurasjoner som kan oppnås, hel-celle patch-clamp opptak tillater studiet av den elektriske oppførsel til en vesentlig del av nervecellen. Klassisk, blir denne teknikken utført in vitro enten på hjernesnitt, fersk dissosierte neuroner, eller på cellekultur-modeller 3. Når utført på nevroner i hjernen skiver, presenterer denne teknikken flere fordeler. Spesielt: (i) neuroner tas opp i forholdsvis bevart hjernen kretser som til en viss grad, og sammenlignet med cellekulturpreparater, tilveiebringe et miljø som er fysiologisk relevant 3. Dette gjør det mulig å fange tidlig, eller til å overvåke i sanntid, cellulære og molekylære hendelser som utløses av en hvilken som helst form for akutt pharmacologiCal manipulasjoner - en tidsmessig oppløsning som ikke kan oppnås ved hjelp av klassisk in vivo forhold; (ii) evne til å visuelt identifisere områder av hjernen i hjerneskiver gir høy regional spesifisitet 3 både for hjernen regionen studert og for bestemte nerveceller når de uttrykker fluorescerende markører; (iii) adgang til det intracellulære rommet i cellen ved å åpne en vesentlig del av plasmamembranen (i motsetning til å punktere membranen med en skarp mikropipette for intracellulære opptak) 4. I sin tur gir dette innholdet eller konsentrasjon av spesifikke ioner som utgjør intern løsning som skal endres så molekylære mål eller cellulære mekanismene kan studeres under forskjellige forhold. For eksempel: Ved å etablere hel-celle konfigurasjon, noe bestemt medikament (f.eks antagonister) at man kan legge til opptaket mikropipette (patch pipette) løsning vil direkte diffus i cytoplasma og handle på egen putative intracellulære mål uten å endre målet funksjon i nabocellene. I tillegg, sammenlignet med skarp mikropipette opptak, den store åpning ved spissen av patch clamp elektrode gir lavere motstand, mindre konkurrerende støy, og derved bedre elektrisk aksess til innsiden av cellen 4. Imidlertid merke til at den store åpningen i pipettespissen kan føre til celle dialyse, og derved tap av intracellulær molekylære maskineri som kan være kritisk for ekspresjon av de biologiske fenomener som er under undersøkelse 5,6. I dette tilfellet kan skarpe elektrode innspillinger være mer egnet. Denne type opptak er det nødvendig mikropipetter med en pore som er mye mindre enn de som brukes for hel-celle-opptak, for derved å hindre det meste av ionebytter mellom intracellulært plass og den indre pipette-løsning.
Enhver form for erfaring (akutt eller kronisk), inkludert læring 7-10, eksponering for narkotika av misbruk 11,12, stress 13,14, etc., kan endre ulike aspekter av neuronal funksjon i bestemte områder av hjernen. Fordi disse endringene krever ofte tid til å utvikle (timer til dager), hel-celle opptak i hjernen skiver fra dyr som har gjennomgått en spesiell opplevelse tillate forskere å identifisere disse endringene. I utgangspunktet, mange (om ikke alle) komponenter som deltar i nervefunksjoner (f.eks ligand-aktiverte ionekanaler, spenningsstyrte ionekanaler, neurotransmitter transportører), og dermed hjernen krets aktivitet og atferd, kan endres av erfaring (erfaring avhengig plastisitet) 10,15-17. På nevronale nivå, kommer hjernekretsen aktivitet fra konstant interaksjoner mellom synaptic (f.eks glutamat overføring) og iboende cellulære oppstemthet faktorer (f.eks axosomato-dendrittiske ionekanaler: natrium, Na +, kalium, K +, og kalsium, Ca 2+ ). Under spesielle forhold ved hjelp av enge-cell patch-clamp elektroteknikk, signal endringer som stammer spesielt fra endringer i synaptiske vs. iboende oppstemthet kan isoleres.
I de fleste tilfeller er synaptisk eksitabilitet vurderes ved bruk av helcelle-spenningsklemmeteknikken. Dette opptaket Modus tillater måling av ione-strøm [f.eks mediert av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoksazolpropionsyre reseptorer ( AMPA-reseptorer) og N-metyl-D-asparaginsyre-reseptorer (NMDA-reseptorer)] via neuronale plasmamembranen samtidig holder membranpotensialet på en fast spenning. Her experimenters benytte interne Mikropipette løsninger som inneholder cesium (Cs +), en bred blokkering av K + -kanaler (nøkkel iboende oppstemthet faktorer). Ved etablering av hel-celle-konfigurasjon, vil diffusjon av Cs + i intracellulære rom å blokkere K + -kanaler, og derved vil tillate både en forholdsvis effektiv plass klemme og prelufte påvirkning av indre oppstemthet faktorer på andre målinger. Space-klemme problemer, dvs. problemer med å spennings klemme hele cellen, oppstår når du spiller inn uregelmessig formede celler (f.eks nevroner), og spesielt nevroner med et stort og komplekst dendrittiske arbor 18,19. Fordi somatisk spenning klemme dårlig kontroller spenning i dendrittiske tre nevroner, ulike aspekter av dendrittiske elektriske signaler som studeres forvrengt i en dendrittiske avstand avhengig måte. Kombinert med farmakologiske verktøy som pikrotoksin (gamma-aminosmørsyre, GABA A reseptor-antagonist) eller kynurensyre (bred blokkering av glutamatreseptorer) oppløst i ekstracellulær løsning (kunstig cerebrospinalvæske, ACSF), tillater denne teknikken måling av glutamat reseptor og GABA A R-mediert strøm henholdsvis.
I kontrast er iboende oppstemthet vanligvis vurdert i dagens-klemme opptaksmodus.I motsetning til spenningsklemmen opptak, lar dette opptaksmodus til måling av variasjoner i membranpotensialer indusert av ione-strømmer som flyter gjennom den nevronale plasmamembranen. Vanligvis er endring i indre oppstemthet vurderes gjennom endringer i evnen til nerveceller til å generere aksjonspotensialer, som krever både Na + og K + kanaler. Derfor, når du utfører dagens-clamp opptak, er mikropipetter fylt med en intern løsning som inneholder K + i stedet for Cs +. Kombinert med farmakologiske midler som blokkerer glutamat og GABA A reseptor-mediert strøm oppløst i ACSF, tillater denne eksperimentelle konstruksjon til måling av bidraget fra indre faktorer (for eksempel K + -kanaler) til nevronal utløsning uten å bli forurenset av eventuelle endringer i synaptiske eksitabilitet faktorer.
Denne artikkelen vil beskrive de grunnleggende nødvendige prosessuelle skritt to (i) forberede sunne hjernen skiver; (Ii) å oppnå hel-celle-konfigurasjon, og (iii) å overvåke grunnleggende parametere for å vurdere synaptiske og indre eksitabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøk ble utført i henhold til protokollene godkjent av UT South Institutional Animal Care Committee og bruk, og ble valgt for å minimalisere stress, ubehag og smerte som oppleves av forsøksdyrene.
1. Solutions
Merk: Forbered Mikropipette interne løsninger på forhånd. For de fleste grunnleggende eksperimentelle formål, bør to typer løsninger nok: Cs + -basert og K + -baserte løsninger.
- Bruk Cs + -baserte løsninger (for eksempel Cs + gluconate løsning, se Materials) for spennings-klemme eksperimenter. Forbered ved RT.
- Forbered 117 mM Cs-Gluconate oppløsning ved blanding av 4,62 g D-glukonsyre (~ 3.696 ml) med 3,54 g CsOH (~ 2,01 ml).
- Legg DDH 2 O til 90 ml og la det likevekt i 30 min.
- Legg de faste ingrediensene (20 mM HEPES = 0,476 g; 0,4 mM EGTA = 15,2 mg, 2,8 mM NaCl = 16,4 mg; 5 mM tetraetylammonium (TEA) Klorid = 83 mg).
- Legg DDH 2 O til ~ 97 ml.
- Juster pH-verdien av oppløsningen med 50% CsOH til 7.2 til 7.3.
- Sjekk osmolaritet og korriger om nødvendig med DDH 2 O.
Merk: Et godt utvalg er ~ 280-285 mOsm. Optimal Osmolariteten bør være 15-20 mOsm under osmolariteten av standard ACSF (vanligvis 300-310 mOsm, 300 mOsm i vårt laboratorium). Osmolaritet kan variere avhengig av løsninger bestemte sammensetninger. - Delmengde til 1000 mL og oppbevares ved -20 ° C eller lavere.
- Forbered, delmengde, fryse, og legge til ATP / GTP til intern løsning på dagen av innspillingen.
- Legg 64,63 mg ATP til 10 mg GTP og oppløses i 637.11 mL av DDH 2 O.
- Forbered 10 ul porsjoner og oppbevar ved -20 ° C eller lavere. Bland hver 100x aliquot med 1000 ul intern løsning på dagen for eksperimentet. Når ATP / GTP tilsettes til den interne oppløsning, opprettholde den på is for å forhindre ATP / GTP degradatipå.
- Bruk K + -baserte løsninger (f.eks K-Gluconate løsning, se Materials) for både Strøm- og spennings klemme eksperimenter hvor K + conductances forblir funksjonelle slik at nevronal utløsning kan vurderes. Forbered ved RT.
- Vei alle materialer i henhold til den ønskede sluttvolum. For fremstilling av 90 ml oppløsning, 120 mM K-glukonat = 2,81 g; 20 mM KCl = 0,149 g; 10 mm HEPES = 0,238 g; 0,2 mM EGTA = 0,008 g; 2 mM MgCl2 = 0,021 g.
- Bruk nok DDH 2 O for å nå 90% av den endelige løsningen volumet. Dette skal sikre at nok plass igjen for pH og osmolaritet justering.
- Etter å legge til og blande alle ingrediensene, sørg for at oppløsningen er klar før måling av pH.
- Mens stadig omrøring løsningen, justere pH til 7.2 til 7.3 ved hjelp av K + hydroksid (KOH).
- Etter justering av pH, bruker osmometer og annonsebare osmolaritet til 280-285 mOsm.
Merk: Optimal osmolaritet bør være 15-20 mOsm under osmolariteten av standard ACSF (vanligvis 300-310 mOsm, 300 mOsm i vårt laboratorium). Osmolaritet kan variere avhengig av løsninger bestemte sammensetninger. - Delmengde til 1000 mL og oppbevares ved -20 ° C eller lavere.
- Forbered, delmengde, fryse, og legge til ATP / GTP til intern løsning på dagen av opptaket (se trinn 1.1.8).
- Forbered en L av standard ACSF (se Materials).
Merk: Vi bruker denne oppskriften i vårt laboratorium ved opptak mellom spiny nevroner (MSN) i hjernen skiver, men oppskrifter kan variere mellom laboratorier, og derfor anbefaler vi eksperimentator bruke en oppskrift som er rutinemessig brukes når du tar opp hjernen regionen av interesse . - Klargjør disseksjon ACSF (kutting oppløsning, ~ 125 ml. Merk: Eksakt volum vil være avhengig av størrelsen på skjærekammeret som det skal fullt ut neddykke hjernen) for bruk itrinn 02.02 til 02.08.
- Forbered 5 mm kynurensyre (for å blokkere glutamat reseptor-indusert eksitotoksiske prosesser) i standard ACSF i et tilstrekkelig volum til å dukke hjernen under kutting. Bruk en ultralyd å oppløse kynurensyre.
Merk: Lengden av ultralydbehandling kan variere avhengig av volumet, og mengden av faste stoffer i oppløsningen. Løsningene må være klar ved slutten av prosessen (ca 1 - 2 minutter i våre betingelser). - Kjøl deg ned mens boblende med 95% O 2, 5% CO 2 gass i en bøtte med is inntil temperaturen når 0-2 ° C.
- Forbered 5 mm kynurensyre (for å blokkere glutamat reseptor-indusert eksitotoksiske prosesser) i standard ACSF i et tilstrekkelig volum til å dukke hjernen under kutting. Bruk en ultralyd å oppløse kynurensyre.
- Forbered ACSF for opptak.
- Ta 1 liter standard ACSF (eller hva venstre fra oppløsningen fremstilt i trinn 1.3) til hvilke egnede farmakologiske midler kan tilsettes avhengig av planlagte eksperimenter.
- For eksempel legge 100 mikrometer pikrotoksin ved opptak eksitatoriske postsynaptiske strøm eller potensialer (EPSCs eller EPSPS), glutamat reseptorantagonister (kynurenic syre, 2 mm; eller en kombinasjon av D-APV 50 uM med CNQX 10 pM) under opptak inhibitoriske postsynaptiske strømmer eller potensialer (iPSCs eller IPSPs), og både pikrotoksin og glutamat-reseptor-antagonister ved vurdering av neuronal avfyring i fravær av enhver påvirkning fra synaptiske arrangementer.
- Ta 1 liter standard ACSF (eller hva venstre fra oppløsningen fremstilt i trinn 1.3) til hvilke egnede farmakologiske midler kan tilsettes avhengig av planlagte eksperimenter.
2. Slice forberedelse
- Konstruer eller få en skive utvinning kammer.
Merk: Prinsippet for en gjenvinning av kammeret er enkel og kan gjøres i laboratoriet (figur 1). I korthet er kammeret en beholder i hvilken en kurv settes inn for å holde hjerneskiver på et nivå som er lavere enn overflaten av ACSF. Ulike vitenskapelige selskaper selger også skive utvinning kamre.- Som et eksempel, få fire ringer (4-6 mm høye) (figur 1A, side utsikt, B, ovenfra) ved å kutte en 30 cc sprøyte. Deretter lim strukket garn (for eksempel kuttet fra en nylon hose) til den ene side av ringene for å holde hjernesnitt (figur 1B) og lim ringene sammen.
Merk: En limpistol kan anvendes. - Så snart de fire ringene er limt, lim et buet likebenet trapes-formet plast vegg til to av ringene (figur 1A og B) for å avlede oksygenbobler fra utvinne hjernesnitt (figur 1C og D). Som vist i figur 1D, sette inn et oksygendiffusjon system (her en gass-dispersjon rør) på samme side som plastveggene.
- Som et eksempel, få fire ringer (4-6 mm høye) (figur 1A, side utsikt, B, ovenfra) ved å kutte en 30 cc sprøyte. Deretter lim strukket garn (for eksempel kuttet fra en nylon hose) til den ene side av ringene for å holde hjernesnitt (figur 1B) og lim ringene sammen.
- Før kutting, oksygen (95% O 2/5% CO 2) og kjøle ned slicing løsning (se trinn 1.4) til 0-2 ° C.
- Fyll tilpasset utvinning kammer med standard ACSF på RT. Kontroller at ACSF er godt oksygenert (20 - 30 min, tid kan variere i henhold til kammervolumet) før plasserer skivene i oppsamlingskammeret. Pass på at gassbobler ikke kommer i direkte contakt med skiver eller forstyrre dem.
- Line vibratome isbitbrettet med is og fyll opp med kaldt vann slik at en tredjedel til halvparten av slicing kammeret er under vann. Plassere en oksygentilførsel system (f.eks gass spre stein) og en temperaturføler i slicing kammeret så verken element forstyrrer bladet bevegelse eller skive manipulasjon nøye.
- Forbered disseksjon området og verktøy er nødvendig for å trekke ut hjernen og dissekere den ønskede hjernen regionen.
Merk: Den nøyaktige disseksjon utføres vil avhenge av den spesifikke hjerneregionen studert som ulike strukturer i hjernen vil kreve å ha klippet på forskjellige plan (f.eks, koronale, sagittale eller horisontale skiver.).- Plasser følgende verktøy på en underlags: halshogging saks, skalpell, små rette skarp spiss saks, fartøy cannulation tang (eller alle kirurgiske verktøy med et bredt tips, for eksempel Rongeurs, som er mer egnet for rottehodeskaller), buede hemostatiske tang, tweezers, slikkepott, øste spatel, filter papir, petriskål, enkelt kant barberblad, og cyanoakrylatlim.
- Når temperaturen når 0 - 2 ° C, overføre slicing løsning på slicing kammeret (bufferbrettet).
- Anesthetize mus i en uttørking kammer ved hjelp av isofluran. Nøyaktige mengde kan variere avhengig av størrelsen av kammeret som brukes, men for en liten skoeske bur bruke noen få dråper (~ 3 - 4). La musen i buret før gjengis immobile (som ikke responderer på taktil stimuli, rundt 15 sek for forholdene som er beskrevet her). Utfør hale og føtter klype tester for å sikre at dyret er dypt bedøvet, og deretter halshogge før hjertet slutter å slå (forbedrer celleviabilitet).
Merk: Med riktig begrunnelse, noen laboratorier få fullmakt til å opptre live halshogging for å minimalisere så mye som mulig eksitotoksiske prosesser og forbedre celle levedyktighet. - Utfør disseksjon.
Merk: Hjernen må væreekstrahert raskt (<45 sekunder).- Bruke skalpell kutte overfladiske hud på toppen av skallen fra rostral til kaudal.
- Skrelle hodebunnen på hver side av hodet.
- Ved hjelp av små rette skarp spiss saks, klippe interparietal plate sammen bakhode sutur for å fjerne lillehjernen. Fjern nakkeknøl.
- Bruke samme saks, klippe sagittal sutur.
- Skyv fartøy kanylering tang (eller Rongeurs hvis bryte en rotte skallen) under hver parietalbena og trekk for å avsløre hjernen.
- Ved hjelp av den buede hemostatic tang, klemme frontal bein å bryte dem, og deretter bruke pinsett eller fartøy kanylering tang for å fjerne beinbrudd. Kutt og fjern dura mater så forsiktig som mulig som det kan forstyrre disseksjon.
- Skyv stekespade under hjernen og trekk forsiktig hjernen ut av skallen for å plassere den i slicing kammeret (bufferbrettet) tidligere fylt med iskald ACSF. La hjernenkjøle seg ned i 1-2 min.
- Forbered disseksjon plattformen ved å fylle en petriskål med is og litt isvann for å gi større kontaktflate, dekker den med lokk og legg et filter papir på toppen. Fukt filterpapiret med kaldt ACSF.
- Når hjernen kjøles ned, plassere hjernen på isen fylte petriskål, og raskt å utføre den aktuelle disseksjon for å oppnå den ønskede planet for kutting.
- For å få sagittal skiver som inneholder nucleus accumbens (NAC), bruke en enkelt kant barberblad for å kutte og fjerne olfactory tubercles og lillehjernen hvis de er fortsatt til stede. Deretter utfører en sagittal snitt på 2 - 3 mm fra den laterale kant av høyre hemisfære for å oppnå den flate som skal limes på prøven holdeplaten (se trinn 2.8.11).
Merk: Skjære bare 2 - 3 mm fra den laterale kant av den halvkule vil tillate oppsamling av stykker som inneholder NAc fra begge halvkuler. Den aktuelle disseksjon vil avhengepå hjernen region som er undersøkt. Her blir disseksjon utføres slik at NAC nevroner kan registreres i sagittal hjerneskiver. - Raskt lim (med cyanoakrylatlim påført prøveholdeplaten) den flate snittflaten av hjernen på platen i henhold til den ønskede planet for kutting. For å få sagittal hjerneskiver se trinn 2.8.10.
- Umiddelbart plassere og sikre prøven holder plate i slicing kammeret slik at hjernen er skiver rostro-caudally (for sikkerhet, sette opp bladholderen bare når prøven plate er sikret).
- Sett vibratome med passende slicing parametere (parametre som brukes i laboratoriet for vibratome nevnt i Materialer: hastighet 3-4, vibrasjons 9-10, og slice tykkelse 250 mikrometer).
- Ved kutting, må du bruke en plast-trimmet overføringspipetten til å overføre hjerneskiver til utvinning kammeret (ved romtemperatur) (se trinn 2.3). Gjenopprettingstiden kan variere avhengig av den neuronale type som er under studien(Typisk 30 - 90 min).
3. Opptak Mikropipetter og Rig Forberedelse
- Se i de spesifikke retningslinjer avtrekker brukerveiledning for å oppnå de ønskede Mikropipette egenskaper.
Merk: For MSN, bruker vi en pipette motstand rekke 3,2-4,0 Megohm. - Oksygenere ACSF og justere strømningen til 2 ml / min. Vacuum ACSF hjelp av en peristaltisk pumpe eller vakuum linjer installert i anlegget.
- Slå på perfusjon varmer kontrolleren og justere temperaturinnstillingene for å oppnå den ønskede temperatur (for eksempel 31,8 til 32,2 ° C).
Merk: Temperatur stabilitet er avhengig av å ha både et konstant nivå ACSF og konstant strømningshastighet i kammeret. Siden flere biofysiske egenskapene til nerveceller (for eksempel, inngangsmotstand, Rj, også kalt membranmotstand, Rm) er temperaturfølsomme, opprettholde en stabil temperatur er viktig. - Slå på datter styrt forsterker, kamera, micromanipulator, og mikroskop bakgrunnslys. Ved å utføre et eksperiment som krever elektrisk stimulering av vev, slå på kontrollenheten og stimulus isoleringsenhet.
Merk: Noen forsterkere fra andre produsenter anbefaler en "varme opp" før bruk, så det anbefales å se i manualen for nøyaktig prosedyre. - Begynn kamera fange, signal og forsterker programvare.
- Slice Plassering og visualisering:
- Ved hjelp av en plast trimmet-tip overføringspipetten, forsiktig trekke i en hjerne skive fra gjenopprettingskammeret.
- Plasser overføring pipetten i opptakskammeret og forsiktig klemme stykke ut av pipetten på dekk foring i bunnen av kammeret.
Merk: Så lenge ingen overløp er oppstått, er det ufarlig å ha noen ACSF fra utvinning kammer søle inn på badet. - Bruk pinsett for å endre posisjonen av skiven so ønsket område vil bli plassert nøyaktig i midten av opptakskammeret. Bruk mikroskop lavt strømforbruk (4X) objektiv og okularet for å få hjelp i posisjonering.
- Etter at den ønskede posisjonen er oppnådd, festes hjernen skive stilling med en skive holde (også kjent som en "harpe") i kammeret.
- Bytt til høy effekt (40X) objektiv og senk den forsiktig til kontakt er dannet med ACSF i kammeret.
- Bruk finjustering hjulet for å bringe vevet i fokus. Mens i kontakt med ACSF, ikke bruk av grovjusteringsrattet på mikroskopet som å senke objektivlinsen overdrevet kan knuse skive eller til og med bryte dekkglass foring i bunnen av kammeret, noe som kan føre ACSF å søles på kondensatoren og skade den.
- Når fokuset er på vev nivå, observere celler i den målrettede regionen for form. Døde celler er lett gjenkjennelige med sin svulmet plasmamembranen og kjernen (<strong> Figur 1E). Friske celler skal vises som runde, ovale eller elliptiske homogene strukturer (figur 1E).
- Se for en målcelle. Merke det på dataskjermen for å hjelpe opptaket mikropipette. Hvis du bruker programvare som QCapture, tegne en firkant rundt målcellen ved å holde venstre museklikk.
- Hev objektivlinse slik at det vil være tilstrekkelig plass i konusen som dannes av objektivlinsen er i kontakt med ACSF å plassere og flytte opptak mikropipette.
- Mikropipette Plassering og posisjonering
- Anvendelse av en 1 ml sprøyte, en metallisk mikrosprøyte nål, og et eget filter, fyller en mikropipette med den interne oppløsning fremstilt på forhånd i henhold til den planlagte forsøket (K + -basert eller Cs + -basert indre løsning, se trinn 1.1., 1.2 og materialer for komposisjon). Bruk nok oppløsning så det indreoppløsningen kommer i kontakt med den kloridet belagt sølv trådelektrode innenfor mikropipette holderen.
Merk: sølv wire elektrode kan kloreres ved å dyppe den i klorin. Nukleosidtrifosfater (ATP og GTP) kan tilsettes til den interne oppløsning før bruk. Oppbevar sprøyten inneholder løsningen på is for å hindre ATP / GTP degradering. - Pass på at det ikke er luftbobler i mikropipette som de kan komme ut mens mikropipette er i vev og obskure skive.
- Plasser mikropipette i elektrodeholderen slik at oppløsningen kommer i kontakt med sølvklorid belagte trådelektroder.
- Stram pipette lokket slik at kjeglen vaskemaskinen vil danne en forsegling rundt mikropipette.
- Påfør positivt trykk før fordype mikropipette i ACSF å hindre rusk kommer inn i pipetten.
- Plasser heads i låst stilling (som vender mot kammeret), og ved hjelp av mikromanipulator, guide det ned mot kammeret slik at det er omtrent under midten av den nedsenket objektiv.
- Mens du flytter mikropipette med mikromanipluatoren (innstilt på middels til høy hastighet), bruker skjermen for å finne mikropipette og veilede det mot plasseringen av cellen på XY aksen.
- Mål mikropipette motstand ved å tilføre en spenningstrinn (f.eks, 4 mV etter 100 msek), som kan oppnås manuelt eller automatisk via spesifikk programvare, for eksempel "bad" modus hvis ved hjelp av "Membrane Test" i Clampex programvare (se også trinn 4) . For å sørge for at ingen luftbobler eller andre fremmedlegemer blokkerer mikropipette, gjelder positivt trykk ved hjelp av luftfylt sprøyte (for eksempel 30 cc sprøyte) koblet til mikropipette holder med polyetylen rør.
- Når du har tømt mikropipette, utføre en spenning offset å redusere pipette strøm til null, noe som kan gjøres manuelt eller via spesifikk programvare som & #39; pipette offset "på datastyrt forsterker sjef.
Merk: Denne funksjonen vil kompensere for eventuelle spennings forårsaket av konsentrasjonsforskjeller mellom badekaret og mikropipette løsninger (dvs. flytende krysset potensiell 20).
- Anvendelse av en 1 ml sprøyte, en metallisk mikrosprøyte nål, og et eget filter, fyller en mikropipette med den interne oppløsning fremstilt på forhånd i henhold til den planlagte forsøket (K + -basert eller Cs + -basert indre løsning, se trinn 1.1., 1.2 og materialer for komposisjon). Bruk nok oppløsning så det indreoppløsningen kommer i kontakt med den kloridet belagt sølv trådelektrode innenfor mikropipette holderen.
4. Membran Test
Merk: Dette trinnet gjelder for forsterkeren nevnt i materialer.
- Ved bruk av en datastyrt forsterker sjef, alltid sette den på spenning-klemme-modus for å utføre membranen test.
Merk: Når membranen test er angitt i "bad" modus, tillater membranen test måling av mikropipette motstand og tetningen motstand når forseglingen er dannet. - Når membranen brister (se trinn 5.8), bytte membranen test for å "Cell" -modus, slik at seriemotstanden (R s) (også kalt tilgangs motstand, R a), Ri og membranen kapasitans (C p) kanoppnås.
5. Final Approach, Seal-formasjonen, og Innhenting av Hel-celle konfigurasjon
- Bruke den fine fokushjulet, begynne å fokusere ned mens du senker mikropipette gradvis. Alltid fokus ned først, og deretter senke mikropipette ned til fokusplanet. Dette vil sikre at mikropipette spissen ikke vil brått trenge inn i stykket.
- Når mikropipette kommer i kontakt med overflaten av den skive, tregere mikromanipluatoren hastigheten til middels lav modus.
- Forsiktig bruke et lett positivt trykk med det luftfylte sprøyte koblet til pipetten holderen for å fjerne eventuelle rester fra innflyvningsbanen.
- Approach cellen enten ved alternerende med de XYZ bryterne, eller ved å nærme seg diagonalt (hvis mikromanipluatoren modellen tillater det) hvor begge XZ aksene er endret ved dreining av Z-aksen knott. Den sistnevnte metode vil hindre vertikal sammenpressing av vev.
Merk: Her er måletå nærme cellen ved å påføre minimal skade på skive. Når mikropipette er nær nok til cellen en fordypning åpnes (en rund misfarging av celleoverflaten som følge av det positive trykk som påføres gjennom spissen av mikropipette) (figur 2). - Når fordypningen åpnes (figur 2-1), gjelder en svak og kortvarig sug gjennom røret som er forbundet med pipetten holder sugerøret for å skape tetningen (figur 2-2). Hold overvåking membranen test.
Merk: Hvis en delvis forsegling dannes (<1 GΩ), injisere negative strømninger ved å senke holde potensial (på datastyrt forsterker kommandør) kan lette segl formasjon og nå gigaohms motstand ( "gigaohm segl" eller "gigaseal"> 1 - 5 GΩ). Den høye motstand av tetningen (> 1 GΩ) vil både begrense støy forurensning til det registrerte signal, og å bidra til den mekaniske stabiliteten avlapp. - Mens en gigaseal danner, bruker datastyrt forsterker sjef til å bringe cellens holdepotensial så nær som mulig til fysiologisk hvilepotensialet (V hvile) for å hindre plutselige forandringer når membranen brister. For eksempel MSN er vanligvis spennings klemmes ved -70 eller -80 mV (fysiologisk V hvile: -70 til -90 mV).
- Etter at gigaseal har dannet, kompensere for hurtig og langsom kapasitans manuelt eller automatisk. Hvis du bruker en datastyrt forsterker kommandant som Multiclamp kommandant, trykk 'Auto' for 'Cp Fast "og" Cp Slow ".
- Dersom tetningen forblir stabil og over en GΩ (eller injeksjon av mindre enn 10 - 20 pA for å holde cellen ved den ønskede membranpotensialet), gjelder en kort og kraftig sug gjennom det samme rør som i 5.5 til å briste plasmamembranen (Figur 2 -3).
Merk: Dette kan ta flere forsøk. En god membran brudd oppnås whøne suge utføres sterk nok til at knuste membranen ikke tetter mikropipette (som kan føre til en økning i R s under innspilling), men svakt nok for å ikke trekke i en stor del av membranen eller cellen. - Etter å ha oppnådd en vellykket hel-cellekonfigurasjon, regelmessig overvåke mikropipette stedet for å vurdere og korrigere for betydelig drift da det kan føre til tap av plasteret. Drift amplitude kan variere avhengig av flere faktorer, for eksempel kvaliteten av riggen installasjon og trekkrefter på heads. Ideelt drift bør være nesten ikke-eksisterende.
- Ved å bytte til "Cell" -modus i membranen testen, viser ulike parametere i cellen slik som Rj, R-s og Cp. Overvåke disse parametrene under opptak.
Merk: Alle disse parametrene kan bidra til å vurdere innledende helsetilstanden til celler og celletyper (se "Membrane test" -delen, trinn 4). - Når the ovenfor trinnene er fullført, forblir i spenning-klemme-modus for å måle strøm (f.eks EPSCs, iPSCs), eller bytte til strøm klemme modus hvis du planlegger å måle endringer i membranspenning (f.eks aksjonspotensial avfyring). For sistnevnte, injisere enten positiv eller negativ strøm til å holde cellen i den ønskede membranspenning (for å utføre dette trinnet, se forsterker anvisning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temperatur, en faktor som er lett kontrolleres ved experimenter, påvirker de biofysiske egenskapene til ionekanaler og reseptorer, og derved bølgeformen av post-synaptiske strømmer (pscs) (EPSC og iPSCs), og evnen av nerveceller for å fremkalle pigger. Figur 3 og Figur 4 viser effekten av temperatur på neuronal avfyring og hellingen av fremkalt EPSCs (eEPSCs) respektivt. Skytingen mønster (figur 3) (dvs. ventetid til 1. pigg, pigg antall, frekvens og handling potensial bølgeform) er formet av en tidsbestemt og koordinert åpning og lukking av spesifikke spenningsstyrte ionekanaler (Na +, Ca 2 +, og K +), et prosesstemperaturfølsomme. Figur 3 viser hvordan den midlere pigg nummer øker med temperaturen. Merk at i de eksperimentelle betingelsene beskrevet her (MSN innspillinger) selv om pigg frekvens CNCY synes ikke å bli forandret ved subphysiological temperatur (28 ° C), øker betraktelig når temperaturen når fysiologisk relevant nivå (32 ° C). Figur 4A viser et eksempel på hvordan hellingen av eEPSCs, en parameter som vanligvis brukes til å vurdere synaptisk styrke, øker med temperaturen.
Selv om R s kan være noe styres av eksperimentator, dvs. gjennom en effektiv membran åpning når overgangen fra sel stat til hel-celle konfigurasjon, s R vanligvis øker langsomt under opptak. Dette kan være et resultat av ulike ukontrollerbare hendelser, for eksempel membran re-lukking eller rusk tetter pipettespissen under innspillingen. Et forsøk på å gjenåpne membranen ved å påføre et svakt sug, selv om det kan kompromittere lappen, kan noen ganger hjelpe å opprettholde en stabil R s. I alle tilfeller, fordi R s endringer kan alter bølgeformen av det elektriske signal som studeres, må det nøye overvåkes, og spesielt ved fotografering av pscs (voltage-clamp-modus). Figur 4 viser at når R er økninger (figur 4b), amplitude av glutamat-reseptor-mediert strøm (eEPSCs ) reduseres (figur 4C, D). Vanligvis forskere forkaste data når endringer i R s overstige 15% (f.eks dette laboratoriet), men noen laboratorier gjøre det fra en endring 20%. Dette kriteriet må være angitt i artikkelen metode delen.
For en definert nevron, kan Ri være påvirket av flere faktorer, blant annet temperatur, celle helse, og kvaliteten på lapp. Spesielt når Ri minker, PSC amplituder eller funksjon av nerveceller for å generere pigger også reduseres. For eksempel viser figur 4E at når Ri varierer ikke signifikant, the antall pigger holder seg relativt stabil (Neuron 1); og når R i øker, øker antallet pigger øker også (Neuron 2). Derfor, og på samme måte som R s, R jeg må overvåkes nøye, da 10% endringene er tilstrekkelig til skjevhet data.
Som beskrevet ovenfor, er det avgjørende å kontrollere eller overvåke temperaturen, R-s, og Rj under opptak. For eksempel, observerte endringer i signalet som er under studie (PSC avtaler eller avfyring) kan skyldes endringer (eller mangel på kontroll) av disse faktorene snarere enn effekten av eksperimentelle manipulasjoner, f.eks pre- vs. ettervirkningene av narkotika bad søknad.
Figur 1. Skreddersydd Recovery Chamber (AD) og et bilde av en hjerne Slice på 400X Viser Sunn og Døde nevroner (E). AD)Fremgangsmåten for å lage en tilpasset gjenoppretting kammer er beskrevet i trinn 2.1. E) Bilde fra NAC medial skall MSN i en hjerne skive på 400X viser eksempler på sunne (røde piler) vs. døde nerveceller (blå piler). Merk at selv om noen celler er angitt som sunn, deres sfærisk aspektet tilsier at de ikke kan være så sunt som ønsket (røde piler med stjerne). Endelig helsetilstand er vurdert basert på V hvile og R jeg etter å oppnå hel-celle konfigurasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Diagram som viser grunnleggende prosedyre trinn for å få tak i en Gigaseal og Etablere Hel-celle-konfigurasjon. Når mikropipette er nær nok til the celle for å skape en fordypning i plasmamembranen (trinn 1, Approach), gjelder en kort og svak sug for å opprette en tett kontakt mellom mikropipette og plasmamembranen. Hvis det utføres riktig, vil kontakten styrke og motstanden vil øke og nå en GΩ (gigaseal) eller mer (trinn 2, Seal dannelse). Når forseglingen er stabil og over en GΩ, bruke en kort og kraftig sug å sprekke plasmamembranen (trinn 3, hel-celle konfigurasjon). Oppnå hele cellen konfigurasjonen vil tillate kontinuitet mellom cytoplasma og mikropipette interiør. For detaljer, se protokoll trinn 05.01 til 05.08. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. nevronal utløsning (Intrinsic Excitability) vurderes i Current-musling P-modus. Her en forhåndsdefinert og inkrementell rekke aktuelle trinnene er gitt for å lokke fram endringer i membranspenningen, og dermed utløse aksjonspotensialer. A) Mean spike antallet øker med temperaturen. B) Eksempel spor på 280 pA fra NAc mediale shell MSN på tre ulike temperaturinnstillinger (24 ° C, n = 9; 28 ° C, n = 5, og 32 ° C, n = 6). Temperaturen i opptakskammeret direkte påvirker pigg frekvens. Vær imidlertid oppmerksom på at selv om spike frekvens ikke synes å endres ved subphysiological temperatur, vesentlig øker når temperaturen når 32 ° C, en fysiologisk relevant temperatur. Nerveceller er holdt på -80 mV. Toveis ANOVA: samhandling, p <0,0001; temperatur virkning, p = 0,0041; post hoc tester: 24 ° C og 28 ° C er begge signifikant forskjellig fra 32 ° C, ** p <0,01. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM. Kalibrering: 200 msek, 50 mV.jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effekt av temperatur, R-s, og Rj på bølgeformen av det elektriske signal som studeres. A) Eksempel på eEPSC amplitude fra en enkelt NAc skall MSN. Økning av temperatur 24-28 ° C og til 32 ° C øker helningen av eEPSCs. Vær oppmerksom på at temperaturinduserte endringer i eEPSCs skråningen skje raskt. Her blir eEPSCs helling vurdert i spennings-klemme-modus. Kalibrering: 5 ms, 100 pA BD) Eksempel på eEPSCs skråningen fra en enkelt NAc skall MSN.. Når R er økninger (B), helningen av eEPSCs reduserer (C). D) Korrelasjons analyse av eEPSC skråning som en funksjon av R-s. Pearsons R = -0,5717, p <0,0001. Nerveceller er spennings klemmes på -80 mV. E) Eksempel på spor fra to nevroner som viser effekten av Ri på evnen til nervecellen til å generere pigger. Nerveceller er strøm klemt og holdt på -80 mV. Kalibrering. 200 msek, 50 mV Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver den vanlige fremgangsmåten for å utføre hel-celle patch-clamp eksperimenter på nevroner i hjernen skiver. Imidlertid kompleksitet, potensial og følsomheten av denne teknikken kan ikke beskrives fullstendig i denne artikkelen. Her har vi forsøkt å avgrense de mest grunnleggende trinn og understreker viktige parametere som må kontrolleres for å oppnå vellykkede og strenge hel-celle opptak. For ytterligere teoretisk læring, har mange bøker og artikler er publisert på både hel-celle patch-clamp opptak i hjernen skiver 3,21-24 og på metoder som kan avgrense de løsningene som brukes 25-27 for å forbedre celle levedyktighet. For å rutinemessig utføre riktige innspillinger, er forbedring av tekniske ferdigheter gjennom intensiv praksis nødvendig. Likevel, med riktig anvendelse av trinnene nevnt, celler kan lappet timer post mortem, og gir viktig informasjon om endringer i synaptiske funksjoner og iboende excitabiheten.
Generelt, i tillegg til viktigheten av nøye forberede både ACSF og intern Mikropipette løsninger, hvert trinn fra hjernen disseksjon, slicing, oppnå vellykket hel-celle konfigurasjon, og få grundig og upartisk data krever intensiv trening. Først og fremst er det viktig å generere friske hjerneskiver. I korthet ble hurtig disseksjon av hjernen (ideelt <45 sek), opprettholdelse av en lav temperatur (0 - 2 ° C), mens kutting, og hensiktsmessige skjære løsninger alt spille en viktig rolle i å sikre celle helse. Det er bemerkelsesverdig å nevne at kutting oppløsninger kan variere mellom laboratorier og i henhold til den celletype og / eller hjernen regionen som skal undersøkes. Når oppstykking av NAc eller dorsal striatum, vårt laboratorium og andre bruker kynurensyre for kutting løsning for å minimalisere eksitotoksiske prosesser 28-33, men andre metoder kan også anvendes, slik som sukrose-baserte løsninger for 34 høy Mg 2+ 2 + løsninger 35, osv. Disse er bare noen få eksempler, og kan justeres i henhold til følsomheten av hjernen eller hjerneregion for å eksitotoksiske prosesser (f.eks, på grunn av alder). For ytterligere informasjon om løsninger og celleviabilitet, se 25-27. Til syvende og sist, konsentrasjonen av anioner, kationer og andre stoffer (for eksempel, askorbat, glutamat-reseptor-antagonister) som utgjør kutting løsninger bestemmes slik at det etterligner spinalvæske og reduserer så mye som mulig eksitotoksiske prosesser som oppstår under kutting. Protokollen som presenteres i denne artikkelen beskriver standardløsninger som ble rutinemessig brukt i forfatternes tidligere studier 28-31 ved opptak fra MSN i NAC eller rygg striatum i hjernen skiver. Videre er riktig justering av osmolaritet for både ACSF og indre mikropipette løsninger er avgjørende for vellykket tetning dannelse og vedlikehold av hel-celle confutformning. For å opprette en konsentrasjonsgradient fra ekstracellulære løsning på intra-pipette løsning, bør ACSF osmolaritet være høyere enn for interne Mikropipette løsninger. Ideelt sett, kan forskjellen i området fra 10 til 30 mOsm.
Å oppnå en vellykket hel-celle konfigurasjon er et viktig skritt for å gjennomføre effektive opptak. For det første kan pipette kapasitans justeres når pipetten er plassert i badet. Selv om automatiske innstillingene er vanligvis riktig innstilt, er det tilrådelig å bruke raske og langsomme justeringer av celle kapasitans med forsiktighet, da disse kan skade cellen når den ikke er riktig utført. For det andre, korte membran sug som er nødvendig for å sprenge membranen vil føre til en betydelig åpning av membranen, og derved gi en god kommunikasjon mellom intracellulært og intra-mikropipette miljø. Dette vil sikre at R s vil være relativt stabile i løpet av innspillingen. Hvis du bruker Cs-baserte mikropipette løsning,membranhvilepotensialet bør undersøkes umiddelbart etter etableringen av hel-celle-konfigurasjon (se trinn 5.8). Faktisk diffusjon av Cs + inne i cellen fører til tap av membranhvilepotensialet. For å finne den riktige hvilepotensialet, må væske krysset potensialet vurderes 20. Imidlertid kan experimenter rapportere hvilepotensialet som er observert etter bryte membranen (etter trinn 5.8) og velger ikke å justere for den flytende krysset potensial. I alle tilfeller må det nevnes i artikkelen metode seksjon. Ved etablering av hel-celle-konfigurasjon, kan C p også bli oppnådd, og kan bli anvendt som en indirekte parameter for å vurdere celle helse og / eller celletype. Tredje, når opptakene begynte, andre parametere må være strengt overvåket. Kritiske faktorer som må kontrolleres ved vurdering nevronale eksitabilitet er temperatur, R s og R i.
Somnevnt ovenfor, kan Ri og C p være en indikasjon på celle helse og / eller celletype. For eksempel, plasmamembranen, som virker som en isolator, skiller ladning (som følge av annen sammensetning av den intracellulære og ekstracellulære løsninger), som til sammen utgjør membranen kapasitans. Jo større membranoverflate (neuronal-spesifikk), jo høyere er kapasitansen. Det er da ikke overraskende at spesifikke nevronale typer utstillings C p og R i (matematisk relatert til Cp) som er innenfor det samme området. R s er direkte relatert til størrelsen av pipettespissen, og derfor er vanligvis en indikasjon på kvaliteten eller størrelsen på membranen åpning. I korthet, ved etablering av hel-celle-konfigurasjon, blir cytoplasma elektrisk kontinuerlig med løsningen i mikropipette og helt isolert fra det eksterne medium. R s (eller R a) stammer fra motstanden for strøt å strømme fra pipetten til cytoplasma. For noen opptaksforhold (f.eks strøm-klemme modus eller spennings klemme opptak av spenningsstyrte ion strøm), må R s kompenseres skikkelig (se Ref. 3,21-24 eller forsterker anvisning for riktig R s kompensasjon) .
Som beskrevet i figur 4, R er s spesielt viktig ettersom det kan dramatisk påvirke det elektriske signal bølgeform, f.eks EPSC amplitude. Likevel, R s må overvåkes nøye for off-line tolkninger av eventuelle observerte effektene. I tilfelle at membranen ikke er sprukket på riktig måte, mikropipette spissen tilstopping eller gjenlukking av membranen kan forekomme, i hvilket tilfelle R er økninger og forspenne bølgeform av det elektriske signal under studie (figur 4B-D). Oppsummert kan en rekke problemer oppstå under opptak, og de som vanligvis faller inn under tre kategorier: i) vev relatert, For eksempel økt celle dødelighet på grunn av dårlig disseksjon, mistilpasning av ACSF osmolaritet, og hypoksi; ii) utstyr-relatert, for eksempel støy og jording problemer, temperaturkontroll, skive og mikropipette posisjonering, osv.; og iii) datafortolkningen, f.eks observerte endringer kan være et resultat av uønskede eksperimentelle gjenstander spenn dataene som endringene i elektriske bølgeform-endring av parametre (R i, R-s, temperatur, se figur 3 og 4) i stedet for produktet av eksperimentelle manipulasjoner.
Selv om hel-celle-opptak i hjerneskiver er en kraftfull teknikk for å vurdere erfaring avhengig plastisitet, denne tilnærmingen begrenser tolkningen av dataene. Spesielt tre viktige begrensninger i hel-celle opptaksteknikk er at: (i) endringer i funksjon og uttrykk nivåer av spesifikke proteiner (f.eks ionekanaler) kan ikke skilles; (Ii) fordi denneTeknikken vurderer strøm gjennom hele membranen (eller vesentlige deler), gir den ikke nøyaktig sub-cellulær lokalisering av de ioniske strøm eller forandringer som er observert; og (iii) invasivitet av hel-celle-konfigurasjon fører til dialyse av celleinnholdet, og dermed til avbrudd av intracellulært molekylære maskineri nødvendig for noen fenomener for å utvikle eller som skal uttrykkes. En måte å unngå dialyse er å bruke skarpe elektrode opptak eller perforert patch teknikk 3,21,23. Når det gjelder de sistnevnte, poredannende antibiotiske molekyler så som nystatin kan tilsettes til pipetten løsning. Dannelse av disse porene vil tillate opptak av strømmene uten å forstyrre de andre messenger-mekanismene i cellen. Likevel siste fremskritt innen nanoteknologi og utvikling av nanoelectrodes 36 gir kraftige verktøy for å forbedre nevrale innspillinger. Slike teknologiske fremskritt i nevrovitenskap er fortsatt under utvikling Totaltt og er nå å sette i vår rekkevidde muligheten til å utføre patch-clamp og intracellulære opptak med minimal invasivitet, dvs. å holde den intracellulære miljø intakt, og undersøker funksjonene ionekanaler innen sub-cellulære avdelinger som var så langt ikke tilgjengelig med klassisk patch-clamp elektroder 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har konkurrerende interesser eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av UT Southwestern oppstartsfond (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4•H2O, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H2O, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , Oxford University Press. (2013).
- Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
- Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
- Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
- Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
- McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
- Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
- Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
- Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
- Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E.
- Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
- Defelice, L. J. Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , Plenum Press. (1997).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
- Neher, E., Sakmann, B.
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
- Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
- Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
- Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
- Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
- Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).
