<em> पूर्व विवो</em> संस्कृति और पैटर्न मान्यता रिसेप्टर माउस आंतों Organoids की उत्तेजना
Summary
इधर, फसल को बनाए रखने, और रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) और लिस्टेरिया monocytogenes के साथ माउस छोटी आंतों organoids के इलाज के लिए एक प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन के लिए उचित सामान्य बनाने की तकनीक पर जोर देने के रूप में वर्णित है।
Abstract
प्राथमिक आंतों organoids एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली संभावित काफी श्लैष्मिक इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र को प्रभावित करने के लिए हो गया है। हालांकि, organoid विकास विशेषताओं की जटिलताओं अन्वेषक के लिए महत्वपूर्ण निरंतर ले। विशेष रूप से, प्रत्येक व्यक्ति organoid के विकास पैटर्न अत्यधिक चर रहे हैं और संस्कृति में उपकला कोशिकाओं के एक विषम जनसंख्या पैदा करते हैं। इस तरह के निरंतर के साथ, आम टिशू कल्चर प्रथाओं बस सेलुलर संरचना की जटिलता के कारण organoid प्रणाली को लागू नहीं किया जा सकता है। गिनती और सेल नंबर है, जो इस तरह के सेल लाइनों के रूप में व्यक्तिगत रूप से अलग कोशिकाओं, के लिए आम बात है पर पूरी तरह आधारित चढ़ाना, organoids के लिए एक विश्वसनीय विधि जब तक कुछ सामान्य बनाने की तकनीक लागू किया जाता है नहीं है। कुल प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्य निवासी प्रोटीन मैट्रिक्स के कारण जटिल बना दिया है। जब secreted चुनाव के मूल्यांकन के सेल नंबर, आकार और प्रकार की कोशिका के संदर्भ में इन विशेषताओं को ध्यान में रखा जाना चाहिएorganoid जन से टेंट। इस प्रोटोकॉल संस्कृति के लिए एक सरल प्रक्रिया की रूपरेखा और माइक्रोबियल रोगज़नक़ों और रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) के साथ छोटे आंतों organoids के इलाज के लिए उत्पन्न किया गया है। यह भी सामान्य बनाने की तकनीक है कि जब प्रोटीन विश्लेषण एक ऐसी चुनौती के बाद आयोजित की जाती हैं लागू किया जाना चाहिए पर जोर दिया।
Introduction
क्षमता फसल के लिए और संस्कृति प्राथमिक organoids छोटी आंत, पेट, अग्न्याशय, जिगर और मस्तिष्क के लिए वर्णित किया गया है और कर रहे हैं रोमांचक अग्रिम ऊतक जीव विज्ञान 1-5 के लिए एक अधिक physiologically प्रतिनिधि घटना को समझने के लिए सार्थक। संस्कृति और छोटे आंत्र organoids के रखरखाव का वर्णन पहली तरीकों सातो एट अल द्वारा सूचना मिली थी। हंस Clevers 1 की प्रयोगशाला से बाहर। इस विधि, संचयन और प्राथमिक आंतों उपकला साबित हुई कोशिकाओं की संस्कृति से पहले सीमित और उपकला कोशिकाओं के विकास को बनाए रखने में अप्रभावी हो। इस तरह के तरीके कोलैजिनेज़ और Dispase के रूप में एंजाइमों, जो अंततः intermixed प्राथमिक fibroblast कोशिकाओं 6 के परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे के साथ ऊष्मायन के माध्यम से ऊतक की हदबंदी शामिल थे। इन वजहों से भी समय उपकला सेल संस्कृति को बनाए रखने में प्रतिबंधित किया जाएगा। कोई उपकला सेल आला करने के लिए कम से कम, फार्म के रूप में उपकला कोशिकाओं के कारण apoptosis दर्ज होगाउचित वृद्धि कारक या संपर्क अखंडता के नुकसान की कमी है, anokis 7 करार दिया। 3 डी-organoid संस्कृति प्रणाली के आगमन के संस्कृति प्राथमिक आंतों निरंतर संस्कृति 1 में आंतों सेल प्रकार की एक स्पेक्ट्रम युक्त कोशिकाओं के लिए एक विधि प्रदान की गई है। ये उपकला organoids सेल लाइनों की जा रही है कि वे कई विभेदित कोशिकाओं से बना रहे हैं से अधिक लाभ है, और बेहतर अंग वे विवो 8 में से निकाली गई है नकल। प्रक्रिया अंतत "बढ़ने एक थाली में एक मिनी पेट" के लिए विभिन्न उत्तेजनाओं के तहत आंतों उपकला की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है। माइक्रोबियल रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) के साथ प्राथमिक आंतों की कोशिकाओं की बातचीत की जांच इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र के लिए प्रासंगिक के रूप में इन आणविक पैटर्न दोनों मेजबान और सूक्ष्म जीव 9 से विविध प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित कर सकते है। इतना ही नहीं जांचकर्ताओं अब माउस organoids के साथ इन संबंधों का पता लगाने कर सकते हैं, लेकिन वेअच्छी तरह से 2 के रूप में मनुष्यों से संवर्धित किया जा सकता है। इस तकनीक के संभावित नाटकीय रूप से व्यक्तिगत दवा को बदलने के लिए है और यह प्रगति के बारे में अटकलें हैं कि इस तकनीक को निकट भविष्य में संभव कर देगा आकर्षक है।
इस विधि के समग्र लक्ष्य उत्तेजनाओं की एक किस्म के साथ संस्कृति, विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल, और आंतों organoids के उपचार प्रदान करना है। इस तरह की उत्तेजनाओं टीके, बैक्टीरियल PAMPs, जीना रोगजनकों, जठरांत्र (सैनिक) और कैंसर चिकित्सा विज्ञान से अंततः लेकर कर सकते हैं। अलगाव और माउस आंतों organoids की संस्कृति सातो एट अल से अनुकूलित किया गया है। हालांकि मूल विधि से मामूली विचलन, अंत उत्पाद संस्कृति organoid जा रहा है अभी भी हासिल की है जब इस प्रोटोकॉल के बाद कर रहे हैं। इस विधि को उचित सामान्य बनाने के लिए एक पर्याप्त तकनीक का वर्णन है जब गैर-समरूप सेल संरचनाओं, जो जब सेल n पर आधारित एक परख का आयोजन ध्यान में रखा जाना चाहिए के साथ काम करने पर ध्यान केंद्रित किया हैभूरा रंग।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति और आंतों organoids के रखरखाव के लिए एक प्रक्रिया है कि पर्याप्त मात्रा में टिशू कल्चर तकनीक के साथ किसी भी व्यक्ति द्वारा महारत हासिल किया जा सकता है। वहाँ बारीकियों passaging में जब एक और अधिक परंपरागत mon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. . Culture of epithelial cells. 2nd edn. , (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
