Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.
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Methodenartikel
Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine elektrophysiologische Verfahren, das die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften eines wesentlichen Teils des Neurons ermöglicht. In dieser Konfiguration ist der Mikropipette in engen Kontakt mit der Zellmembran, die Kriechströme verhindert und dadurch liefert genauere Ionenstrommessungen als die bisher verwendeten intrazellulärem scharfe Elektrodenaufzeichnungsverfahren. Classically können Ganzzellaufzeichnung auf Neuronen in verschiedenen Typen von Präparaten durchgeführt werden, einschließlich Zellkulturmodellen, dissoziierte Neuronen, Neuronen in Gehirnschnitten und in intakten narkotisierten oder wachen Tieren. Zusammenfassend hat diese Technik zum Verständnis der passiven und aktiven biophysikalischen Eigenschaften von erregbaren Zellen immens beigetragen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist , dass sie Informationen darüber , wie bestimmte Manipulationen (beispielsweise pharmakologischer, Experimentator-Induced Plasticity) stellt spezifische neuronale Funktionen verändern können oder canäle e xistieren in Echtzeit. Zusätzlich wesentliche Öffnung der Plasmamembran ermöglicht die interne Pipettenlösung frei in das Zytoplasma diffundieren, Mittel zum Einführen von Medikamenten, beispielsweise Agonisten oder Antagonisten spezifischer intrazellulärer Proteine Bereitstellung und diese Ziele zu manipulieren , ohne in benachbarten Zellen ihre Funktion zu verändern. Dieser Artikel wird auf Ganzzell Aufnahme konzentrieren ausgeführt auf Neuronen in Hirnschnitten, ein Präparat , das den Vorteil der Aufnahme Neuronen in relativ gut erhaltenen Schaltkreise im Gehirn, das heißt, in einem physiologisch relevanten Kontext hat. Insbesondere wenn sie mit geeigneten pharmakologischen kombiniert ist diese Technik ein leistungsfähiges Werkzeug Identifizierung spezifischer neuroadaptations ermöglicht, die folgenden jede Art von Erfahrungen, wie Lernen aufgetreten ist, Exposition gegenüber Drogen und Stress. Zusammengefasst bieten whole-cell Patch-Clamp - Aufzeichnungen in Hirnschnitten Mittel ex vivo Herstellung nachhaltige Veränderungen zu messenin neuronalen Funktionen, die bisher in intakten wach Tiere entwickelt.
Einleitung
Die Patch-Clamp - Technik, eine elektrophysiologische Technik , die in den späten 1970er Jahren 1,2 entwickelt wurde, ist ein wichtiges Werkzeug für einzelne oder mehrere Ionenkanalfunktionen in lebendem Gewebe zu studieren. Unter den verschiedenen Patch-Konfigurationen, die erreicht werden kann, lassen whole-cell patch-clamp-Aufnahmen die Untersuchung des elektrischen Verhaltens eines wesentlichen Teils des Neurons. Klassischerweise wird diese Technik in vitro entweder an Hirnschnitten durchgeführt, frisch Neuronen dissoziiert, oder Zellkulturmodellen 3. Wenn auf Neuronen in Hirnschnitten durchgeführt wird, stellt diese Technik mehrere....
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Protokoll
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen von der UT Southwestern Institutional Animal Care und Use Committee und wurden so gewählt, dass zu minimieren Stress, Beschwerden und Schmerzen erfahren von den Versuchstieren genehmigt durchgeführt.
1. Lösungen
Hinweis: Bereiten Mikro interne Lösungen im Voraus. Für die meisten grundlegenden experimentellen Zwecken sollten zwei Arten von Lösungen genügen: Cs + -basierte und K + basierten Lösungen.
- Verwenden Cs + -basierte Lösungen (zB Cs + Gluconatlösung, siehe Materialien) für Voltage-Clamp - Experimente. Be....
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Ergebnisse
Temperatur, ein Faktor, der leicht durch den Experimentator gesteuert wird, beeinflusst die biophysikalischen Eigenschaften von Ionenkanälen und Rezeptoren und dadurch die Wellenform des postsynaptischen Ströme (PSCs) (EPSC und IPSCs) und die Fähigkeit von Neuronen Spitzen hervorzurufen. Abbildung 3 und Figur 4 zeigen die Wirkung der Temperatur auf die neuronale Aktivität und die Steigung der evozierten EPSCs (eEPSCs) sind. Die Brennmuster (3)
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt das grundlegende Verfahren für whole-cell Patch-Clamp-Experimente an Neuronen in Hirnschnitten durchgeführt wird. Jedoch kann die Komplexität, Potential und Empfindlichkeit dieser Technik nicht vollständig in diesem Artikel beschrieben. Hier haben wir versucht, die grundlegenden Schritte zur Abgrenzung und wichtige Parameter unterstreichen, die für das Erreichen erfolgreiche und rigorosen Ganzzellaufnahmen kontrolliert werden muss. Für weitere theoretische Lernen haben viele Bücher und Artike.......
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Offenlegungen
Keiner der Autoren haben konkurrierenden Interessen oder widerstreitenden Interessen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von UT Southwestern-Startfonds (SK) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
SolutionsCs-Gluconat interne Lösung (pH 7,2– 7.3, 280– 290 mOsm)td colspan="4">K-Gluconat interne Lösung (pH 7,2– 7.3, 280– 290 mOsm)td colspan="4">Standard künstliches Liquor cerebrospinalis (ACSF, Osmolarität ≈ 300-310 mOsm)td colspan="4">Zusätzliche Verbindungen zur Lösungsvorbereitung
Spatel td colspan="4"><td colspan="4">
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Isolierter Impuls-Stimulus-Generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolationseinheit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computergesteuerter Verstärker | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digitales Erfassungssystem | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Mikroskop | Olympus | BX-51 | |
| Mikromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Kammer- und Inline-Heizung | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Mikropipettenabzieher | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Kamera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige Pipettenabzieher PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glaskapillaren | WPI | TW150F-3 | |
| Scheibenhalter (Harfe) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Scheibe Kammer | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nichtmetallische Spritzennadel | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Spritzenfilter | Nalgene | 176-0045 | |
| Klebepistole | Home Depot | verschiedene | |
| Gasdispersionsrohr | Ace Glass Inc. | diverse | |
| Enthauptungsscheren | Home Depot | 100649198 | |
| Skalpellgriff #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Kleine gerade scharfe Spitzenschere | World Precision Instruments | 14218 | |
| Gefäßkanulationszange | World Precision Instruments | 500453 | |
| Gebogene hämostatische Pinzette | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Pinzette #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatel | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Fisher | Scientific 14-357Q | ||
| Petrischale | Fisher | Scientific 08-747B | |
| Filterpapier | Lab Depot | CFP1-110< | |
| D-Gluconsäure 50% | Sigma Aldrich/diverse | G1951 | |
| Cäsium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/diverse | 232041 | |
| NaCl, 2,8 mM | Sigma Aldrich/diverse | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/diverse | H3375 | |
| EGTA, 0,4 mM | Sigma Aldrich/diverse | E4378 | |
| Tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/diverse | T2265 | |
| Na2GTP, 0,3 mM | Sigma Aldrich/diverse | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/diverse | A9187< | |
| K D-Gluconat, 120 mM | Sigma Aldrich/diverse | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/diverse | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/diverse | H3375 | |
| EGTA, 0,2 mM | Sigma Aldrich/diverse | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/diverse | M8266 | |
| Na2GTP, 0,3 mM | Sigma Aldrich/diverse | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/diverse | A9187< | |
| KCl, 2,5 mM | Sigma Aldrich/diverse | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/ diverse | S7653 | |
| NaH2PO4• H2O, 1 mM | Sigma Aldrich/diverse | S9638 | |
| NaHCO3, 26,2 mM | Sigma Aldrich/diverse | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/diverse | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1,3 mM | Sigma Aldrich/diverse | 230391 | |
| CaCl2- 2H2O, 2,5 mM | Sigma Aldrich/diverse | C3881< | |
| KOH | diverse | ||
| Kynurensäure | Sigma Aldrich/diverse | K3375 |
Referenzen
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol....
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Nachdrucke und Genehmigungen
