Summary

los<em> Ex Vivo</em> Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Published: May 18, 2016
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Summary

Aquí, se describe un protocolo para la cosecha, mantener y tratar de ratón pequeñas organoides intestinales con patrones patógenos asociados moleculares (PAMPs) y Listeria monocytogenes, así como énfasis en la expresión génica y las técnicas de normalización adecuados para las proteínas.

Abstract

organoides intestinales primarias son un sistema modelo valioso que tiene el potencial de impactar significativamente el campo de la inmunología de la mucosa. Sin embargo, la complejidad de las características de crecimiento de organoides llevan advertencias importantes para el investigador. En concreto, los patrones de crecimiento de cada individuo organoide son muy variables y crear una población heterogénea de células epiteliales en cultivo. Con tales advertencias, las prácticas de cultivo de tejidos comunes no pueden ser simplemente aplican al sistema organoide debido a la complejidad de la estructura celular. Contando y enchapado basándose únicamente en el número de células, que es común para las células separadas individualmente, tales como líneas celulares, no es un método fiable para organoides menos que se aplique alguna técnica de normalización. La normalización de contenido total de proteínas se hace compleja debido a la proteína de la matriz residente. Estas características en términos de número de células, forma y tipo de célula deben tenerse en cuenta al evaluar con secretadatiendas de campaña de los medios de organoid. Este protocolo se ha generado para establecer un procedimiento sencillo para la cultura y tratar pequeños organoides intestinales con patógenos microbianos y patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs). También hace hincapié en las técnicas de normalización que se deben aplicar al análisis de proteínas se llevan a cabo después de un desafío.

Introduction

La capacidad de la cosecha y organoides cultivo primario se han descrito para el intestino delgado, colon, páncreas, el hígado y el cerebro y son emocionantes avances pertinentes a la comprensión de un fenómeno más fisiológicamente representante para la biología del tejido 1-5. Los primeros métodos que describen la cultura y el mantenimiento de pequeñas organoides intestinales se informó por Sato et al. Fuera del laboratorio de Hans Clevers 1. Con anterioridad a este método, la recolección y cultivo de células epiteliales intestinales primarias demostró ser limitado e ineficaz para sostener el crecimiento de las células epiteliales. Los métodos incluyen la disociación del tejido por medio de incubación con enzimas, como la colagenasa y dispasa, lo que en última instancia conducir a la derivación de células de fibroblastos primarios mezclados 6. Estas condiciones también podrían tener duración limitada en el mantenimiento del cultivo de células epiteliales. Un mínimo o ningún nicho de células epiteliales formarían, como las células epiteliales entrarían en la apoptosis debido a lala falta de factores de crecimiento apropiados o pérdida de la integridad de contacto, denominado anokis 7. El advenimiento del sistema de cultivo 3D-organoide ha proporcionado un método para las células intestinales primarias de cultivo que contenían un espectro de tipos de células intestinales en cultivo sostenido 1. Estos organoides epiteliales tienen ventajas sobre las líneas de células es que son compuestos de varias células diferenciadas, y imitan mejor el órgano que se derivan de 8 in vivo. El proceso para en última instancia "crecer un mini intestinal en un plato" ha demostrado ser una herramienta valiosa para la evaluación de la respuesta del epitelio intestinal bajo diferentes estímulos. La investigación de la interacción de las células intestinales primarias con patrones moleculares asociados a patógenos microbianos (PAMPs) es relevante para el campo de la inmunología como estos patrones moleculares pueden regular diversas respuestas de tanto el anfitrión como microbio 9. No sólo pueden ahora los investigadores explorar estas interacciones con los organoides ratón, peropuede cultivarse a partir de los seres humanos, así como 2. Esta tecnología tiene el potencial de alterar drásticamente la medicina personalizada y es tentador especular acerca de los avances que esta técnica hará posible en un futuro próximo.

El objetivo general de este método es el de proporcionar un protocolo para el cultivo, la expansión, y el tratamiento de organoides intestinales con una variedad de estímulos. Tales estímulos en última instancia, pueden variar de vacunas, PAMPs bacterianas, patógenos vivos, gastrointestinal (GI) y la terapéutica del cáncer. El aislamiento y la cultura de organoides intestinales de ratón ha sido adaptado de Sato et al. Aunque hay ligeras desviaciones del método original, el producto final es organoid cultura aún se logra cuando se sigue este protocolo. Este método se centra en la descripción de una técnica adecuada para la normalización adecuada cuando se trabaja con las estructuras celulares no homogéneos, que deben tenerse en cuenta cuando se realiza un ensayo basado en células nocre oscuro.

Protocol

Toda la investigación fue aprobado y lleva a cabo bajo las directrices de Virginia Tech IACUC 1. Prepare R-Spondin1 medios condicionados de la línea celular HEK293T-Rspo1 Generación de células HEK293T-Rspondin1 se ha descrito previamente 10. HEK293T-Rspondin1 Seed células secretoras en 5-10% de confluencia, aproximadamente 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 células, en un matraz T-175 con 40 ml de 1x de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de suero bovino fetal ( FBS) co…

Representative Results

Cuando se sigue este protocolo para cultivar organoides intestinales, característicos organoides en forma de esfera estarán presentes después de la cosecha. La adición de R-spondin1 medio condicionado diaria iniciará el crecimiento y el florecimiento de los organoides. El crecimiento de organoides se muestra en la Figura 1A – F, y es representativa de organoides intestinales en los días 1, 2, 4, 5, 6 y el día 14. Figura 1F…

Discussion

La cultura y el mantenimiento de organoides intestinal es un procedimiento que puede ser dominado por cualquier persona con la técnica de cultivo de tejidos adecuados. Hay sutilezas en pases en comparación con las células que crece en una monocapa más convencional, pero estas sutilezas no son difíciles de superar. Los pasos críticos de este método implican ser capaz de cultivar las organoides a una densidad suficientemente alta para la siembra óptima. Los experimentos deben ser escalados hacia abajo con organoid…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1,3,6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1,3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2,3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2,3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100mm x 15mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5,6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5,6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5,6)Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1,3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  3. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  4. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  5. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  6. Freshney, R. I., Freshney, M. G. . Culture of epithelial cells. 2nd edn. , (2002).
  7. Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
  8. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  9. Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
  10. Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
  11. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
  12. Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
  13. Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
  14. Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
  15. Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
  16. Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).

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Cite This Article
Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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