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Medicine

अलगाव और की रूपरेखा MicroRNA युक्त मानव पित्त से Exosomes

Published: June 13, 2016 doi: 10.3791/54036
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Surgery, Tohoku University

Abstract

पिछले तीन वर्षों में Exosome अनुसंधान बहुत पहचान और बायोमार्कर और उनके चिकित्सीय उपयोगों के लक्षण वर्णन की ओर गुंजाइश बढ़ा दिया गया है।

Exosomes हाल ही में microRNAs (Mirs) को रोकने के लिए दिखाया गया है। Mirs खुद को नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए बहुमूल्य बायोमार्कर के रूप में पैदा हुई है। क्लीनिक और अस्पतालों में नमूना संग्रह काफी चर रहा है के रूप में, पूरे पित्त से miRNA अलगाव काफी भिन्न होता है। एक सरल तरीके से एकत्र नमूनों से पित्त, मजबूत सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य miRNA प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए अलग और पित्त से exosomes चिह्नित करने के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटोकॉल के विकास की आवश्यकता है। विधि कई centrifugations और पृथक exosomes गोली के लिए एक अंतिम ultracentrifugation कदम के साथ एक निस्पंदन कदम की आवश्यकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, पश्चिमी blots, प्रवाह cytometry और मल्टी पैरामीटर nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण, जहां पर उपलब्ध ई की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं लक्षण वर्णनxosomes। इन exosomes से miRNA के अलगाव, Caenorhabditis एलिगेंस, यानी की तरह एक प्रजाति से एक गैर विशिष्ट, सिंथेटिक miRNA साथ lysate spiking के लिए, Cel-मीर 39, शाही सेना निकासी दक्षता को सामान्य बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। पित्त द्रव इस विधि के बाद से exosome के अलगाव के सफल miRNA -80 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों के लिए संग्रहीत पित्त नमूनों से की रूपरेखा की अनुमति देता है।

Introduction

अन्य जैविक तरल पदार्थ, यानी, मां के दूध, चाय या मूत्र की तरह, पित्त exosomes, लिपिड अमीर पुटिकाओं 1-4 शामिल हैं। Exosomes प्रेरित या प्राप्तकर्ता कोशिकाओं 5, 6, कि अपने सामान्य कार्य 4, 7-9 का हिस्सा हो सकता सेल सेल संचार का एक रूप में जैविक कार्यों को बदल सकते हैं। Exosomes miRNA प्रजातियों जो निदान के लिए 10 बायोमार्कर का एक महत्वपूर्ण स्रोत प्रदान कर सकते हैं शामिल कर सकते हैं। miRNAs प्रोफाइल रोगों 11-14 की एक किस्म के लिए नैदानिक ​​और शकुन मार्कर के रूप में हाल के वर्षों में काफी ध्यान प्राप्त की है।

miRNA में ही जैविक तरल पदार्थ, संभवतः मृत कोशिकाओं द्वारा जारी की है और शेड कोशिकाओं की मात्रा बहुत एक अंतर्निहित रोग से प्रभावित किया जा सकता है में पाया जा सकता है। Exosomes की miRNA प्रोफ़ाइल जरूरी प्रारंभिक सेल 6, 10, 15-17 से miRNA प्रोफ़ाइल को प्रतिबिंबित नहीं करता है, फिर भी exosomes miRNA हस्ताक्षर है कि माता पिता का सीई के लिए विशेषता हो सकता है ले सकते हैंएक ट्यूमर सेल की तरह होगा। ट्यूमर व्युत्पन्न exosomes फेफड़ों adenocarcinoma, प्रोस्टेट कैंसर और अन्य ट्यूमर 8, 16, 18 के साथ रोगियों के प्लाज्मा में पहचान की गई है।

इस पद्धति का लक्ष्य मानव पित्त नमूनों, उनके पूर्व हैंडलिंग प्रक्रियाओं का काफी हद तक स्वतंत्र से exosomes के विश्वसनीय और मजबूत अलगाव है। यह इस तरह के cholangiocarcinoma 19 के रूप में पित्त नली के रोगों के निदान के लिए संभावित miRNA का एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में पित्त का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया था। यह बढ़ती गति exosomes को अलग करने के साथ centrifugation के कई कदम से मिलकर बनता है और अन्य जैविक तरल पदार्थ के लिए लागू हो सकता है।

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Protocol

इंडोस्कोपिक प्रतिगामी cholangiopancreatography द्वारा रोगियों से पित्त प्राप्त (ERCP) संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा एक मानव विषयों के अध्ययन प्रोटोकॉल के अनुमोदन की आवश्यकता है। यहाँ प्रस्तुत सभी काम जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पित्त से Exosome अलगाव

  1. इंडोस्कोपिक प्रतिगामी cholangiopancreatography (ERCP) का प्रदर्शन। लापरवाह स्थिति में मरीज की जगह और intubate।
    1. मरीज के मुंह के माध्यम से एक duodenoscope पास और ग्रहणी के दूसरे भाग में डालने और प्रमुख अंकुरक की पहचान।
    2. चुनिंदा डालने से आम पित्त नली cannulate एक ट्रिपल लुमेन sphincterotome एक 0.035 इंच (0.9 मिमी) हाइड्रोफिलिक guidewire के साथ पहले से भरा हुआ है।
    3. बाएं यकृत वाहिनी को fluoroscopic मार्गदर्शन में guidewire अग्रिम के बाद से इस अवसर पर यह सही यकृत वाहिनी से पित्ताशय वाहिनी अंतर करने के लिए मुश्किल हो सकता है, तो पहलेपित्त नली में 5 सेमी sphincterotome एक स्थिर स्थिति प्राप्त करने के लिए।
    4. guidewire निकालें, Luer ताला के माध्यम से guidewire बंदरगाह के लिए एक 10 मिलीलीटर सिरिंज देते हैं और पित्त नकारात्मक दबाव के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर aspirate।
    5. पित्त guidewire पुन: लगाने और इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से विपरीत एजेंट इंजेक्शन लगाने पित्त पेड़ ओपासिफाई करने से ERCP के साथ आगे बढ़ना युक्त सिरिंज निकालें।
    6. बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र पित्त स्थानांतरण और तैयार है जब तक बर्फ पर रख centrifugation कदम के साथ आगे बढ़ना।
      सावधानी: दस्ताने पहनें अपने आप को और नमूनों की रक्षा करने के लिए! संक्रमण का संभावित स्रोत के रूप में यह हेपेटाइटिस ए वायरल कणों के रूप में शामिल कर सकते हैं पित्त का इलाज!
    7. बर्फ पर नमूना (एस) रखें। या तो 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 XG पर कदम 1.2 या सेंट्रीफ्यूज के साथ आगे बढ़ना है और फिर -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर रोक।
      नोट: कई वर्षों के लिए इस तरह से संग्रहित नमूने नियमित रूप से अच्छे परिणाम 19 के साथ इस्तेमाल किया गया है।
    8. एक microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण पित्त के 400 μl और कोशिकाओं और सेल मलबे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा इकट्ठा।
    9. pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें, एक ताजा microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण और नमूना (एस) आगे मलबे की सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट करने के 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 20 मिनट के लिए 16,500 XG पर अपकेंद्रित्र। Biohazard बेकार में ट्यूबों त्यागें। वैकल्पिक रूप से, बजाय एक ultracentrifuge में नमूने स्पिन।
    10. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और जो अच्छा प्रवाह दर और कम प्रोटीन किसी भी कणों 200 एनएम छोड़ दिया की तुलना में बड़ा हटाने के लिए बाध्य है एक 0.2 माइक्रोन polyethersulfone (पी इ एस) झिल्ली फिल्टर के माध्यम से एक सिरिंज के साथ एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में यह फिल्टर।
    11. Pipet फ़िल्टर सतह पर तैरनेवाला नलियों ultracentrifuge और पीबीएस जोड़ने इतना है कि ट्यूबों के एक से अधिक 2/3 पूरा कर रहे हैं करने के लिए। अगर नलियों कि कम से कम तरल होते हैं, नलियों centrifugation के दौरान गिर जाएगा! ट्यूब, धोया जा सकता है autoclaved और कई बार पुन: उपयोग किया।
    12. तितरएट 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 120,000 XG पर ultracentrifugation के माध्यम से exosomes। ultracentrifuge ट्यूब कभी कभी छोटे पीले छर्रों देखने के लिए के तल पर centrifugation देखो के बाद; इन exosomes हैं।
    13. इसे ध्यान decanting से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10% वी / वी के अंतिम एकाग्रता के लिए ब्लीच जोड़कर बर्बादी शुद्ध करना और इसे 20 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
    14. बहाव के प्रयोगों के लिए, या तो उचित समाधान की एक छोटी मात्रा में गोली (ओं) प्रक्रिया (यानी, radioimmunoprecipitation परख (RIPA) प्रोटीन अलगाव, मीर अलगाव के लिए शाही सेना lysis बफर के लिए बफर) या फॉस्फेट की 50-150 μl में यह resuspend बफर खारा (पीबीएस) जो या तो मंदिर या nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण द्वारा भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस (मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर) या प्रोटीन निकासी आदि) पर संग्रहित किया जा सकता है या इस्तेमाल exosome तैयारी के लक्षण वर्णन के लिए ।

    2. Exosome पहचान के द्वारासंचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) या CryoEM

    1. pipetting द्वारा पीबीएस के 100 μl में बाह्य पुटिकाओं Resuspend। आदर्श रूप में, यह है कि -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नहीं किया गया है या -80 डिग्री सेल्सियस exosomes का उपयोग विशेष रूप से जब पहली बार अलगाव प्रदर्शन।
    2. 2 मिनट के लिए एक 20 μl विभाज्य (लगभग 2 ग्राम) 400 जाल कार्बन-लेपित Parlodion तांबे ग्रिड को सोखना और आरटी पर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. सूखे तैयारी पर ध्यान बूंदों रखकर आरटी पर 5 मिनट के लिए 1% (वी / वी) glutaraldehyde (ईएम-ग्रेड) में exosome को ठीक करें।
    4. 5 मिनट के लिए पानी के साथ दो बार ग्रिड को धो लें और फिर 30 सेकंड के लिए 1% phosphotungstic एसिड (पीटीए) के साथ दाग ईवीएस इसके विपरीत।
    5. छवियों 80 kilovolts की एक त्वरण वोल्टेज 20,000X की आवर्धन पर शुरू करने और 100,000X करने के लिए बढ़ रही है जब कणों के आकार निर्धारित करने के साथ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ मोल।
      नोट: अन्य preps formvar कार्बन-लेपित 200 जाल तांबे या निकल ग्रिड और इसके विपरीत धुंधला ली पर लेयरिंग की तरहKe 1% या 2% 10-15 मिनट के लिए uranyl एसीटेट भी संभव है।
    6. (: 3 अनुपात 1) CryoEM के लिए, के साथ 60 μl प्रोटीन जी सोना 10 एनएम एक 20 μl विभाज्य (लगभग 2 ग्राम) मिश्रण। इस exosome व्यास का निर्धारण करने में मदद मिलेगी।
    7. चमक-सी छुट्टी दे दी फ्लैट छेददार कार्बन ग्रिड पर नमूने स्थानांतरण और सोख्ता द्वारा अतिरिक्त तरल हटा दें। उन्हें तरल एटैन में तुरंत सूई से ग्रिड रुक।
    8. तरल नाइट्रोजन में एक cryoholder में ग्रिड माउंट।
    9. 200 केवी पर छवियों 20,000X और 100,000X के आवर्धन के साथ मोल।

    3. Exosome पहचान मल्टी पैरामीटर Nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण द्वारा

    1. pipetting द्वारा पीबीएस के 100 μl में पृथक exosomes Resuspend।
    2. कई अलग अलग अनुपात में 600 μl पीबीएस में exosomes पतला (जैसे 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 और 1: 1,200)।
    3. manufactu के अनुसार वास्तविक समय में उचित साधन और सॉफ्टवेयर के साथ लेजर प्रकाश बिखरने से exosomes कल्पनाRER प्रोटोकॉल 20।
    4. जब तक कणों दिखाई देने लगते हैं कब्जा मोड में कैमरे के स्तर को बढ़ाने, तो कणों चिकनी देखो बनाने के लिए ध्यान समायोजित।
    5. जबकि मानक मोड में, सबसे कम स्तर है कि कणों अभी भी देखा जा सकता है के लिए कैमरे में कमी, यदि आवश्यक हो तो कैमरा शटर और लाभ को समायोजित करने के लिए इस लक्ष्य को हासिल।
    6. दिखने में यह सुनिश्चित करने के लिए 20-100 कणों स्क्रीन पर दिखाई दे रहे हैं, अगर इकाई फ्लश और पीबीएस में कमजोर पड़ने से समायोजित नहीं की जाँच करें।
    7. फिर 30-60 के बीच सेकंड के लिए कब्जा अवधि को समायोजित। बाद वीडियो पर कब्जा कर लिया है, प्रसंस्करण मानकों समायोजित जब तक सभी कणों स्क्रीन पर पहचाने जाते हैं और वीडियो फ़ाइल की प्रक्रिया।

    4. Exosome विशेषता वेस्टर्न ब्लाट द्वारा

    1. ठंडा radioimmunoprecipitation परख के 100 μl में पित्त की 2-5 मिलीलीटर से Lyse exosome छर्रों (RIPA) एक protease अवरोध के साथ pipetting द्वारा अच्छी तरह से बफर और नीचे और 30 सेकंड के लिए सख्ती lysates मिश्रणएक भंवर प्रोटीन पर प्रभावी ढंग से solubilize के लिए।
    2. जबकि समय के सबसे आवश्यक नहीं, 10 सेकंड प्रत्येक के लिए 2 दालों के साथ बर्फ पर नमूनों की नाड़ी-sonication का उपयोग पूर्ण सेल सुनिश्चित करने के लिए।
    3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 XG पर centrifugation द्वारा अघुलनशील सामग्री गोली और एक स्वच्छ ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
    4. पसंद का एक विधि (यानी, bicinchoninic एसिड (बीसीए), Coomassie, संशोधित लौरी, 660 एनएम प्रोटीन परख, आदि) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार के साथ प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण। विधि लंबे समय के रूप के रूप में महत्वपूर्ण के रूप में एक ही विधि का लगातार प्रयोग किया जाता है परिणाम है कि प्रयोगों भर में तुलना की जा सकती प्राप्त करने के लिए नहीं है।
    5. लोड Laemmli बफर में नमूना प्रति प्रोटीन की 50 ग्राम नमूना वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) के लिए एक polyacrylamide जेल के एक कुएं में 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के बाद।
    6. 1.5 घंटे के लिए पृष्ठ जैल पर नमूने Electrophorese और एक नायलॉन झिल्ली करने पर अलग प्रोटीन हस्तांतरण।
    7. बी1 घंटे के लिए 0.1% के बीच 20 (टीबीएस-टी) के साथ Tris बफर खारा में 5% नोनफेट दूध के साथ झिल्ली (एस) लॉक है, तो एक कमजोर पड़ने पर विरोधी CD63 और विरोधी टीएसजी-101 की तरह exosome विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ सेते 1: 500 अधिमानतः हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    8. टीबीएस टी 3 एक्स 10 मिनट के साथ झिल्ली धो लें, तो एक उपयुक्त साथ सेते हैं, आरटी पर 1-2 घंटे के लिए टीबीएस-टी में 5% नोनफेट दूध में एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी मिलान।
    9. झिल्ली (s) टीबीएस-टी के साथ 3 एक्स 5 मिनट धो और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार chemiluminescence अभिकर्मकों के साथ विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने।
    10. छवि फिल्म निर्माता या प्रोटोकॉल के अनुसार एक डिजिटल इमेजिंग प्रणाली के साथ झिल्ली।

    5. पृथक Exosomes से MicroRNA अलगाव

    नोट: पित्त exosomes से miRNA के अलगाव एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के आधार पर एक संशोधित miRNA अलगाव का उपयोग किया जाता है, लेकिन किसी भी अन्य शाही सेना अलगाव विधि का इस्तेमाल किया या रूपांतरित किया जा सकता है।

    1. जोड़े 300 &# 181; एल सेल / exosome गोली (400 μl पित्त से अलग), भंवर, pipet या एक सुई / सिरिंज के माध्यम से पारित पूरी तरह से एक समरूप lysate प्राप्त करने के लिए exosomes lyse करने के लिए इमारत बफर।
    2. 1/10 (30 μl) miRNA Homogenate additive की मात्रा में जोड़ें, और vortexing या ट्यूब कई बार inverting द्वारा अच्छी तरह मिला लें।
    3. बर्फ पर 10 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
    4. एसिड फिनोल के एक मात्रा में जोड़ें: क्लोरोफॉर्म प्रारंभिक homogenate (300 μl) के बराबर है।
    5. 30-60 सेकंड के लिए भंवर 5 fmol / μl सेल-मीर 39 के 5 μl और जोड़ें।
    6. 10,000 XG आरटी जलीय (ऊपरी) को अलग करने में और कार्बनिक (कम) के चरण में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    7. ध्यान से, जबकि मात्रा का तबादला ध्यान देने योग्य बात एक ताजा ट्यूब pipetting और हस्तांतरण द्वारा ऊपरी चरण aspirate। उचित जैविक कचरे के कंटेनर में जैविक चरण त्यागें।
    8. के लिए छोटे RNAs बरामद जलीय चरण के लिए 1/3 100 की मात्रा% इथेनॉल जोड़ सकते हैं और अच्छी तरह से vortexing या inverting Tu से मिश्रण को समृद्ध करने के लिएकई बार हो सकता है।
    9. Pipet lysate / इथेनॉल मिश्रण फिल्टर कारतूस पर, ऊपर 700 μl करने के लिए एक समय में।
    10. 10,000 XG की एक अधिकतम पर 15 सेकंड के लिए कारतूस अपकेंद्रित्र या फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए मिश्रण वैक्यूम लागू होते हैं।
    11. छानना लीजिए और अगर lysate / इथेनॉल मिश्रण 700 μl से अधिक है, एक ताजा ट्यूब प्रवाह के माध्यम से हस्तांतरण और प्रक्रिया सभी filtrates इकट्ठा करने के लिए दोहराएँ। ये फिल्टर आरएनए अंशों छोटे RNAs से रहित होता है और इन बड़े RNAs ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    12. RT 100% इथेनॉल के 2/3 मात्रा कुल छानना में जोड़ें और vortexing द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से।
    13. Pipet छानना / इथेनॉल मिश्रण एक दूसरा फिल्टर कारतूस पर। पहले की तरह अधिक से अधिक मात्रा में है कि एक बार में लागू किया जा सकता 700 μl है।
    14. 10,000 XG पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र या कदम 5.10 में वर्णित के रूप में वैक्यूम लागू होते हैं।
    15. प्रवाह के माध्यम से त्यागें, और छानना / इथेनॉल मिश्रण के सभी फ़िल्टर किया गया है जब तक दोहराएँ।
    16. 700 लागू81, फिल्टर कारतूस के लिए एल miRNA धोने समाधान 1, 5-10 सेकंड या वैक्यूम लागू करते हैं और प्रवाह के माध्यम से त्यागें के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    17. के रूप में कदम 5.16 में किया 500 μl धोने समाधान 2/3 के साथ फिल्टर धो लें।
    18. कदम 5.16 के रूप में धो दोहराएँ धोने समाधान 2/3 के 500 μl के साथ एक दूसरी बार, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और फिल्टर संग्रह ट्यूब में वापस जगह है।
    19. 10,000 XG पर 1 मिनट के लिए फिल्टर कारतूस स्पिन फिल्टर से सभी अवशिष्ट तरल पदार्थ को हटाने के लिए।
    20. एक ताजा संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस स्थानांतरण और फिल्टर के केंद्र के लिए गर्म (95 डिग्री सेल्सियस) nuclease मुफ्त पानी के 100 μl लागू होते हैं।
    21. आरएनए ठीक करने के लिए अधिकतम गति से 20-30 सेकंड के लिए विधानसभाओं स्पिन।
    22. eluate लीजिए और तुरंत उपयोग करें या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

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Representative Results

चूंकि exosomes बहुत छोटा नियमित माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया या प्रवाह cytometry जा रहे हैं, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण किया जाना है। nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से अधिक लाभ यह है कि यह भी मात्रात्मक है और आकार के वितरण और एकाग्रता प्रदान करता है। साधन नमूना में एक गिलास चश्मे से एक पतले ध्यान केंद्रित लेजर बीम का परिचय। पृथक पुटिकाओं की ब्राउनियन गति एक EMCCD उच्च संवेदनशीलता कैमरा के माध्यम से कब्जा कर लिया है और एक फ्रेम-दर-फ्रेम आधार पर नज़र रखी है। Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) सॉफ्टवेयर उपायों इस ब्राउनियन आंदोलन फ्रेम आकार, मोड और पित्त exosome तैयारियों के वितरण की गणना करने के फ्रेम करने के लिए। चित्रा 1 exosome का एक विशिष्ट NTA विश्लेषण एक मानव पित्त नमूना से अलग के परिणाम से पता चलता।

वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता हैपृथक कणों का आकार, यद्यपि बिना मात्रा का ठहराव। चित्रा 2A मानव पित्त से अलग exosome के लिए संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के विशिष्ट परिणाम से पता चलता पुष्टि करने के लिए।

पृथक कणों की exosomal प्रकृति के आगे सत्यापन के लिए, पश्चिमी blots Tsg101 की तरह या CD63 tetraspanin प्रोटीन, चित्रा 2 बी में दिखाया गया है की उपस्थिति के लिए जांच कर इस्तेमाल किया जा रहा है। Exosome-विशिष्ट प्रोटीन से प्रति मौजूद नहीं है, लेकिन exosomes tetraspanins, विशेष रूप से CD9, CD63, CD81 और CD82 CD63 और CD81 के साथ में समृद्ध कर रहे हैं के रूप में शास्त्रीय exosome मार्कर, और प्रोटीन TSG101 और एलिक्स 21 तरह exosome गठन में शामिल करने के लिए भेजा। गर्मी झटका प्रोटीन आत्मीय 70 (Hsc70) और 73 (Hsc73) जैसे अन्य प्रोटीन, साथ ही प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) वर्ग द्वितीय अणुओं भी Hsc73 और परिधीय झिल्ली जुड़े prote की तरह कुछ के साथ exosomes में समृद्ध पाया जा सकता हैepidermal वृद्धि कारक -factor 8 (Mfge8) वृक्ष के समान कोशिकाओं 21 से स्रावित exosomes के लिए काफी विशिष्ट जा रहा है - दूध में वसा छोटा गोला में।

चित्रा 3 मानव पित्त की exosomes से निकाला miRNA प्रजातियों में से एक किस्म की खासियत वास्तविक समय प्रवर्धन भूखंडों से पता चलता है। exosomes के बाद से, कोशिकाओं के विपरीत, 18S या 28S rRNA या GAPDH या सामान्य बनाने के लिए β-actin की तरह गृह व्यवस्था जीन की तरह विश्वसनीय मानकों की कमी है, एक सिंथेटिक miRNA साथ spiking महत्वपूर्ण है। सिंथेटिक miRNA प्रभावी ढंग से अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य करने के लिए एक सक्षम करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस से सेल-मीर 39 की तरह एक अलग प्रजातियों से प्राप्त किया जाना चाहिए।

reproducibility के लिए यह जरूरी है कि पित्त जितनी जल्दी हो सके और न प्रसंस्कृत प्रसंस्करण के लिए पहले से जमे हुए के रूप में इन शर्तों के पित्त में मौजूद miRNAs की गिरावट के लिए नेतृत्व कर रहा है महत्वपूर्ण है। दूसरी ओर, एक बार अलग, exoso एमईएस, बहुत स्थिर है और काफी 48 घंटे के लिए या तीन तक फ्रीज पिघलना चक्र miRNA के कम से कम दो प्रजातियों के स्तर पर नगण्य प्रभाव के कारण आरटी पर भंडारण के रूप में प्रतिरोधी रहे हैं, हालांकि ब्याज की miRNA के लिए स्थिरता अनुभव से निर्धारित किया जाना है।

आकृति 1
चित्रा 1. (Nanoparticle) NTA विश्लेषण मानव पित्त exosomes को चिह्नित करने पित्त exosomes 1 के अनुपात में पीबीएस में पतला गया:। 600। (ए) आकार के वितरण और मानव पित्त से अलग ईवीएस की एकाग्रता। औसत आकार इस नमूने के लिए लगभग 97 समुद्री मील दूर होने के लिए निर्धारित किया गया था (एक्स अक्ष: exosomes आकार, वाई अक्ष: प्रत्येक आकार के लिए एकाग्रता exosomes)। एक ही नमूना ए आकार सीमा में विश्लेषण का (बी) नमूना स्नैप शॉट 30-110 एनएम से लेकर पुटिकाओं पता चलता है।= "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. आकार में मानव पित्त 70-110 एनएम में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और वर्तमान गोलाकार संरचनाओं के पश्चिमी धब्बा। (ए) संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा तैयारी की exosomal प्रकृति का सत्यापन। स्केल बार 100 एनएम है। (बी) पित्त exosomes के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ठेठ exosome मार्कर प्रोटीन TSG101 और CD63 की मौजूदगी से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पित्त exosomes से अलग miRNA प्रजातियों की वास्तविक समय पीसीआर। रीयलटाइम एक मीर सरणी की पीसीआर मानव पित्त exosomes (एक्स अक्ष, पीसीआर चक्र संख्या, वाई अक्ष, रिश्तेदार तीव्रता) से निकाले गए कई मीर प्रजाति के प्रवर्धन को दर्शाता है। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

मज़बूती से पित्त से अलग exosomes का उपयोग करने के लिए, यह बदले में उच्च गुणवत्ता के नमूने प्राप्त करने के लिए लगातार उच्च गुणवत्ता अलगाव के तरीकों को रोजगार के लिए महत्वपूर्ण है। कार्यप्रणाली इस पत्र में परिभाषित मानव पित्त से exosomes और miRNA को अलग-थलग करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तरीका है। यह अलग exosomes जो कम से कम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण और पश्चिमी blots शामिल करना चाहिए के लक्षण वर्णन में कई महत्वपूर्ण कदम पर प्रकाश डाला गया।

exosomes के अलगाव में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, कम से कम जब यह miRNA स्थिरता के लिए आता है, जितनी जल्दी हो सके ताजा पित्त संसाधित करने के लिए है। आरटी पर पूरे पित्त या एक भी फ्रीज पिघलना चक्र के लंबे समय तक भंडारण काफी miRNA की मात्रा को कम कर सकते हैं, जबकि इसके विपरीत में अलग-थलग exosomes बहुत स्थिर भी जब आरटी पर या कई फ्रीज पिघलना चक्र के दौर से गुजर संग्रहित कर रहे हैं। जब तक प्रश्न में नमूने -80 डिग्री सेल्सियस, exosomes और मीर के सफल अलगाव में संग्रहित किया गया हैपित्त से na नमूनों में miRNA हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए महान reproducibility के साथ किया जा सकता है। यह शुरू में उचित miRNA अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए नए सिरे से पित्त के साथ शुरू करने की सिफारिश की है। यह एक महत्वपूर्ण विचार जब के रूप में समय के साथ पित्त नमूनों का एक संग्रह का निर्माण करने के लिए रोगी के नमूने के लिए मामला होगा प्रयास में है। यह नमूने है कि महीनों या वर्षों में एकत्र किया गया है संसाधित और मूल्यांकन करने के लिए एक ही समय में संसाधित करने के लिए एक सक्षम बनाता है।

यह बहुत miRNA हस्ताक्षर है कि कैंसर जैसी बीमारी राज्य की उपस्थिति या उपचारात्मक उपायों को एक बीमारी की प्रतिक्रिया इस बात की पुष्टि के लिए देखने के लिए, नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए पित्त के उपयोग को बढ़ाती हैं या तो। वास्तव में, नैदानिक ​​नमूनों से परिणाम cholangiocarcinoma 19 के लिए बायोमार्कर के रूप में miRNA हस्ताक्षर स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

पहले centrifugation कदम बरकरार कोशिकाओं है कि पित्त में मौजूद हैं हटा। दूसरे में, उच्च गति centrifugation सेल देबआरआईएस, apoptotic निकायों और अन्य बड़े अंगों pelleted हैं। सुनिश्चित करने के लिए केवल कणों कि छोटे से 200 एनएम ultracentrifugation कदम में एकत्र कर रहे हैं, एक कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर के साथ छानने का कदम महत्वपूर्ण है। कुछ प्रोटोकॉल इस कदम न आना, लेकिन हमें लगता है यह आवश्यक है। 120,000 XG पर ultracentrifugation के बाद गोली प्राप्त काफी शुद्ध exosomes कि पीबीएस में तुरंत या मेजबान के बाद कार्रवाई की जा सकती है या तो -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया होता है। इस पद्धति की एक सीमा है कि गोली प्राप्त केवल अत्यधिक exosomes में समृद्ध है, लेकिन इस तरह के आकार अपवर्जन और polymeric वर्षा के रूप में अन्य संवर्धन तरीकों के लिए सच है। आगे की प्रक्रिया सूक्रोज ढाल या एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोती के बंधन से एक और शुद्धि कदम आवश्यक हो सकता है। exosomes के स्रोत (जैसे उदाहरण के लिए प्लाज्मा) के थक्के का एक परिणाम के रूप में अवक्षेप है, तो इस अतिरिक्त शुद्धि के लिए आवश्यक हो सकता है के रूप में इन विविक्त अक्सर exosomes के आकार के हो सकते हैं।विशेष रूप से, इम्युनो-शुद्धि के लिए एक अधिक exosome मार्कर समृद्ध तैयारी की ओर जाता है। नुकसान यह है कि यह आगे exosomes और / या miRNA वर्तमान की राशि को कम कर देता है, और सबसे प्रयोजनों के लिए समय और संसाधन लेने वाली प्रक्रिया का औचित्य साबित नहीं करता है। अगर, हालांकि, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण इस तरह calnexin, आगे की शुद्धि के रूप में एक जालिका प्रोटीन के माध्यम से microsome संदूषण की उपस्थिति, विशेष रूप से इम्युनो-अलगाव के आधार में पता लगाता है, सलाह दी है। हमारे अनुभव में यह शायद ही कभी पित्त के लिए मामला है, अगर एक जैविक तरल पदार्थ के अन्य स्रोतों के एक प्रतिरक्षा आधारित शुद्धि कदम की सिफारिश की जाएगी उपयोग करता है।

अंतर ultracentrifugation का उपयोग पित्त तरल पदार्थ से अलग और exosomes संतुष्ट करने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और लागत प्रभावी तरीका है। हालांकि यह एक ultracentrifuge के उपयोग की आवश्यकता है, एक स्विंग बाल्टी रोटर के साथ अधिमानतः, इन उपकरणों आमतौर पर कई संस्थानों में पाए जाते हैं। घनत्व centrifugation के माध्यम से आगे की शुद्धि संभव हैंएक ही उपकरण और ट्यूबों के साथ ई सफाई और नसबंदी के बाद पुन: प्रयोज्य कई बार कर रहे हैं। जबकि बहुलक आधारित वर्षा 10,000 XG या उससे कम की गति से अवक्षेप गोली केवल microcentrifuges या मानक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग आवश्यक है, यह आम तौर पर सह-अलग कर लिपो प्रोटीन सहित गैर-vesicular contaminants। जबकि आम तौर पर लिपो प्रोटीन पित्त में मौजूद नहीं हैं, अक्सर स्वामित्व और पेटेंट पॉलिमर की लागत अलगाव तुलना में महंगा बना। पॉलिमर भी कभी कभी ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के साथ असंगत हैं, लेकिन जब नीचे की ओर विश्लेषण बहुलक (आरएनए या प्रोटीन अलगाव) के साथ संगत है, विधि आसान, तेज है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है।

आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी लंबे समय से चल बार के नकारात्मक पक्ष और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, लेकिन बड़े और छोटे कणों की सटीक जुदाई की अनुमति देता है। Immunoaffinity शुद्धि उच्चतम purit पैदावारexosomal पुटिकाओं और यहां तक ​​की y इस तरह ली गई उपकला के रूप में विशिष्ट exosomal अंशों के अलगाव की अनुमति देता है, लेकिन यह कुल उपज की कीमत पर आता है। इसके अलावा, यह एक पहला कदम संवर्धन की आवश्यकता छोटे नमूनों की मात्रा को सीमित करता है, तो एक बड़ी मात्रा में संसाधित किया जा रहा है और अलग-थलग exosomes बाध्य एंटीबॉडी के कारण कार्यात्मक गतिविधि खो या बदल जैविक समारोह प्रदर्शन कर सकते है।

यह जब यह exosomes के अलगाव की बात आती बहाव के आवेदन (एस) और विशेष उपकरणों की उपलब्धता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। पृथक / समृद्ध कणों के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता अलगाव विधि की परवाह किए बिना महत्वपूर्ण है। Ultracentrifugation अब तक exosomal कणों की अपनी मजबूत और तेजी से (और लागत प्रभावी अगर एक ultracentrifuge उपलब्ध है) संवर्धन के कारण एक "सोने के मानक 'कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter Corning 431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 331374
SW40Ti rotor Beckman Coulter
LM10-HS  Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software  Nanosight
mirVANA Life Technologies AM1560
Complete Protease Inhibitor Roche distributed by Sigma-Aldrich 4693116001
Immobilon PSQ Millipore, Bedford MA ISEQ00010
Anti-CD63 antibody Abcam ab59479
Anti-Tsg101 Abcam ab30871

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चिकित्सा अंक 112 Exosomes बाह्य पुटिकाओं आण्विक जीवविज्ञान पित्त microRNA इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वेस्टर्न ब्लाट nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण
अलगाव और की रूपरेखा MicroRNA युक्त मानव पित्त से Exosomes
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Li, L., Piontek, K. B., Kumbhari,… More

Li, L., Piontek, K. B., Kumbhari, V., Ishida, M., Selaru, F. M. Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile. J. Vis. Exp. (112), e54036, doi:10.3791/54036 (2016).

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