Summary
Denne protokol beskriver de grundlæggende proceduremæssige skridt til at udføre hel-celle patch-clamp optagelser. Denne teknik tillader studiet af den elektriske opførsel af neuroner, og når udført i hjernen skiver, tillader vurdering af forskellige neuronale funktioner fra neuroner, der stadig er integreret i relativt velbevarede hjernens kredsløb.
Abstract
Helcelle-patch-clamp optagelse er en elektrofysiologisk teknik, der tillader undersøgelse af de elektriske egenskaber af en væsentlig del af neuron. I denne konfiguration mikropipetten er i tæt kontakt med cellemembranen, hvilket forhindrer lækstrøm og derved giver mere nøjagtige ioniske strømmålinger end den tidligere anvendte intracellulære skarpe elektrode registreringsmetode. Klassisk, kan hel-celle-optagelse udføres på neuroner i forskellige typer af præparater, herunder cellekultur modeller, dissocierede neuroner, neuroner i hjernen skiver, og i intakte bedøvet eller vågne dyr. Sammenfattende har denne teknik uhyre bidraget til forståelsen af passive og aktive biofysiske egenskaber af exciterbare celler. En stor fordel ved denne teknik er, at den giver information om, hvordan specifikke manipulationer (f.eks farmakologisk, eksperimentator-induceret plasticitet) kan ændre specifikke neuronale funktioner eller channels i realtid. Derudover betydelig åbning af plasmamembranen tillader det indre pipette opløsningen til frit diffundere ind i cytoplasmaet, hvilket giver midler til at indføre lægemidler, fx agonister eller antagonister af specifikke intracellulære proteiner, og manipulere disse mål uden at ændre deres funktioner i naboceller. Denne artikel vil fokusere på helcelle-optagelse udført på neuroner i hjernen skiver, et præparat, der har den fordel, at optage neuroner i relativt velbevarede hjernens kredsløb, dvs., i en fysiologisk relevant kontekst. Især når det kombineres med passende farmakologi, denne teknik er et stærkt værktøj til identifikation af specifikke neuroadaptations, der fandt sted efter enhver form for erfaringer, som læring, eksponering for misbrugsstoffer, og stress. Sammenfattende hel-celle patch-clamp optagelser i hjernen skiver giver midler til at måle i ex vivo forberedelse varige ændringeri neuronale funktioner, der har udviklet sig i intakte vågne dyr.
Introduction
Plasteret-clamp teknik, en elektrofysiologisk teknik, der er udviklet i slutningen af 1970'erne 1,2, er det vigtigste redskab til at studere en enkelt eller flere ion-kanal funktioner i levende væv. Blandt de forskellige patch-konfigurationer, der kan opnås, helcelle-patch-clamp optagelser tillader studiet af den elektriske opførsel af en væsentlig del af neuron. Klassisk er denne teknik udføres in vitro enten på hjerneskiver, frisk dissocierede neuroner, eller på cellekulturmodeller 3. Når den udføres på neuroner i hjernen skiver, denne teknik giver adskillige fordele. Navnlig: (i) neuroner registreres i relativt konserverede hjernens kredsløb, der til en vis grad, og sammenlignet med cellekultur præparater, tilvejebringe et miljø, der er fysiologisk relevant 3. Dette gør det muligt at fange tidligt, eller endda overvågning i realtid, cellulære og molekylære begivenheder, der udløses af enhver form for akut pharmacologiCal manipulationer - en tidsmæssig opløsning, som ikke kan opnås ved hjælp af klassisk in vivo betingelser; (ii) evne til visuelt at identificere områder af hjernen i hjernen skiver tillader høj regional specificitet 3 både for hjernen regionen undersøgt og for specifikke neuroner, når de udtrykker fluorescerende markører; (iii) adgang til det intracellulære rum af cellen ved at åbne en betydelig del af plasmamembranen (i modsætning til at punktere membranen med en skarp mikropipette for intracellulære optagelser) 4. Til gengæld dette tillader indholdet eller koncentrationen af specifikke ioner der udgør indre opløsning, der skal modificeres, således molekylære mål eller cellulære mekanismer kan studeres under forskellige betingelser. For eksempel, når oprettelse hel-celle konfiguration, nogen specifik farmakologisk middel (f.eks antagonister), at man kan tilføje til optagelsen mikropipetten (patch pipette) løsning vil direkte diffundere ind i cytoplasmaet og handle på dens putative intracellulære mål uden at ændre målet funktion i naboceller. Derudover sammenlignet med skarpe mikropipette optagelse, den store åbning i spidsen af patch-clamp-elektrode giver lavere modstand, mindre konkurrerende støj, og således bedre elektrisk adgang til indersiden af cellen 4. Bemærk dog, at den store åbning i pipettespidsen kan føre til celle dialyse, og dermed tab af intracellulære molekylære maskiner, der kan være kritisk for ekspression af de biologiske fænomener, der er under undersøgelse 5,6. I dette tilfælde kan skarpe elektrodeelementer optagelser være mere passende. Denne type optagelser kræver mikropipetter med en pore, der er meget mindre end dem, der anvendes til hel-celle-optagelser og derved forhindre det meste af ionbytning mellem intracellulære rum og det indre pipette opløsningen.
Enhver form for erfaring (akut eller kronisk), herunder indlæring 7-10, eksponering for misbrugsstoffer 11,12, stress 13,14, etc., kan ændre forskellige aspekter af neuronal funktion i specifikke hjerneregioner. Fordi disse ændringer kræver ofte tid til at udvikle (timer til dage), hel-celle optagelser i hjernen skiver fra dyr, der har undergået en specifik erfaring tillader forskerne at identificere disse ændringer. Dybest set, mange (hvis ikke alle) komponenter, der deltager i neuronale funktioner (f.eks ligandaktiverede ionkanaler, spændingsstyrede ionkanaler, neurotransmittertransportere) og derved hjerne kredsløb Aktivitet og adfærd, kan ændres ved erfaring (erfaring-afhængige plasticitet) 10,15-17. På den neuronale niveau, hjerne kredsløb aktivitet fremgår konstante interaktioner mellem synaptisk (f.eks glutamat transmission) og iboende cellulære excitabilitet faktorer (f.eks axosomato-dendritiske ionkanaler: natrium, Na +, kalium, K +, og calcium, Ca 2+ ). Under særlige betingelser ved hjælp af engroe-celle patch-clamp elektrofysiologiske teknikker, kan signal ændringer oprindelse specifikt fra ændringer i synaptisk vs. iboende uro isoleres.
I de fleste tilfælde er synaptiske ophidselse vurderet ved hjælp af helcelle-spænding-clamp-teknikken. Denne registrering tilstanden tillader måling af ionstrømme [f.eks medieret af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre receptorer ( AMPA-receptorer) og N-methyl-D-asparaginsyre-receptorer (NMDA-receptorer)] gennem den neuronale plasmamembranen Hold membranpotentialet ved en indstillet spænding. Her eksperimentatorer anvende interne mikropipette opløsninger, der indeholder cæsium (Cs +), en bred blocker af K + kanaler (vigtige iboende excitabilitet faktorer). Ved etablering af helcelle-konfiguration, vil diffusionen af Cs + i intracellulære rum blokere K + -kanaler, og derved vil give både en relativt effektiv rum-klemme og prælufte indflydelse iboende excitabilitet faktorer på andre målinger. Space-clamp spørgsmål, dvs. vanskeligheden til spænding-clamp hele cellen, opstår ved optagelse uregelmæssig formede celler (f.eks neuroner) og især neuroner med et stort og komplekst dendritiske arbor 18,19. Fordi somatiske spænding clamp dårligt kontrol spænding i den dendritiske træ af neuroner, er forskellige aspekter af dendritiske elektriske signaler undersøgte forvrænget i en dendritiske distance-afhængig måde. Kombineret med farmakologiske værktøjer såsom picrotoxin (gamma-aminosmørsyre, GABAA-receptor antagonist) eller kynurensyre (bred blokker af glutamatreceptorer) opløst i den ekstracellulære opløsning (kunstig cerebrospinalvæske, ACSF), denne teknik tillader måling af glutamat receptor- og GABA A R-medierede strømme hhv.
I modsætning hertil er iboende ophidselse normalt vurderes løbende clamp optagelse.I modsætning til spænding-clamp optagelse, denne indspilning tilstanden tillader måling af variationer i membranpotentialer induceret af ion strømme, der løber gennem den neuronale plasmamembranen. Typisk ændring i indre ophidselse vurderes gennem ændringer i evnen til neuroner til at generere aktionspotentialer, som kræver både Na + og K + kanaler. Derfor ved udførelse strøm-clamp optagelser, er mikropipetter fyldt med en indre opløsning, der indeholder K + i stedet for Cs +. Kombineret med farmakologiske midler, der blokerer glutamat og GABA-receptor-medierede strømme opløst i ACSF, denne eksperimentelle design gør målingen af bidraget fra iboende faktorer (f.eks K + kanaler) til neuronal fyring uden at blive forurenet af mulige ændringer i synaptisk uro faktorer.
Denne artikel vil beskrive de grundlæggende nødvendige proceduremæssige skridt to (i) forberede sunde hjernen skiver; (Ii) opnå hel-celle-konfiguration, og (iii) at overvåge grundlæggende parametre til at vurdere synaptisk og iboende ophidselse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af UT Southwestern Institutional Animal Care og brug Udvalg, og blev valgt for at minimere stress, ubehag og smerte oplevet af forsøgsdyr.
1. Opløsninger
Bemærk: Forbered mikropipette interne løsninger på forhånd. Til de fleste basale eksperimentelle formål, bør to slags løsninger tilstrækkeligt: Cs + -baseret og K + -baserede løsninger.
- Brug Cs + -baserede løsninger (f.eks Cs + gluconatopløsning, se Materialer) for spænding-clamp-forsøg. Forbered ved stuetemperatur.
- Forbered 117 mM Cs-gluconatopløsning ved blanding 4,62 g D-gluconsyre (~ 3.696 ml) med 3,54 g CsOH (~ 2,01 ml).
- Tilføj Hedeselskabet 2 O til 90 ml, og lad det i ligevægt i 30 min.
- Tilsæt de faste bestanddele (20 mM HEPES = 0,476 g; 0,4 mM EGTA = 15,2 mg; 2,8 mM NaCl = 16,4 mg; 5 mM tetraethylammonium (TEA) Chlorid = 83 mg).
- Tilføj Hedeselskabet 2 O til ~ 97 ml.
- Indstil pH af opløsningen med 50% CsOH til 7,2 - 7.3.
- Kontroller osmolaritet og korrekt, hvis nødvendigt med Hedeselskabet 2 O.
Bemærk: Et godt udvalg er ~ 280-285 mOsm. Optimal osmolaritet bør være 15 - 20 mOsm under osmolariteten af standard ACSF (normalt 300 - 310 mOsm, 300 mOsm i vores laboratorium). Osmolaritet kan variere efter løsninger specifikke sammensætninger. - Portion til 1000 pi og opbevares ved -20 ° C eller derunder.
- Forbered, portion, fryse, og tilføje ATP / GTP til den interne løsning på dagen for optagelsen.
- Tilføj 64,63 mg ATP til 10 mg GTP og opløses i 637.11 pi Hedeselskabet 2 O.
- Forbered 10 pi prøver og opbevares ved -20 ° C eller derunder. Bland hver 100x alikvot med 1.000 pi intern opløsning på dagen for forsøget. Når ATP / GTP sættes til den indre opløsning, vedligeholde det på is for at forhindre ATP / GTP degradatipå.
- Brug K + -baserede løsninger (f.eks K-gluconatopløsning, se Materialer) til både strøm- og spændings-clamp-forsøg, hvor K + konduktanser forbliver funktionel, så neuronal fyring kan vurderes. Forbered ved stuetemperatur.
- Afvej alle materialer ifølge den ønskede slutvolumen. For at forberede 90 ml opløsning, 120 mM K-gluconat = 2,81 g; 20 mM KCI = 0,149 g; 10 mM HEPES = 0,238 g; 0,2 mM EGTA = 0,008 g; 2 mM MgCl2 = 0,021 g.
- Brug nok Hedeselskabet 2 O for at nå 90% af den endelige løsning volumen. Dette skulle sikre, at tilstrækkelig plads der er tilbage til pH og osmolaritet justering.
- Når du har tilføjet og at blande alle ingredienserne, sørg opløsningen er klar, før måling af pH.
- Mens konstant omrøring af opløsningen, justering af pH til 7,2 - 7.3 Brug K + hydroxid (KOH).
- Efter justering af pH, bruge Osmometret og adbare osmolaritet til 280-285 mOsm.
Bemærk: Optimal osmolaritet skal være 15-20 mOsm under osmolaritet standard ACSF (normalt 300-310 mOsm, 300 mOsm i vores laboratorium). Osmolaritet kan variere efter løsninger specifikke sammensætninger. - Portion til 1000 pi og opbevares ved -20 ° C eller derunder.
- Forbered, portion, fryse, og tilføje ATP / GTP til den interne løsning på dagen for optagelsen (se trin 1.1.8).
- Forbered 1 L standard ACSF (se Materialer).
Bemærk: Vi bruger denne opskrift i vores laboratorium, når du optager mellemstore spiny neuroner (MSN'er) i hjernen skiver kan dog opskrifter variere mellem laboratorier, og derfor anbefaler vi forsøgslederen bruge en opskrift, der anvendes rutinemæssigt ved optagelse hjernen region af interesse . - Forbered dissektion ACSF (udskæring løsning, ~ 125 ml Bemærk:. Præcis volumen vil afhænge af størrelsen af den udskæring kammer, som det fuldt ud bør oversvømme hjernen) til brug itrin 2.2 - 2.8.
- Forbered 5 mM kynurensyre (for at blokere glutamat receptor-induceret excitotoksiske processer) i standard ACSF i en tilstrækkelig mængde til at oversvømme hjernen under udskæring. Brug en sonikator for at hjælpe opløse kynurensyre.
Bemærk: Længden af lydbehandling kan variere efter volumen og mængden af faste stoffer i opløsningen. Opløsningerne skal være klar ved udgangen af processen (ca. 1 - 2 ud min i vores betingelser). - Køle ned, mens gennembobling med 95% O2, 5% CO2 gas i en spand is indtil temperaturen når 0 - 2 ° C.
- Forbered 5 mM kynurensyre (for at blokere glutamat receptor-induceret excitotoksiske processer) i standard ACSF i en tilstrækkelig mængde til at oversvømme hjernen under udskæring. Brug en sonikator for at hjælpe opløse kynurensyre.
- Forbered ACSF til optagelse.
- Tag 1 L standard ACSF (eller hvad venstre fra opløsningen fremstillet i trin 1.3), hvortil passende farmakologiske midler kan tilsættes afhængigt af de planlagte eksperimenter.
- For eksempel, tilsættes 100 uM picrotoxin ved optagelse excitatoriske postsynaptiske strømme eller potentialer (EPSCs eller EPSPS), glutamat-receptor-antagonister (kynurenic acid, 2 mM; eller en kombination af D-APV 50 uM med CNQX 10 uM), når du optager hæmmende postsynaptiske strømme eller potentialer (IPSCs eller IPSPs), og begge picrotoxin og glutamat-receptor-antagonister ved vurderingen neuronal fyring i mangel af påvirkning fra synaptiske begivenheder.
- Tag 1 L standard ACSF (eller hvad venstre fra opløsningen fremstillet i trin 1.3), hvortil passende farmakologiske midler kan tilsættes afhængigt af de planlagte eksperimenter.
2. Slice Forberedelse
- Konstruere eller få en skive opsving kammer.
Bemærk: Princippet for et opsving kammer er ligetil og kan foretages i laboratoriet (figur 1). Kort fortalt kammeret er en beholder, hvori en kurv er indsat for at holde hjernen skiver på et niveau, der er lavere end overfladen af ACSF. Forskellige videnskabelige selskaber sælger også skive inddrivelse kamre.- Som et eksempel, opnå fire ringe (4 - 6 mm høje) (figur 1A, set fra siden, b, top view) ved at skære en 30 ml sprøjte. Derefter lim strakte garn (f.eks skåret fra en nylon hose) til den ene side af ringene til at holde hjernen skiver (figur 1b) og lim ringene sammen.
Bemærk: En limpistol kan anvendes. - Når de fire ringe limes, lim en buet ligebenet trapezformet plast væg til to af ringene (figur 1A og B) at aflede oxygenboblerne fra inddrive hjernen skiver (figur 1C og D). Som vist i figur 1 D, indsætte en oxygen spredende systemet (her en gasdispergeringsrør) på samme side som plastvæggene.
- Som et eksempel, opnå fire ringe (4 - 6 mm høje) (figur 1A, set fra siden, b, top view) ved at skære en 30 ml sprøjte. Derefter lim strakte garn (f.eks skåret fra en nylon hose) til den ene side af ringene til at holde hjernen skiver (figur 1b) og lim ringene sammen.
- Før udskæring, oxygenat (95% O2 / 5% CO2) og køle ned udskæring opløsning (se trin 1.4) til 0 - 2 ° C.
- Fyld den brugerdefinerede opsving kammer med standard ACSF på RT. Sørg for, at ACSF er godt iltet (20 - 30 min, kan variere i henhold til kammeret volumen) før placere skiver i aflåst kammer. Sørg for, at gasbobler ikke kommer i direkte contact med skiverne eller afbryde dem.
- Line vibratome is bakke med is og fyld med koldt vand, så en tredjedel til halvdelen af den udskæring kammeret er neddykket. Placer forsigtigt et ilttilførsel (f.eks, gas diffunderer sten) og en temperaturføler i udskæring kammer, så hverken element forstyrrer kniven bevægelse eller skive manipulation.
- Forbered dissektion området og de nødvendige redskaber til ekstraktion af hjernen og dissekere den ønskede hjerne region.
Bemærk: Den nøjagtige dissektion udføres, vil afhænge af den specifikke område af hjernen undersøgt som forskellige hjerneområder strukturer kræver udskæring på forskellige planer (f.eks, koronale, sagittale eller horisontale skiver.).- Placer følgende værktøjer på en underlag: halshugning saks, skalpel, små lige skarpe spids saks, fartøj kanyle tang (eller en hvilken som helst kirurgisk værktøj med en bred spids, såsom Rongeurs, som er mere egnet til rotte kranier), buede hæmostatiske pincet, tweezers, spatel, øse spatel, filtrerpapir, petriskål, et barberblad, og cyanoacrylat lim.
- Når temperaturen når 0 - 2 ° C, overføre udskæring løsning på udskæring kammer (buffer bakke).
- Bedøver musen i en udtørring kammer hjælp isofluran. Nøjagtige mængde kan variere efter størrelsen af kammeret anvendes, men for en lille skotøjsæske bur bruge et par dråber (~ 3 - 4). Lad musen i buret, indtil gjort immobile (ikke reagerer på taktile stimuli, omkring 15 sek til de betingelser, der er beskrevet her). Udfør hale og fod knivspids test for at sikre at dyret er dybt bedøvet, så halshugge før hjertet holder op med at slå (øger cellernes levedygtighed).
Bemærk: Med passende begrundelse, nogle laboratorier få tilladelse til at udføre levende halshugning for at minimere så meget som muligt excitotoksiske processer og forbedre cellernes levedygtighed. - Udfør dissektion.
Bemærk: Hjernen skal væreekstraheret hurtigt (<45 sek).- Brug af skalpel skære overfladiske hud på toppen af kraniet fra rostral til caudale.
- Peel hovedbunden på hver side af hovedet.
- Brug små lige skarpe spids saks, klippe interparietal plade langs lambdoid sutur at fjerne lillehjernen. Fjern nakkebenet.
- Under anvendelse af samme saks, klippe det sagittale sutur.
- Skub fartøj kanylering pincet (eller Rongeurs hvis bryde en rotte kraniet) under hver parietale knogler og træk for at eksponere hjernen.
- Brug de buede hæmostatiske pincet, klemme frontal knogler til at bryde dem, så brug en pincet eller fartøj kanylering pincet til at fjerne de brækkede knogler. Skærer og fjerner dura mater så skånsomt som muligt, da det kan forstyrre dissektion.
- Skub spatel under hjernen og træk forsigtigt hjernen ud af kraniet for at placere det i udskæring kammer (buffer bakke) tidligere fyldt med iskoldt ACSF. Lad hjernenkøle ned til 1 - 2 min.
- Forbered dissektion platform ved at udfylde en petriskål med is og nogle isvand for at tillade større overfladekontakt, dække det med låget og anbring et filtrerpapir på toppen. Fugt filtrerpapiret med kold ACSF.
- Når hjernen afkøles, placere hjernen på isen fyldt petriskål, og hurtigt at udføre den relevante dissektion for at opnå den ønskede plan udskæring.
- For at opnå sagittale skiver indeholder nucleus accumbens (NAC), bruge en enkelt kant barberblad til at skære og fjerne olfaktoriske Tuberkler og lillehjernen, hvis de er stadig til stede. Udfør derefter et sagittalt snit på 2 - 3 mm fra den laterale kant af højre hemisfære at opnå det plan, som vil blive limet på prøven holdepladen (se trin 2.8.11).
Bemærk: Cutting kun 2 - 3 i mm fra den laterale grænse af halvkugle vil tillade indsamling af skiver indeholdende NAC fra begge halvkugler. Det passende dissektion vil afhængepå hjernen region, der undersøges. Her er dissektion udføres så NAC neuroner kan optages i sagittale hjernen skiver. - Hurtigt lim (ved hjælp cyanoacrylat lim påført til modellen holder pladen) den flade snit hjernens overflade på pladen ifølge den ønskede plan udskæring. For at opnå sagittal hjernen skiver se trin 2.8.10.
- Umiddelbart placere og fastgøre prøven holder plade i udskæring kammer, så hjernen er skåret Rostro-kaudalt (for sikkerhed, der er nedsat holder kniven, når prøven pladen er sikret).
- Indstil vibratome med passende udskæring parametre (parametre, der anvendes i laboratoriet for den i Materials vibratome: hastighed med 3 - 4 vibrationer 9-10, og skive tykkelse 250 um).
- Ved udskæring, bruge en plastic-trimmet overførsel pipette til at overføre hjernen skiver til inddrivelse kammer (ved RT) (se trin 2.3). Restitutionstid kan variere efter den neuronale type, der er under undersøgelse(Typisk 30 - 90 min).
3. Optagelse Mikropipetter og Rig Forberedelse
- Se de specifikke retningslinjer i aftrækker brugervejledningen at opnå de ønskede mikropipette egenskaber.
Bemærk: MSN'er, bruger vi en pipette modstand vifte af 3,2-4,0 MQ. - Ilte ACSF og justere flowet til 2 ml / min. Vakuum ACSF anvendelse af en peristaltisk pumpe eller vakuum installerede linjer i anlægget.
- Tænd perfusion varmelegeme controlleren og justere temperaturen for at opnå den ønskede temperatur (f.eks, 31,8 - 32.2 ° C).
Bemærk: Temperatur stabilitet afhænger af at have både en konstant ACSF niveau og konstant strømningshastighed i kammeret. Da flere biofysiske egenskaber af neuroner (fx input modstand, Ri, også kaldet membran modstand, R m) er temperaturfølsomme, at opretholde en stabil temperatur er vigtig. - Tænd computer-styrede forstærker, kamera, mikromanipulator, og mikroskop baggrundslys. Hvis der udføres et eksperiment, der kræver elektrisk stimulation af vævet, tænde stimulus controller og isolation enhed.
Bemærk: Nogle forstærkere fra andre producenter anbefale en "warm-up" før brug, så det anbefales at konsultere manualen for den nøjagtige operativsystem procedure. - Start kamera capture, signal erhvervelse og forstærker software.
- Slice Placering og Visualisering:
- Ved hjælp af en plastik trimmet-tip overførsel pipette forsigtigt trække i én hjerne skive fra tilbagebetaling kammer.
- Placer overførselspipetten i optagelsen kammer og blidt udsnittet ud af pipetten på dækglasset foring i bunden af kammeret.
Bemærk: Så længe der ikke overflow sker, er det harmløst at have nogle ACSF fra tilbagebetaling kammer breder ind i badet. - Brug pincet til at ændre placeringen af skive so det ønskede område bliver sat nøjagtigt i midten af optagelsen kammeret. Brug mikroskop lav effekt (4X) objektiv og okular om bistand i positionering.
- Efter at der er opnået den ønskede position, fastgøre hjernen skive position med en skive fastholdende (også kendt som en "harpe") i kammeret.
- Skift til høj effekt (40X) objektiv og sænk den forsigtigt indtil kontakt er dannet med ACSF i kammeret.
- Brug finjustering hjulet for at bringe vævet i fokus. Mens der i kontakt med ACSF, skal du ikke bruge den grove justering hjulet på mikroskopet at sænke objektivlinsen overdrevent kan knuse skive eller endda bryde dækglasset foring bunden af kammeret, som kan forårsage ACSF at spilde på kondensator og beskadige den.
- Når fokus er på vævsniveau, observere celler i målområdet for form. Døde celler er let identificerbare ved deres svulmede plasmamembranen og kernen (<strong> Figur 1E). Raske celler skal vises som runde, æggeformet eller elliptiske homogene strukturer (figur 1E).
- Kig efter en target celle. Marker det på computerskærmen for at hjælpe med at guide optagelsen mikropipette. Hvis du bruger software som QCapture, tegne en firkant rundt målcellen ved at holde venstre museklik.
- Hæv objektivlinsen så der vil være tilstrækkelig plads i kegle dannet af objektivlinsen er i kontakt med ACSF at placere og flytte optagelsen mikropipette.
- Mikropipette Placering og Positionering
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte, en ikke-metallisk mikrosprøjte nål, og en dedikeret filter, fylde en mikropipette med den interne løsning forberedt på forhånd i henhold til den planlagte eksperiment (K + -baseret eller Cs + -baseret intern løsning, se trin 1.1., 1.2 og materialer til sammensætning). Brug nok løsning, så den interneopløsning kommer i kontakt med chlorid-overtrukne sølvtråd elektrode inden holderen mikropipetten.
Bemærk: Den sølvtråd elektrode kan chlorerede ved opblødning det i husholdningernes blegemiddel. Nukleosidtriphosphater (ATP & GTP) kan tilsættes til før anvendelse af det indre opløsning. Hold sprøjten med opløsningen på is for at forhindre ATP / GTP-nedbrydning. - Sørg for, at der ikke er nogen luftbobler i mikropipette, som de kan komme ud, mens mikropipetten er i vævet og tilslører skive.
- Anbring mikropipette i elektrodeholderen så opløsningen kommer i kontakt med sølvchlorid belagt tråd-elektrode.
- Spænd pipette dækslet, så der keglen washer vil danne en tætning omkring mikropipette.
- Påfør positivt tryk inden de sænkes mikropipetten i ACSF at forhindre snavs i at komme ind i pipetten.
- Placer hovedtrin i den låste position (vender kammeret), og ved hjælp af mikromanipulator, gPROGRAMINDSTILLINGER den ned mod kammeret, så det er nogenlunde midt under den nedsænket mål.
- Mens du flytter mikropipetten med mikromanipulator (indstillet til medium til høj hastighed), bruge computerskærmen for at lokalisere mikropipetten og lede det mod placeringen af cellen på XY-aksen.
- Mål mikropipette modstand ved at påføre en spænding trin (fx 4 mV for 100 ms), der kan udføres manuelt eller automatisk via specifik software som tilstanden "bad", hvis hjælp "Membrane Test" i Clampex software (se også trin 4) . For at sikre ingen luftbobler eller andre fremmedlegemer blokerer mikropipetten, anvende positivt tryk under anvendelse af det luftfyldte injektionssprøjte (f.eks 30 ml sprøjte) forbundet til mikropipette indehaveren med polyethylenrør.
- Efter at rydde mikropipette, udføre en spænding offset at reducere pipette strøm til nul, hvilket kan udføres manuelt eller via specifik software såsom & #39; pipette offset 'på den computerstyrede commander forstærker.
Bemærk: Denne funktion vil kompensere for enhver spænding forårsaget af koncentration forskelle mellem bad og mikropipetten løsninger (dvs. flydende junction potentiale 20).
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte, en ikke-metallisk mikrosprøjte nål, og en dedikeret filter, fylde en mikropipette med den interne løsning forberedt på forhånd i henhold til den planlagte eksperiment (K + -baseret eller Cs + -baseret intern løsning, se trin 1.1., 1.2 og materialer til sammensætning). Brug nok løsning, så den interneopløsning kommer i kontakt med chlorid-overtrukne sølvtråd elektrode inden holderen mikropipetten.
4. Membrane Test
Bemærk: Dette trin gælder for den nævnte i Materialer forstærker.
- Når du bruger en computerstyret kommandør forstærker, altid sætte det på spænding-clamp-mode til at udføre membranen testen.
Bemærk: Når membran test er angivet i "Bad" mode, membranen testen tillader målingen af mikropipetten modstand og tætningen modstand, når forseglingen dannes. - Når membranen brydes (se trin 5.8), skifte membranen test til "Cell" tilstand, så seriemodstand (Rs) (også kaldet adgang modstand, Ra), Ri og membran kapacitans (Cp) kanopnås.
5. Endelig Approach, Seal Dannelse, og Modtagelse af den Whole-celle-konfiguration
- Brug den fine fokus hjul, begynde at fokusere ned samtidig sænke mikropipetten gradvist. fokus altid ned først og derefter sænke mikropipetten ned på planet i fokus. Dette vil sikre, mikropipettespidsen ikke pludseligt vil trænge ind i udsnit.
- Når mikropipetten kommer i kontakt med overfladen af den skive, bremse mikromanipulator hastighed til medium-lav tilstand.
- Forsigtigt let positivt tryk med luft fyldt injektionssprøjte forbundet til indehaveren af pipetten for at fjerne eventuelle rester fra tilgangen sti.
- Approach cellen enten ved skiftevis med XYZ drejeknapper, eller ved henvendelse diagonalt (hvis mikromanipulator model tillader det), hvor begge XZ akser ændres med rotationen af Z-aksen knop. Sidstnævnte metode vil forhindre vertikal kompression af vævet.
Bemærk: Her er måletat nærme cellen ved at påføre minimal skade på udsnittet. Når mikropipetten er tæt nok til cellen en forsænkning vises (en runde misfarvning af celleoverfladen forårsaget af det positive tryk påføres gennem spidsen af mikropipette) (figur 2). - Når fordybningen vises (Figur 2-1), anvende en svag og kortvarig sugning gennem røret, der er forbundet med pipetten indehaveren sugerøret for at skabe tætningen (Figur 2-2). Fortsat at overvåge membranen test.
Bemærk: Hvis der dannes en delvis forsegling (<1 GQ), indsprøjtning negative strømme ved at sænke holdepotentiale (på computerstyret commander forstærker) kan lette forseglingsdannelse og nå gigaohm resistens ( "gigaohm segl" eller "gigaseal"> 1 - 5 GQ). Den høje modstand af tætningen (> 1 GQ) vil både forurening grænse støj til det optagede signal og bidrage til den mekaniske stabilitet aflappe. - Mens en gigaseal danner, bruge den computerstyrede commander forstærker for at bringe cellens bedrift potentiale så tæt som muligt på fysiologiske hvilende potentiale (V hvile) for at hindre pludselige ændringer, når membranen brydes. For eksempel MSN'er er normalt spænding-fastspændt ved -70 eller -80 mV (fysiologisk V hvile: -70 til -90 mV).
- Efter gigaseal har dannet, kompensere for hurtig og langsom kapacitans manuelt eller automatisk. Hvis du bruger en computer-kontrollerede kommandør forstærker såsom Multiclamp kommandør, tryk på 'Auto' for 'Cp Fast "og" Cp Slow ".
- Hvis forseglingen forbliver stabil og over 1 GQ (eller injektion mindre end 10 - 20 pA at holde cellen ved den ønskede membranpotentialet) anvende en kort og stærk sugning gennem det samme rør som i 5,5 til sprænge plasmamembranen (fig 2 -3).
Bemærk: Dette kan tage flere forsøg. En god membran brud opnås whøne sugning udføres stærkt nok til, at bristede membran ikke tilstoppe mikropipetten (som kan føre til en stigning i R s under optagelse), men svagt nok til at ikke trække i en stor del af membranen eller cellen. - Efter at have opnået en vellykket hel-celle konfiguration, regelmæssigt overvåge mikropipetten placering til at vurdere og korrigere for væsentlig afdrift, da det kan føre til tab af plasteret. Drift amplitude kan variere afhængigt af flere faktorer, f.eks, kvaliteten af installationen riggen og trækkræfter på hovedtrin. Ideelt set bør afdrift være næsten ikke-eksisterende.
- Ved at skifte til "Cell" mode i membranen test, se forskellige parametre for cellen, såsom Ri, R s og Cp. Overvåg disse parametre under optagelse.
Bemærk: Alle disse parametre kan hjælpe med at vurdere indledende sundhedstilstand af cellerne og celletyper (se "Membrane test" sektionen, trin 4). - Når the over trin er afsluttet, forbliver i spænding-clamp-tilstand til at måle strømme (f.eks EPSCs, IPSCs), eller skifte til strøm-clamp tilstand, hvis planlægning at måle ændringer i membran spænding (f.eks aktionspotentialet fyring). For sidstnævnte, injicere enten positiv eller negativ strøm til at holde cellen på det ønskede membran spænding (for at udføre dette trin, henvises til forstærker manuel vejledning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temperatur, en faktor, der er let kontrolleres af forsøgslederen, påvirker de biofysiske egenskaber af ionkanaler og receptorer, og derved bølgeform af postsynaptiske strømme (PSC) (EPSC og IPSCs) og evnen af neuroner til at fremkalde pigge. Figur 3 og figur 4 viser effekten af temperatur på neuronal fyring og hældningen af fremkaldte EPSCs (eEPSCs) hhv. Brændingen mønster (figur 3) (dvs. latens til 1. spike, spike antal, hyppighed og aktionspotentialet bølgeform) er formet af en timet og koordineret åbning og lukning af specifikke spænding ionkanaler (Na +, Ca 2 + og K +), en proces følsomme over for temperatur. Figur 3 viser, hvordan det gennemsnitlige spike antal stiger med temperaturen. Bemærk, at i de eksperimentelle betingelser, der er beskrevet her (MSN'er optagelser) selvom spike frequeNCY synes ikke at ændres på subphysiological temperatur (28 ° C), det øger når temperaturen når fysiologisk relevant niveau (32 ° C). Figur 4A viser et eksempel på, hvordan hældningen af eEPSCs, en parameter, der er almindeligt anvendt til vurdere synaptisk styrke, stiger med temperaturen.
Selvom R s kan være noget styres af forsøgslederen, dvs. gennem en effektiv membran åbning, når der skiftes fra sæl tilstand til hel-celle-konfiguration, R s normalt langsomt stiger under optagelse. Dette kan være resultatet af forskellige ukontrollable begivenheder, f.eks membran re-lukning eller debris tilstopning pipettespidsen under optagelsen. Et forsøg på at genåbne membranen ved at anvende en let sugning, selv om det kan bringe lap, kan undertiden hjælpe med at opretholde en stabil Rs. I alle tilfælde, fordi R s ændringer kan alter bølgeformen af det elektriske signal, der undersøges, skal det omhyggeligt overvåges, og især ved optagelse PSC'er (spænding-clamp-mode). Figur 4 viser, at når R s stigninger (figur 4B), amplituden af glutamat receptor-medierede strømme (eEPSCs ) falder (figur 4C, D). Typisk eksperimentatorer kassere data, når ændringer i R s overstige 15% (fx dette laboratorium), men nogle laboratorier gøre det fra en ændring på 20%. Dette kriterium skal fremgå af artiklens metode afsnittet.
For en defineret neuron, kan R i blive påvirket af flere faktorer, herunder temperatur, celle sundhed, og kvaliteten af plaster. Specifikt når Ri aftager, PSC amplituder eller evne af neuroner til at generere spikes også falder. For eksempel figur 4E viser, at når Ri ikke varierer væsentligt, the antal pigge forblive relativt stabilt (Neuron 1); og når Ri stiger, antallet af pigge stiger samt (Neuron 2). Derfor og på samme måde som R s, R jeg skal overvåges nøje, da 10% ændringer er tilstrækkelige til at partiskhed data.
Som beskrevet ovenfor, er det vigtigt at kontrollere eller overvåge temperatur, R s, og Ri under optagelser. For eksempel, observerede ændringer i signalet, der er under undersøgelse (kvikskranker eller fyring) kan være som følge af ændringer (eller en manglende kontrol) af disse faktorer snarere end effekten af eksperimentelle manipulationer, fx præ- vs post-virkningerne af drug bad ansøgning.
Figur 1. Skræddersyede Recovery Afdeling (AD) og et billede af en hjerne Slice på 400X Viser Sund og Dead neuroner (E). AD)Den procedure, der gør en brugerdefineret opsving kammer er beskrevet i trin 2.1. E) Billede af NAC mediale shell MSN'er i en hjerne skive på 400X viser eksempler på sunde (røde pile) vs. døde neuroner (blå pile). Bemærk, at selv om nogle celler er angivet som sund, deres sfæriske aspekt angiver, at de ikke kan være så sundt som ønsket (røde pile med asterisk). Final sundhedstilstand vurderes baseret på V hvile og R i efter at opnå hel-celle-konfiguration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Diagram viser den grundlæggende proceduremæssige skridt for at opnå en Gigaseal og Etabler Whole-celle-konfiguration. Når mikropipetten er tæt nok til the celle for at skabe en forsænkning i plasmamembranen (trin 1, Approach), anvende en kort og mild sugning for at skabe en tæt kontakt mellem mikropipetten og plasmamembranen. Hvis udført korrekt, vil kontakten styrke og modstanden vil stige og nå en GQ (gigaseal) eller mere (trin 2, Seal dannelse). Når forseglingen er stabil og over 1 GQ, anvende en kort og stærk sugning at sprænge plasmamembranen (trin 3, helcelle konfiguration). Opfyldelse af helcelle konfiguration vil tillade kontinuitet mellem cytoplasmaet og mikropipetten indre. For detaljer, se protokol trin 5,1-5,8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. neuronfyring (Intrinsic ophidselse) vurderes i Current-musling p Mode. Her et foruddefineret og trinvis serie løbende skridt er givet for at fremkalde ændringer i membran spænding, og dermed udløse aktionspotentialer. A) Mean spike nummer stiger med temperaturen. B) Sample spor ved 280 pA fra NAc mediale shell MSN'er på tre indstillinger forskellige temperaturer (24 ° C, n = 9; 28 ° C, n = 5 og 32 ° C, n = 6). Temperaturen i optagelsen kammer direkte påvirker spike frekvens. Bemærk dog, at selv om spike frekvens ikke synes at blive ændret ved subphysiological temperatur, det øger når temperaturen når 32 ° C, en fysiologisk relevant temperatur. Neuroner er afholdt på -80 mV. To-vejs ANOVA: interaktion, p <0,0001; temperatur effekt, p = 0,0041; post hoc test: 24 ° C og 28 ° C er begge signifikant forskellig fra 32 ° C, ** p <0,01. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM. Kalibrering: 200 ms, 50 mV.jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Effekt af temperatur, R s og R i på bølgeform af det elektriske signal Under Study. A) Eksempel på eEPSC amplitude fra en enkelt NAc shell MSN. Forøgelse af temperaturen den 24.-28 ° C og til 32 ° C øger hældningen af eEPSCs. Bemærk, at temperatur-inducerede ændringer i eEPSCs hældning opstår hurtigt. Her eEPSCs hældning vurderet i spænding-clamp modus. Kalibrering: 5 msek, 100 pA BD) Eksempel på eEPSCs hældning fra en enkelt NAc shell MSN.. Når R s stigninger (B), hældningen på eEPSCs falder (C). D) Korrelation analyse af eEPSC hældning som funktion af Rs. Pearsons R = -0,5717, p <0,0001. Neuroner er spænding-fastspændt ved -80 mV. E) Eksempel på spor fra to neuroner viser virkningen af Ri på evne til neuron at generere pigge. Neuroner er aktuelle-fastspændte og holdt ved -80 mV. Kalibrering:. 200 ms, 50 mV Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver den grundlæggende fremgangsmåde for udførelse af hel-celle patch-clamp-forsøg på neuroner i hjernen skiver. Men kompleksiteten, potentiale og følsomhed denne teknik kan ikke fuldt ud beskrevet i denne artikel. Her har vi forsøgt at afgrænse de mest grundlæggende trin og understrege vigtige parametre, der skal kontrolleres for at opnå en vellykket og strenge hel-celle optagelser. For yderligere teoretisk læring, har mange bøger og artikler er udgivet på både hel-celle patch-clamp optagelse i hjernen skiver 3,21-24 og metoder, der kan præciserer de løsninger, der anvendes 25-27 for at øge cellernes levedygtighed. For rutinemæssigt udføre ordentlige optagelser, er forbedring af tekniske færdigheder gennem intensiv praksis kræves. Ikke desto mindre, med korrekt anvendelse af de trin nævnt, celler kan lappede timer post mortem, der giver vigtige oplysninger om ændringer i synaptiske funktioner og iboende excitabiheden.
Generelt foruden betydningen af omhyggeligt at forberede både aCSF og intern mikropipette løsninger, hver skridt fra hjernen dissektion, udskæring, opnå vellykket hel-celle konfiguration og opnå stringent og fordomsfri data kræver intensiv praksis. Primært er det kritisk at generere sund hjerne skiver. Kort fortalt hurtig dissektion af hjernen (ideelt <45 sek), opretholdelse af en lav temperatur (0 - 2 ° C), mens udskæring, og passende udskæring løsninger alle spiller en vigtig rolle i at sikre celle sundhed. Det er bemærkelsesværdigt at nævne, at udskæring løsninger kan variere mellem laboratorier og i henhold til den celletype og / eller hjerne region, der vil blive undersøgt. Når udskæring NAC eller dorsale striatum, vores laboratorium og andre bruger kynurensyre til udskæring løsning til at minimere excitotoksiske processer 28-33, men andre metoder kan også bruges, såsom saccharose-baserede løsninger 34, høj Mg 2+ 2 + løsninger 35, osv. Disse er kun få eksempler og kan justeres efter følsomheden af hjernen eller hjerne region til excitotoksiske processer (f.eks, på grund af alder). For yderligere information om løsninger og levedygtighed celle, se 25-27. I sidste ende er koncentrationen af anioner, kationer og andre lægemidler (f.eks, ascorbat, glutamat receptor antagonister), der udgør udskæring løsninger bestemmes således, at den efterligner cerebrospinalvæske og minimerer så meget som muligt excitotoksiske processer, der opstår under udskæring. Protokollen præsenteres i denne artikel beskriver standardløsninger, der blev rutinemæssigt anvendes i forfatteres tidligere undersøgelser 28-31 ved optagelse fra MSN'er i NAC eller dorsale striatum i hjernen skiver. Desuden er korrekt justering af osmolariteten for både aCSF og indre mikropipette løsninger er afgørende for vellykket tætning dannelse og vedligeholdelse af helcelle-configuration. For at oprette en koncentrationsgradient fra ekstracellulær løsning på intra-pipette løsning, bør ACSF osmolaritet være højere end for interne mikropipette løsninger. Ideelt set kan forskellen variere fra 10 til 30 mOsm.
Opnåelse en succesfuld hel-celle konfiguration er endnu et vigtigt skridt for at gennemføre effektive optagelser. Først kan pipette kapacitans justeres, når pipetten anbringes i badet. Selvom automatiske indstillinger som regel er i orden, er det tilrådeligt at bruge hurtige og langsomme justeringer af celle kapacitans med forsigtighed, da de kan beskadige cellen, når den ikke korrekt udført. For det andet, korte membran sugning, der er nødvendig til at bryde membranen vil føre til en betydelig åbning af membranen, og derved tillade en god kommunikation mellem intracellulære og intra-mikropipette miljø. Dette vil sikre, at R s vil forblive relativt stabilt i hele optagelsen. Hvis du bruger Cs-baserede mikropipette løsning,membranen hvilende potentiale bør vurderes umiddelbart efter etablering af helcelle-konfiguration (se trin 5.8). Faktisk diffusionen af Cs + inde i cellen forårsager tab af membranen hvilende potentiale. For at bestemme den korrekte hvilende potentiale, skal væskeovergangen potentiale vurderes 20. Imidlertid kan forsøgslederen rapportere den hvilende potentiale, som observeres efter bryde membranen (efter trin 5.8) og vælger ikke at justere for væskeovergangen potentiale. I alle tilfælde skal det nævnes i artiklens metode sektion. Ved etableringen af helcelle-konfiguration, kan Cp også opnås og kan anvendes som en indirekte parameter for at vurdere celle sundhed og / eller celletype. For det tredje, når optagelserne begyndte, andre parametre bør overvåges nøje. Kritiske faktorer, der skal kontrolleres ved vurdering neuronexcitabilitet er temperatur, R s, og Ri.
Somnævnt ovenfor kan Ri og Cp være tegn på celle sundhed og / eller celletype. For eksempel plasmamembranen, som en isolator, der adskiller ladning (som følge af den anden sammensætning af det intracellulære og ekstracellulære opløsninger), som tilsammen udgør membranen kapacitans. Jo større membranoverfladen (neuronal-specifik), jo højere kapacitans. Det er da ikke overraskende, at specifikke neuronale typer udviser Cp og Ri (matematisk relateret til Cp), der er inden for samme område. R s er direkte relateret til størrelsen af pipettespidsen, og derfor er sædvanligvis tegn på kvalitet eller størrelsen af membranen åbning. Kort fortalt, ved indførelse helcelle konfiguration cytoplasmaet bliver elektrisk kontinuerligt med opløsningen i mikropipetten og fuldstændigt isoleret fra det ydre medium. R s (eller R a) stammer fra modstanden for Current at strømme fra pipette til cytoplasmaet. For nogle optageforholdene (f.eks strøm-clamp tilstand eller spænding-clamp optagelse af spændingsafhængige ion strømme), skal R s kompenseres korrekt (se ref. 3,21-24 eller forstærker manuel guide for korrekt R s kompensation) .
Som beskrevet i figur 4, er R s særligt vigtigt, da det dramatisk kan påvirke det elektriske signal bølgeform, f.eks EPSC amplitude. Ikke desto mindre, R s skal nøje overvåges for off-line fortolkninger af eventuelle observerede virkninger. I tilfælde membranen ikke er bristet korrekt, mikropipettespidsen tilstopning eller genindkobling af membranen kan forekomme, i hvilket tilfælde R s stigninger og bias bølgeform af det elektriske signal, der undersøges (figur 4B-D). Sammenfattende kan mange problemer opstå under optagelse, og dem, der normalt falder ind under tre kategorier: i) væv-relateredeFx øget dødelighed celle grundet dårlig dissektion, fejljustering af ACSF osmolaritet, og hypoxi; ii) udstyr-relateret, f.eks støj og grundstødning problemer, temperaturkontrol, skive og mikropipette positionering, osv.; og iii) data fortolkning, f.eks observerede ændringer kan være resultatet af uønskede eksperimentelle artefakter påvirke data som ændringer i elektriske bølgeform-variationer i parametrene (Ri, R s, temperatur, se figur 3 & 4) snarere end resultatet af eksperimentel manipulationer.
Selvom helcelle-optagelse i hjernen skiver er en kraftfuld teknik til vurdering af erfaring-afhængig plasticitet, denne tilgang begrænser fortolkningen af data. Især tre vigtige begrænsninger ved helcelle-optagelse teknik er, at: (i) ændringer i funktion og ekspressionsniveauer af specifikke proteiner (fx ionkanaler) ikke kan skelnes; (Ii) fordi detteteknik vurderer strøm gennem hele membran (eller væsentlig del), betyder det ikke give præcis sub-cellulære lokalisering af ionstrømmenes eller ændringer, der observeres; og (iii) invasivitet af helcelle-konfiguration fører til dialyse af celleindholdet, og dermed af afbrydelse af intracellulær molekylære maskineri nødvendigt for nogle fænomener at udvikle eller der skal udtrykkes. En måde at undgå dialyse er at bruge skarpe elektrode optagelser eller den perforerede patch teknik 3,21,23. Med hensyn til sidstnævnte poredannende antibiotiske molekyler, såsom nystatin kan sættes til pipetten opløsning. Dannelse af disse porer vil tillade optagelse af strømme uden at forstyrre de andre messenger mekanismer i cellen. Ikke desto mindre, de seneste fremskridt inden for nanoteknologi og udvikling af nanoelectrodes 36 giver effektive værktøjer til forbedring af neuronale optagelser. Sådanne teknologiske fremskridt i neurovidenskab er stadig under UDVIKLINGSt og er nu i færd med vores rækkevidde mulighed for at udføre patch-clamp og intracellulære optagelser med minimal invasiv, dvs holde det intracellulære miljø intakt, og undersøge funktioner ionkanaler inden sub-cellulære rum, der var hidtil ikke tilgængelige med klassisk patch-clamp elektroder 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har konkurrerende interesser eller modstridende interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af UT sydvestlige startup midler (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4•H2O, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H2O, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , Oxford University Press. (2013).
- Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
- Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
- Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
- Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
- McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
- Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
- Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
- Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
- Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E.
- Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
- Defelice, L. J. Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , Plenum Press. (1997).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
- Neher, E., Sakmann, B.
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
- Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
- Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
- Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
- Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
- Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).
