从人胆汁中分离和分析含微小RNA的外泌体

摘要

胆汁是细胞外囊泡/外泌体的宝贵来源，其中可能含有重要的生物标志物。本方案提供了一种可靠的方法，用于从人胆汁中分离外泌体，以便进行后续分析，包括miRNA谱型分析。

摘要

过去三年中，外泌体研究极大地拓展了生物标志物的鉴定与表征及其治疗应用的范围。

外泌体最近被发现含有微小RNA（miRs）。miRs本身已成为有价值的诊断生物标志物。由于临床和医院的样本采集方式差异较大，从全胆汁中分离miRNA的结果也存在显著差异。为了以简单的方式从收集的胆汁样本中获得稳定、准确且可重复的miRNA谱，亟需建立一种高质量的外泌体分离与表征方案。该方法包括多次离心、过滤步骤，以及最终通过超速离心沉淀分离得到的外泌体。透射电子显微镜、Western印迹、流式细胞术以及多参数纳米颗粒光学分析（如具备条件）是验证外泌体质量的关键表征步骤。从这些外泌体中提取miRNA时，需在裂解液中加入来自某一物种的非特异性合成miRNA作为内参 spike-in 秀丽隐杆线虫, 即，cel-miR-39，对于校正RNA提取效率具有重要意义。采用本方法从胆汁液体中分离外泌体，可实现对在-80 °C下保存数年的胆汁样本进行成功的miRNA表达谱分析。

引言

与其他生物流体类似，即 母乳、血浆或尿液、胆汁中含有富含脂质的囊泡——外泌体^1-4外泌体可诱导或改变受体细胞的生物学功能^{5, 6}一种细胞间通讯形式，可能是其正常功能的一部分^{4, 7-9}外泌体可包含微小RNA（miRNA）种类，这些miRNA可为疾病诊断提供有价值的生物标志物来源¹⁰近年来，miRNA谱作为多种疾病的诊断和预后标志物已受到广泛关注^11-14.

miRNA 本身可存在于生物体液中，可能由死亡细胞释放，而脱落细胞的数量会受到潜在疾病的重大影响。外泌体中的 miRNA 谱并不一定反映来源细胞的 miRNA 谱^{6, 10, 15-17}，但外泌体可能携带具有亲代细胞特征性的 miRNA 标志，例如肿瘤细胞。在肺腺癌、前列腺癌及其他肿瘤患者的血浆中已鉴定出肿瘤来源的外泌体^{8, 16, 18}。

本方法旨在从人胆汁样本中可靠且稳健地分离外泌体，且在很大程度上不受样本前期处理步骤的影响。该方法的开发目的是利用胆汁作为microRNA的可靠来源，用于胆管疾病（如胆管癌）的潜在诊断¹⁹。该方法包括多个逐步提高离心速度的离心步骤以分离外泌体，且可能适用于其他生物体液。

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方案

通过内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）从患者获取胆汁需要获得机构审查委员会批准的人类受试者研究方案。本文所述所有工作均经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会批准。

1. 从胆汁中分离外泌体

1. 行内镜逆行性胰胆管造影术（ERCP）。将患者置于仰卧位并进行插管。
   1. 经患者口腔插入十二指肠镜，进入十二指肠第二段，辨认主乳头。
   2. 通过插入一根预先装载了0.035英寸（0.9 mm）亲水性导丝的三腔乳头切开刀，选择性地插管胆总管。
   3. 在荧光透视引导下将导丝推进至左肝管，因为有时难以区分胆囊管与右肝管，随后将括约肌切开刀沿导丝推进至胆管内5 cm处，以获得稳定位置。
   4. 移除导丝，通过鲁尔锁将10 ml注射器连接至导丝端口，利用10 ml负压抽吸胆汁。
   5. 取出含有胆汁的注射器，重新插入导丝，并通过注射端口注入造影剂以显影胆管系统，继续进行内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）。
   6. 将收集的胆汁转移至预冷的15 ml离心管中，置于冰上保存，直至准备进行离心步骤。
      注意：佩戴手套以保护自身和样本！将胆汁视为潜在感染源，因其可能含有甲型肝炎病毒颗粒！
   7. 将样品置于冰上。可直接进行步骤1.2，或在4 °C下以500 × g离心10分钟，随后于-80 °C保存，待后续使用。
      注意：以这种方式储存数年的样本通常已被使用....

结果

由于外泌体体积过小，无法通过常规显微镜或流式细胞术检测，因此必须采用电子显微镜或纳米颗粒光学分析。与电子显微镜相比，纳米颗粒光学分析具有可定量的优点，并能提供粒径分布和浓度信息。该仪器通过玻璃棱镜将高度聚焦的激光束引入样品中，利用EMCCD高灵敏度相机捕获分离囊泡的布朗运动，并逐帧进行追踪。纳米颗粒追踪分析（NTA）软件通过逐帧测量这种布朗运动，计算胆汁外泌体样品的粒径、众数及分布情况。图1展示了从人胆汁样本中分离的外泌体进行典型NTA分析的结果。

或者，可采用透射电子显微镜来确认分离颗粒的大小，但无法进行定量分析。图2A展示了从人胆汁中分离的外泌体的典型透射电子显微镜结果。

为进一步验证所分离颗粒的外泌体特性，可通过 Western blot 检测 Tsg101 .......

讨论

为了可靠地利用从胆汁中分离的外泌体，必须采用一致的高质量分离方法，以获得高质量的样本。本文所定义的方法是一种成熟的技术，可用于从人胆汁中分离外泌体和miRNA。该方法强调了对外泌体进行表征时的若干关键步骤，至少应包括电子显微镜或纳米颗粒光学分析以及蛋白质印迹（Western blot）。

在分离外泌体的过程中，至少就miRNA稳定性而言，最关键的步骤是尽快处理新鲜胆汁。全胆汁在室温下长期储存，甚至经历一次冻融循环，都会显著降低miRNA含量；相比之下，分离后的外泌体即使在室温储存或经历多次冻融循环，仍具有很高的稳定性。只要待处理的样本一直保存在-80 °C条件下，即可高度可重复地从胆汁中成功分离外泌体和miRNA，从而鉴定样本中的miRNA特征。建议初始阶段使用新鲜胆汁，以确保miRNA的完整性。在需要长期积累胆汁样本（如患者样本）的情况下，这一点尤为重要。该方法使得在数月甚至数年内收集的样本能够集中于同一时间进行处理和分析。

这极大地提高了胆汁在诊断中的应用价值，可用于检测miRNA特征，以确认癌症等疾病状态的存在或疾病对治.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 聚醚砜（PES）膜过滤器	Corning	431229
薄壁聚烯烃超速离心管	Beckman Coulter	331374
SW40Ti 转子	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
纳米颗粒追踪分析（NTA）软件	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
完全蛋白酶抑制剂	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
抗 CD63 抗体	Abcam	ab59479
抗 Tsg101 抗体	Abcam	ab30871