Abstract
Exosome Forschung in den letzten drei Jahren hat sich stark den Umfang einen Beitrag zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomarkern und deren therapeutische Verwendungen ausgeweitet.
Exosomen sind microRNAs (miRs) gezeigt enthalten kürzlich. Mirs haben sich als wertvolle Biomarker für diagnostische Zwecke entstanden sind. Als Probenentnahme in Kliniken und Krankenhäusern sehr unterschiedlich ist, variiert miRNA-Isolierung aus Voll Galle erheblich. Um das zu erreichen robuste, genaue und reproduzierbare miRNA Profile gesammelt Gallenproben auf einfache Weise erforderte die Entwicklung eines qualitativ hochwertigen Protokoll zu isolieren und Exosomen von Galle zu charakterisieren. Das Verfahren erfordert mehrere Zentrifugationen und einen Filtrationsschritt mit einer abschließenden Ultrazentrifugationsschritt die isolierten Exosomen zu pelletieren. Elektronenmikroskopie, Western-Blots, Durchflusszytometrie und Multi-Parameter-Nanopartikel-optische Analyse, soweit verfügbar, sind von entscheidender Bedeutung Charakterisierung Schritte, um die Qualität der E zu validierenxosomes. Für die Isolierung von miRNA aus diesen Exosomen, das Lysat mit einem unspezifischen, synthetische miRNA aus einer Spezies , wie Caenorhabditis elegans Spiking, das heißt, Cel-miR-39 , ist wichtig für die Normierung der RNA - Extraktionseffizienz. Die Isolierung von Exosomen von Gallenflüssigkeit nach dieser Methode ermöglicht die erfolgreiche miRNA Profilierungs von Gallenproben für mehrere Jahre bei -80 ° C gelagert.
Introduction
Wie bei anderen biologischen Flüssigkeiten, also der Muttermilch, Plasma oder Urin, Galle enthält Exosomen, lipidreiche Vesikeln 1-4. Exosomen können biologische Funktionen in Empfängerzellen 5, 6, eine Form von Zell-Zell - Kommunikation induzieren oder zu verändern , die 4, Teil ihrer normalen Funktion 7-9 sein könnten. Exosomen können miRNA - Arten enthalten , die 10 eine wertvolle Quelle für Biomarker für die Diagnose zur Verfügung stellen kann. miRNAs Profile haben beträchtliche Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als diagnostisches und prognostischen Marker für eine Vielzahl von Krankheiten 11-14 gewonnen.
miRNA selbst kann in biologischen Flüssigkeiten, möglicherweise veröffentlicht von toten Zellen und die Menge der Schuppen Zellen gefunden werden kann, stark von einer zugrundeliegenden Krankheit beeinflusst werden. Die miRNA Profil von Exosomen geben nicht unbedingt die miRNA Profil der Ursprungszelle 6, 10, 15-17, noch Exosomen können miRNA Unterschriften tragen, die für die elterliche ce charakteristisch sein könntell eine Tumorzelle mögen. Tumor-abgeleitete Exosomen wurden im Plasma von Patienten mit Lungenadenokarzinom, Prostatakrebs und anderen Tumoren 8, 16, 18 identifiziert.
Das Ziel dieser Methode ist die zuverlässige und robuste Isolierung der Exosomen aus menschlichen Gallenproben, weitgehend unabhängig von ihrer vorherigen Handhabungsverfahren. Es wurde Galle als eine zuverlässige Quelle von miRNA für die mögliche Diagnose von Erkrankungen des Gallengangs wie Cholangiokarzinom 19 zu verwenden , entwickelt. Es besteht aus mehreren Schritten Zentrifugation mit zunehmender Geschwindigkeit Exosomen zu isolieren und möglicherweise zu anderen biologischen Flüssigkeiten anwendbar.
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Protocol
Erhalten der Galle von Patienten durch ERCP (ERCP) bedarf der Zustimmung eines menschlichen Probanden Studienprotokoll vom Institutional Review Board. Alle hier vorgestellten Arbeit wurde von der Johns Hopkins University Institutional Review Board genehmigt.
1. exosome Isolation von Bile
- Führen Sie ERCP (ERCP). Der Patient wird in Rückenlage und intubieren.
- Übergeben Sie einen Duodendoskop durch den Mund des Patienten und legen Sie sie in den zweiten Teil des Duodenum und die großen Papille identifizieren.
- kanülieren Selektiv Choledochus ein dreilumiger Papillotom vorbelastet mit einem 0,035 Zoll (0,9 mm) hydrophile Führungsdraht durch das Einfügen.
- Schieben Sie den Führungsdraht unter Durchleuchtungskontrolle nach links Hepatikus da gelegentlich kann es schwierig sein, den Cysticus vom rechten Hepatikus zu unterscheiden, dann voraus, um denSphinkterotom 5 cm in den Gallengang eine stabile Position zu erwerben.
- Entfernen Sie den Führungsdraht, fügen Sie eine 10 ml Spritze mit dem Führungsdrahtöffnung durch den Luer-Lock und aspirieren die Galle mit 10 ml Unterdruck.
- Entfernen Sie die Spritze die Galle enthält, mit der ERCP fortzufahren, indem der Führungsdraht wieder einsetzen und Kontrastmittel durch die Injektionsöffnung Injizieren des Gallenbaum zu trüben.
- Übertragen Sie die gesammelten Galle in einen 15-ml-Röhrchen auf Eis und auf Eis halten, bis sie bereit mit dem Zentrifugationsschritt, um fortzufahren.
Vorsicht: Handschuhe tragen sich selbst und die Proben zu schützen! Behandeln Sie die Galle als eine mögliche Quelle der Infektion, wie es Hepatitis-A-Virus-Partikel enthalten kann! - Halten Sie die Probe (n) auf Eis. Entweder fahren Sie mit Schritt 1.2 oder Zentrifuge bei 500 × g bei 4 ° C für 10 min und dann einfrieren bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
Hinweis: Um diese Art und Weise gespeichert Proben für mehrere Jahre routinemäßig verwendet wurden mit 19 guten Ergebnissen. - Transfer 400 ul Galle in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zu sammeln Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge die Probe (n) bei 16.500 × g für weitere 20 Minuten bei 4 ° C, um den Überstand von weiteren Trümmer zu löschen. Entsorgen Sie die Rohre in dem Biohazard Abfall. Alternativ drehen Sie die Proben in einer Ultrazentrifuge statt.
- Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie sie in einem Bio-Sicherheitsschrank mit einer Spritze durch einen 0,2 um Polyethersulfon (PES) Membranfilter, die eine gute Durchflussraten und niedrige Proteinbindung alle Partikel zu entfernen, die größer als 200 nm belassen.
- Pipettieren der filtrierte Überstand Röhrchen Ultracentrifuge und PBS hinzufügen, so dass die Rohre mehr als 2/3 voll sind. Wenn die Röhren weniger Flüssigkeit enthalten als das, werden die Rohre während der Zentrifugation kollabieren! Tubes kann mehrmals gewaschen, autoklaviert und wiederverwendet werden.
- Pellet Exosomen die durch Ultrazentrifugation bei 120.000 xg für 70 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation Blick auf die Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen manchmal kleine gelbe Pellets sehen; dies sind die Exosomen.
- Überstand verwerfen, indem sie vorsichtig dekantieren und den Abfall zu desinfizieren durch Bleichmittel auf eine Endkonzentration von 10% v / v Hinzufügen und lassen Sie es 20 Minuten lang stehen.
- Für nachgeschaltete Experimenten gepuffert entweder die Pellet (s) in einem kleinen Volumen der geeigneten Lösung (dh Radioimmunpräzipitation - Assay (RIPA) Puffer für die Proteinisolierung, RNA Lysepuffer für miR isolation) oder resuspendieren es in 50-150 ul Phosphat verarbeiten Salzlösung (PBS) , die bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung (quantitative Echtzeit - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Proteinextraktion etc.) oder verwendet zur Charakterisierung der exosome Herstellung durch TEM oder Nanopartikel optische Analyse gespeichert werden kann entweder .
2. exosome Identifikation durchTransmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder Kryo-EM
- Resuspendieren extrazellulären Vesikeln in 100 ul PBS pipettiert. Idealerweise verwenden Exosomen, die bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert wurden nicht, vor allem wenn die Isolation zum ersten Mal durchgeführt wird.
- Adsorbieren ein 20-ul-Aliquot (etwa 2 ug) bis 400 mesh Kohlenstoff beschichteten Parlodion Kupfergitter für 2 min und lassen bei RT trocknen.
- Befestigen Sie den Exosomen in 1% (v / v) Glutaraldehyd (EM-grade) für 5 min bei RT durch Tropfen vorsichtig auf die getrocknete Zubereitung platzieren.
- Waschen Sie die Gitter zweimal mit Wasser für 5 Minuten und dann Fleck EVs mit 1% Wolframatophosphorsäure (PTA) für 30 Sekunden gegenüber.
- Erwerben Bilder mit einem Elektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 80 kV bei einer Vergrößerung von 20.000-Ausgangs und 100.000 · zu erhöhen, wenn die Größe der Partikel bestimmt wird.
Hinweis: Andere preps wie Schichtung auf Formvar Kohlenstoff beschichteten 200 mesh Kupfer oder Nickel Gitter und Kontrastfärbung like 1% oder 2% Uranylacetat für 10-15 min sind möglich. - Für Kryo-EM, mischen, um ein 20-ul-Aliquot (etwa 2 ug) mit 60 & mgr; l Protein G Gold 10 nm (Verhältnis 1: 3). Dies wird dazu beitragen, die exosome Durchmesser zu bestimmen.
- Übertragen Sie die Proben auf glow-entladen C-Flach löchrigen Kohlenstoff Gitter und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen durch Abtupfen. Frieren Sie die Gitter von ihnen sofort in flüssigem Ethan getaucht wird.
- Montieren Sie die Gitter in einem cryoholder in flüssigem Stickstoff.
- Erwerben Sie die Bilder bei 200 kV mit einer Vergrößerung von 20.000-und 100.000 ·.
3. exosome Identifizierung von Multi-Parameter-Nanopartikel-Optische-Analyse
- Resuspendieren der isolierten Exosomen in 100 ul PBS pipettiert.
- Verdünnte Exosomen in 600 & mgr; l PBS bei mehreren verschiedenen Verhältnissen (wie 1:50 1: 100, 1: 300, 1: 600 und 1: 1.200).
- Visualisieren Sie die Exosomen durch Laserlichtstreuung mit dem entsprechenden Gerät und Software in Echtzeit nach manufacturer Protokoll 20.
- Erhöhen Sie den Pegel der Kamera im Aufnahmemodus, bis alle Partikel sichtbar werden, dann stellen Sie den Fokus auf die Partikel glatt aussehen.
- Während im Standard-Modus, um die Kamera auf das niedrigste Niveau zu verringern, dass die Partikel noch zu sehen ist, bei Bedarf Kamera-Auslöser und die Verstärkung einzustellen, dies zu erreichen.
- Eine Sichtprüfung 20-100 Partikel sind auf dem Bildschirm sichtbar zu gewährleisten, wenn das Gerät nicht spülen und die Verdünnung in PBS einzustellen.
- Dann stellen Sie die Aufnahmedauer auf einen Wert zwischen 30 bis 60 Sekunden. Nachdem das Video aufgenommen wird, stellen Sie die Verarbeitungsparameter, bis alle Partikel auf dem Bildschirm identifiziert werden und die Videodatei verarbeiten.
4. exosome Charakterisierung durch Western Blot
- Lyse exosome Pellets 2-5 ml Galle in 100 ul eiskaltem Radioimmunopräzipitation-Assay (RIPA) Puffer mit einem Proteaseinhibitor durch Auf- und Abpipettieren gründlich mischen Lysaten kräftig für 30 Sekundenauf einem Vortex die Proteine wirksam zu solubilisieren.
- Während die meiste Zeit nicht notwendig, puls Beschallung der Proben auf Eis mit 2 Impulsen für 10 sec jede volle Lyse sicherzustellen verwenden.
- Pellet unlösliches Material durch Zentrifugation bei 15.000 × g bei 4 ° C für 5 min und Überstand in ein sauberes Röhrchen.
- Bestimmung der Proteinkonzentration mit einem Verfahren der Wahl (dh Bicinchoninsäure (BCA), Coomassie modifizierte Lowry, 660 nm Protein Assay, etc.) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Das Verfahren ist nicht so wichtig, solange das gleiche Verfahren durchgängig verwendet wird, Ergebnisse zu erzielen, die über Experimente verglichen werden kann.
- Last 50 ug Protein pro Probe in Laemmli-Puffer nach dem Erhitzen der Probe bei 95 ° C für 5 min in ein Bohrloch eines Polyacrylamidgels für die Elektrophorese (PAGE).
- Elektrophorese der Proben auf den PAGE-Gele für 1,5 Stunden und übertragen Sie die getrennten Proteine auf eine Nylonmembran.
- BSperren der Membran (en) mit 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween 20 (TBS-T) 1 Stunde lang, dann inkubieren mit Exosom-spezifischen Antikörper wie Anti-CD63 und Anti-TSG-101 bei einer Verdünnung von 1: 500 bevorzugt O / N bei 4 ° C.
- Waschen der Membranen mit TBS-T 3 x 10 min inkubieren, dann mit einem geeigneten, passenden HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper in 5% Magermilch in TBS-T für 1-2 h bei RT.
- Waschen der Membran (en) 3 x 5 min mit TBS-T und detektieren die spezifischen Proteine mit Chemilumineszenz-Reagenzien nach dem Protokoll des Herstellers.
- Bild die Membranen mit Folie oder einem digitalen Bildgebungssystem gemäß dem Protokoll des Herstellers.
5. MicroRNA Isolation von den isolierten Exosomen
Hinweis: Isolierung von miRNA aus Gallen Exosomen ist eine modifizierte miRNA Isolation auf einem handelsüblichen Kit basierend durchgeführt, aber jede andere RNA Isolierungsverfahren können verwendet oder angepasst werden.
- In 300 &# 181; l Lyse / Gebäude Puffer zum exosome Pellet (isoliert von 400 ul Galle), Wirbel, Pipette oder gehen durch eine Nadel / Spritze vollständig lysieren die Exosomen ein homogenes Lysat zu erhalten.
- In 1/10 (30 & mgr; l) Volumen von miRNA Homogenat Additive und gut mischen durch Vortexen oder das Rohr mehrere Zeit invertieren.
- Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten auf Eis.
- Hinzufügen ein Volumen von Säure-Phenol: Chloroform gleich dem anfänglichen Homogenat (300 ul).
- In 5 ul 5 fmol / ul Cel-miR 39 und Wirbel für 30-60 Sekunden.
- Zentrifuge für 5 min bei 10.000 × g bei RT die wässrige zu trennen (oben) und organische (untere) Phasen.
- aspirieren Sie vorsichtig die obere Phase durch Pipettieren und in ein frisches Röhrchen, während das Volumen übertragen Feststellung. Entsorgen Sie die organische Phase in den entsprechenden organischen Abfallbehälter.
- Zur Bereicherung für kleine RNAs 1/3 Volumen von 100% Ethanol auf den wiederhergestellten wässrigen Phase hinzugeben und mischen durch gründliches Vortexen oder Umkehren des tumehrmals sein.
- Pipettieren das Lysat / Ethanol-Mischung auf der Filterpatrone, bis zu 700 & mgr; l zu einer Zeit.
- Zentrifugieren Sie die Patronen für 15 s bei maximal 10.000 xg oder gelten Vakuum der Mischung durch den Filter passieren.
- Das Filtrat und wenn das Lysat / Ethanol-Mischung 700 & mgr; l übersteigt, übertragen Sie den Durchfluss in ein frisches Röhrchen und wiederholen Sie den Vorgang zu sammeln alle Filtrate. Diese Filter enthält RNA Fraktionen frei von kleinen RNAs und kann verwendet werden, um diese größere RNAs zu erholen.
- In 2/3 Volumen von RT 100% Ethanol auf das Gesamt Filtrat und gründlich mischen durch Vortexen.
- Pipettieren das Filtrat / Ethanol-Gemisch auf eine zweite Filterpatrone. Nach wie vor das maximale Volumen, das auf einmal angewendet werden kann, beträgt 700 & mgr; l.
- Zentrifuge für 15 Sekunden bei 10.000 × g oder Vakuum wird in Schritt 5.10 beschrieben.
- Verwerfen Sie den Durchfluss durch, und wiederholen, bis das gesamte Filtrat / Ethanol-Mischung gefiltert wurde.
- bewerben 70081; l miRNA Waschlösung 1 auf die Filterpatrone, Zentrifuge für 5-10 sec oder Vakuum anzuwenden und den Durchlauf verwerfen.
- Waschen Sie den Filter mit 500 ul Waschlösung 2/3, wie in Schritt 5.16 getan.
- Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal mit 500 ul Waschlösung 2/3, wie in Schritt 5.16, entsorgen Sie die Durchfluss und legen Sie den Filter wieder in das Sammelrohr.
- Drehen die Filterpatrone für 1 min bei 10000 xg gesamte restliche Fluid aus dem Filter zu entfernen.
- Übertragen, um die Filterpatrone in eine frische Sammelröhrchen und anzuwenden 100 & mgr; l heißem (95 ° C) Nuklease-freies Wasser auf die Mitte des Filters.
- Drehen Sie die Baugruppen für 20-30 sec bei maximaler Geschwindigkeit um die RNA zu erholen.
- Sammeln des Eluats und sofort verwenden oder lagern bei -80 ° C.
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Representative Results
Da Exosomen zu klein sind, durch regelmäßige Mikroskopie nachgewiesen werden oder Durchflusszytometrie, Elektronenmikroskopie oder Nanopartikel optische Analyse durchgeführt werden. Die Nanopartikel optische Analyse hat den Vorteil gegenüber der Elektronenmikroskopie, dass es auch quantitative und bietet Größenverteilung und Konzentration. Das Gerät führt einen fein fokussierten Laserstrahl durch ein Glasprisma in die Probe. Die Brownsche Bewegung der isolierten Vesikeln wird über eine EMCCD hohe Empfindlichkeit der Kamera aufgenommenen und auf einer Rahmen-für-Rahmen-Basis verfolgt. Die Nanopartikel - Tracking - Analyse (NTA) Software misst diese Brownsche Bewegung Rahmen zu Rahmen um die Größe, die Art und Verteilung der Gallen exosome Präparationen zu berechnen. Figur 1 das Ergebnis einer typischen Analyse von NTA exosome aus einer humanen Probe isoliert Gallen zeigt.
Alternativ kann der Elektronenmikroskopie eingesetzt werdendie Größe der isolierten Teilchen zu bestätigen, wenn auch ohne Quantifizierung. 2A das typische Ergebnis der Transmissionselektronenmikroskopie für exosome von menschlichen Galle isoliert zeigt.
Zur weiteren Verifizierung der exosomalen Natur der isolierten Teilchen, Western - Blots für die Anwesenheit von Proteinen wie Tsg101 oder Tetraspanin CD63, gezeigt in 2B Sondieren, müssen verwendet werden. Exosom-spezifische Proteine existieren nicht per se, sondern Exosomen sind in Tetraspaninen angereichert, besonders CD9, CD63, CD81 und CD82 mit CD63 und CD81 bezeichnet als klassische exosome Marker und Proteine in exosome Bildung beteiligt wie TSG101 und Alix 21. Andere Proteine, wie Hitzeschockprotein verwandtes 70 (Hsc70) und 73 (Hsc73) sowie Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse-II-Moleküle können auch mit einigen wie Hsc73 und der peripheren membranassoziierten Prote in Exosomen angereichert gefunden werdenin Milchfettglobulin - epidermalen Wachstumsfaktor - Faktor 8 (Mfge8) ganz spezifisch für 21 von dendritischen Zellen sezerniert Exosomen sind.
Abbildung 3 zeigt die typischen Echtzeit - Verstärkungsstücke aus einer Vielzahl von miRNA Spezies aus Exosomen der menschlichen Galle extrahiert. Da Exosomen, im Gegensatz zu Zellen fehlt zuverlässige Standards wie 18S oder 28S-rRNA oder Housekeeping-Genen wie GAPDH oder β-Actin für die Normalisierung ist das Spiking mit einem synthetischen miRNA wichtig. Die synthetischen miRNA sollte von einer anderen Spezies wie cel-miR 39 von Caenorhabditis elegans abgeleitet werden , um einen zu ermöglichen , die Expressionsniveaus effektiv zu normieren.
Reproduzierbarkeit ist es entscheidend, dass die Galle so schnell wie möglich verarbeitet wird und nicht vor der Verarbeitung eingefroren, da diese Bedingungen zur Zersetzung von miRNAs in bile führen. Auf der anderen Seite, einmal isoliert, exoso mes sind sehr stabil und relativ widerstandsfähig wie Lagerung bei RT für 48 Stunden oder bis zu drei Gefrier-Auftau-Zyklen verursachen vernachlässigbare Auswirkungen auf den Ebenen der zumindest zwei Arten von miRNA, obwohl die Stabilität für die miRNA von Interesse empirisch bestimmt werden muss.
Abbildung 1 (Nanoparticle) NTA - Analyse zur Charakterisierung von humanen biliären Exosomen Bile Exosomen wurden im Verhältnis von 1 in PBS verdünnt. 600. (A) Größenverteilung und Konzentration von EVs von menschlichen Galle isoliert. Die Durchschnittsgröße betrug etwa 97 nm für diese Probe werden bestimmt (x-Achse: Exosomen Größe, y-Achse: Exosomen Konzentration für jede Größe). (B) Probenmomentaufnahme des gleichen in A. analysierten Probe Der Größenbereich zeigt Bläschen im Bereich von 30 bis 110 nm.= "_ Blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Überprüfung der exosomalen Art der Zubereitung durch Transmissionselektronenmikroskopie und Western - Blot. (A) Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von sphärischen Strukturen , die in der menschlichen Galle 70-110 nm in der Größe. Maßstabsbalken ist 100 nm. (B) Western - Blot - Analyse von Gallen Exosomen zeigt Präsenz der typischen exosome Markerproteine TSG101 und CD63. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Real-time PCR von miRNA - Arten isoliert von Galle Exosomen. Echt-Zeit PCR eines miR - Array zeigt , aus humanen biliären Exosomen (x-Achse, PCR - Zyklenzahl; y-Achse, relative Intensität) extrahiert , um die Amplifikation von mehreren miR - Arten. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Um zuverlässig Exosomen isoliert von Galle nutzen, ist es wichtig, eine gleichbleibend hohe Qualität Isolierungsverfahren zu verwenden, um qualitativ hochwertige Proben im Gegenzug erhalten. Die Methodik in diesem Dokument definiert ist, eine gut etablierte Weg Exosomen und miRNA aus menschlichen Galle zu isolieren. Sie weist auf mehrere entscheidende Schritte bei der Charakterisierung der isolierten Exosomen, die bei einem Minimum sollte Elektronenmikroskopie oder Nanopartikel optische Analyse und Western-Blots umfassen.
Der wichtigste Schritt bei der Isolierung von Exosomen, zumindest wenn es um die miRNA Stabilität kommt, ist frisch Galle so schnell wie möglich zu bearbeiten. Längerer Lagerung von ganzen Galle bei RT oder auch nur einen einzigen Gefrier-Auftau-Zyklus kann erheblich die miRNA-Gehalt zu reduzieren, während im Gegensatz die isolierten Exosomen auch sehr stabil sind, wenn bei RT gelagert oder mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Solange die Proben in Frage bei -80 ° C gelagert wurden, erfolgreiche Isolierung von Exosomen und miRNA von Galle kann mit großer Reproduzierbarkeit durchgeführt werden miRNA-Signaturen in den Proben zu identifizieren. Es wird empfohlen, zunächst mit frischer Galle beginnen richtige miRNA Integrität zu gewährleisten. Dies ist ein wichtiger Aspekt, wenn eine Sammlung von Gallenproben im Laufe der Zeit aufzubauen versuchen, wie es der Fall für die Patientenproben sein. Es ermöglicht eine Proben zu verarbeiten, die über Monate oder sogar Jahre gesammelt wurden zur selben Zeit verarbeitet und ausgewertet werden.
Dies verbessert die Verwendung von Gallen für diagnostische Zwecke, entweder für miRNA Signaturen zu suchen, die das Vorhandensein eines Krankheitszustandes wie Krebs oder die Reaktion einer Krankheit zu therapeutischen Interventionen bestätigen. In der Tat, die Ergebnisse aus klinischen Proben verwendet wurden miRNA Signaturen als Biomarker für cholangiocarcinoma 19 zu etablieren.
Der erste Zentrifugationsschritt entfernt intakte Zellen, die in der Galle vorhanden sind. In der zweiten, höheren Geschwindigkeit der Zentrifugation Zell debris, apoptotischen Körper und andere größere Organellen werden pelletiert. Um sicherzustellen, dass nur Partikel kleiner als 200 nm in der Ultrazentrifugation Schritt gesammelt werden, der Filtrationsschritt mit einem geringen Proteinbindungsfilter ist wichtig. Einige Protokolle lassen Sie diesen Schritt, aber wir denken, es ist notwendig. Nach der Ultrazentrifugation bei 120.000 · g erhaltene Pellet enthält ziemlich reines Exosomen, die sofort oder nach Resuspension in PBS aufbewahrt werden, bei -80 ° C werden kann entweder verarbeitet. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass das erhaltene Pellet wird nur hoch in Exosomen angereichert aber dies gilt für andere Anreicherungsverfahren wie Grßenausschluß und polymere Niederschlag. Die weitere Verarbeitung könnte einen weiteren Reinigungsschritt durch Saccharose-Gradienten mit sich bringen oder die Bindung an Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen. Wenn die Quelle der Exosomen (wie beispielsweise Plasma) Ausfällungen als Folge der Blutgerinnung enthält, könnte sein, diese zusätzliche Reinigung erforderlich, da diese Partikel oft die Größe der Exosomen haben kann.Insbesondere führt die Immuno-Reinigung zu einer exosome Marker angereicherte Zubereitung. Der Nachteil ist, dass dies verringert weiter die Menge an Exosomen und / oder miRNA vorhanden, und für die meisten Zwecke nicht die Zeit und die Ressourcen-verbrauchenden Verfahren rechtfertigt. Wenn jedoch, Western-Blot-Analyse die Anwesenheit von Mikrosomen-Kontamination durch eine endoplasmatische Retikulum Protein wie Calnexin erkennt, eine weitere Reinigung, insbesondere immunisoliere basiert, empfohlen. Nach unserer Erfahrung ist dies selten der Fall für Galle, wenn man andere Quellen von biologischen Flüssigkeiten verwendet eine Immunbasierte Reinigungsschritt zu empfehlen wäre.
Die Verwendung von Differential Ultrazentrifugation zu isolieren und eine relativ schnelle und kostengünstige Methode Exosomen von Gallenflüssigkeit ist bereichern. Während es die Verwendung einer Ultrazentrifuge erfordert, vorzugsweise mit einem Schwenkbecherrotor sind diese Vorrichtungen häufig in vielen Institutionen. Eine weitere Reinigung über Dichtezentrifugation sind possible mit der gleichen Ausrüstung und die Rohre sind wiederverwendbar mehrmals nach der Reinigung und Sterilisation. Während polymerbasierte Fällung nur die Verwendung von Mikrozentrifugen oder Standardzentrifugen erfordert die Niederschläge bei einer Geschwindigkeit von 10.000 xg pelletiert oder weniger, ist es im allgemeinen co-Isolate nicht-vesikulären Verunreinigungen einschließlich Lipoproteine. Während Lipoproteine in Galle im Allgemeinen nicht vorhanden sind, machen die Kosten für die oft proprietäre und patentierte Polymere die Isolierung im Vergleich teuer. Die Polymere sind auch manchmal inkompatibel mit nachgeschalteter Anwendungen wie Massenspektrometrie, aber als Downstream-Analyse mit dem Polymer (RNA oder Protein isolation) kompatibel ist, das Verfahren ist einfach, schnell und erfordert keine spezielle Ausrüstung.
Grßenausschlußchromatographie hat den Nachteil der langen Laufzeiten und das Erfordernis einer besonderen Ausrüstung, sondern ermöglicht die präzise Trennung von großen und kleinen Partikeln. Immunoaffinitätsreinigung ergibt die höchste purity von exosomalen Vesikel und ermöglicht auch die Isolierung von spezifischen exosomalen Fraktionen wie epitheliale abgeleitet, aber dies geht auf Kosten der Gesamtausbeute. Darüber hinaus ist es auf kleine Proben Volumina einen ersten Anreicherungsschritt erforderlich ist, wenn ein großes Volumen verarbeitet werden soll, und die isolierten Exosomen können funktionelle Aktivität verlieren oder veränderte biologische Funktion aufgrund der gebundenen Antikörper aufweisen.
Es ist wichtig, die Downstream-Anwendung (en) und die Verfügbarkeit von Spezialgeräten zu berücksichtigen, wenn es um die Isolierung von Exosomen kommt. Die Charakterisierung der isolierten / angereicherten Teilchen ist wichtig, unabhängig von der Isolierungsmethode verwendet. Ultrazentrifugation war bisher ein "Goldstandard" von vielen Labors verwendet aufgrund seiner robusten und schnellen (und kostengünstig, wenn eine Ultrazentrifuge verfügbar ist) die Anreicherung der exosomalen Partikel.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
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