Abstract
最後の3年間のエキソソームの研究は大幅にバイオマーカーとその治療用途の同定および特徴付けに向けて範囲を拡張しました。
エキソソームは、最近、マイクロRNA（のmiR）を含有することが示されています。 MIRS自体は、診断目的のための貴重なバイオマーカーとして生じています。診療所や病院での検体採取が非常に可変であるように、全体の胆汁からのmiRNA分離は、実質的に変化します。簡単な方法で収集され胆汁サンプルから、ロバスト正確で再現性のmiRNAプロファイルを達成するために胆汁からエキソソームを単離し、特徴づけるために、高品質のプロトコルの開発を必要としました。方法は、いくつかの遠心分離および単離されたエキソソームをペレット化し、最終的な超遠心分離ステップで濾過工程を必要とします。電子顕微鏡、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーおよびマルチパラメータナノ粒子の光学分析、電子の品質を検証するための重要な特性評価ステップである利用可能xosomes。これらのエキソソームからのmiRNAの単離のために、 線虫（Caenorhabditis elegans）のような種から非特異的、合成miRNAで溶解液をスパイク、 すなわち 、CEL-のmiR-39は、RNA抽出効率の正規化のために重要です。この方法以下の胆汁液からのエキソソームの単離に成功したmiRNAは-80℃で数年間保存胆汁サンプルからプロファイリングできます。
Introduction
他の生物学的流体、すなわち、母乳、血漿または尿のように、胆汁はエキソソーム、脂質の豊富な小胞1-4が含まれています 。エキソソームは、誘導または受容細胞5、6、彼らの正常な機能4、7-9の一部である可能性があります細胞間コミュニケーションの形で生物学的機能を変化させることができます。エキソソームは、診断10のためのバイオマーカーの貴重な情報源を提供することができmiRNA種を含むことができます。 miRNAプロファイルは、疾患11-14の様々な診断および予後マーカーとして、近年かなりの注目を集めています。
miRNA自体は、おそらく死細胞により放出され、脱落細胞の量が大幅に基礎疾患によって影響を受けることができ、生物学的流体中に見出すことができます。エキソソームのmiRNAプロファイルは、必ずしも元のセル6、10、15から17のmiRNAプロファイルを反映していない、まだエキソソームは、親CEの特徴であるかもしれないのmiRNAの署名を運ぶことができます腫瘍細胞が好きでしょう。腫瘍由来エキソソームは、肺腺癌、前立腺癌および他の腫瘍8、16、18の患者の血漿中で同定されています。
この方法の目的は、彼らの前処理手順の大部分は独立したヒト胆汁標本からのエキソソームの信頼性の高い堅牢な単離であります。このような胆管19と胆管の疾患の潜在的な診断のためのmiRNAの信頼できる情報源としての胆汁を利用するために開発されました。これは、エキソソームを単離するために、速度の増加に伴って、遠心分離のいくつかのステップで構成され、他の生物学的流体に適用できる可能性があります。
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Protocol
内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ERCP）によって患者から胆汁を取得する治験審査委員会によるヒト被験者の治験実施計画書の承認を必要とします。ここで提示すべての作業は、ジョンズ・ホプキンス大学の治験審査委員会によって承認されました。
胆汁から1.エキソソームの単離
- 内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ERCP）を実行します。仰臥位で患者を置き、挿管。
- 患者の口を通って十二指腸を通過し、十二指腸の第二部に挿入し、主要な乳頭を識別します。
- 選択トリプルルーメンは0.035インチ（0.9ミリメートル）親水性ガイドワイヤが事前にロードされた括約筋切開刀挿入することにより、総胆管にカニューレを挿入。
- 機会に、右肝管から胆嚢管を区別することが困難な場合があるため、左肝管に透視下でガイドワイヤを進め、次に進めます安定した位置を取得するための胆管への括約筋切開刀5センチメートル。
- ルアーロックを介してガイドワイヤポートに10ミリリットル注射器を取り付け、ガイドワイヤを外し、負圧の10ミリリットルを使用して胆汁を吸引します。
- ガイドワイヤーを再挿入し、胆管系を不透明化するために注入口を介して造影剤を注入することにより、ERCPを続行するために胆汁を含む注射器を取り外します。
- 氷上で15ミリリットルチューブに回収胆汁を移し、遠心分離ステップを続行する準備ができるまで氷上に保ちます。
注意：自分自身とサンプルを保護するために手袋を着用してください！それはA型肝炎ウイルス粒子を含有することができるように感染の潜在的な供給源として胆汁トリート！ - 氷上でのサンプル（複数可）してください。いずれかの10分間、4℃で500×gでステップ1.2または遠心分離機を続行し、さらに使用するまで-80℃で凍結します。
注：数年前からこの方法で保存された試料は、日常的に良い結果19で使用されています。 - 微量遠心管に胆汁の400μLを移し、4℃で10分間、300×gでの遠心分離により細胞および細胞破片を集めます。
- ピペットで上清を除去し、さらに破片の上清をクリアするために4℃でさらに20分間、16,500×gで新鮮なマイクロ遠心チューブと遠心分離機にサンプル（複数可）を転送します。バイオハザード廃棄物にチューブを捨てます。あるいは、代わりに、超遠心機でサンプルをスピン。
- 上清を収集し、左から200nmよりも大きい任意の粒子を除去するために結合の良好な流量と低タンパク質を持っている0.2μmのポリエーテルスルホン（PES）膜フィルターを通してシリンジで生物学的安全キャビネットの中でそれをフィルタリングします。
- ピペット管を超遠心し、チューブが完全な2/3以上になるようにPBSを追加するために濾過した上清。チューブはそれより少ない液体が含まれている場合、チューブが遠心分離中に崩壊します！チューブは、洗浄オートクレーブと数回再使用することができます。
- ペルら4℃で70分間120,000×gで超遠心分離を通じてエキソソーム。時々小さな黄色のペレットを参照するには、超遠心分離管の底部での遠心分離を見た後、これらはエキソソームです。
- 慎重にデカントすることによって上清を捨て、10％v / vの最終濃度に漂白剤を添加することにより、廃棄物を消毒し、20分間放置。
- 下流の実験のために、いずれかの適切な溶液の小体積のペレット（複数可）を処理（ すなわち、放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）タンパク質の単離、のmiRの単離のためのRNA溶解緩衝液のための緩衝液）またはリン酸の50〜150μl中に再懸濁バッファリング生理食塩水、将来の使用のために-80℃で保存することができるいずれか（PBS）（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）またはタンパク質の抽出など ）またはエキソソームTEMによって調製またはナノ粒子の光学分析の特徴付けのために使用さ。
2.エキソソーム同定透過型電子顕微鏡（TEM）またはCryoEM
- ピペッティングにより100μlのPBSで細胞外小胞を再懸濁します。初めての分離を行う場合は特に理想的には、-20℃で保存するか、またはされていません-80℃〜エキソソームを使用します。
- 2分間の400メッシュの炭素被覆Parlodionの銅グリッドに20μlのアリコート（約2μgの）を吸着し、室温で乾燥させます。
- 乾燥製剤に慎重に滴を配置することにより、室温で5分間、1％（v / v）のグルタルアルデヒド（EMグレード）にエキソソームを修正しました。
- 5分間、水で2回グリッドを洗浄した後、30秒間、1％リンタングステン酸（PTA）で染色電気自動車を対比。
- 20,000の倍率で開始し、粒子の大きさを決定する際100,000に増加80キロボルトの加速電圧で電子顕微鏡で画像を取得します。
注：ホルムバール炭素でコーティングされた200メッシュの銅やニッケルグリッドと対比染色李上に重ね着のような他のプレップ10~15分間KE 1％または2％酢酸ウラニルも可能です。 - （：3比1）CryoEMのために、60μlのプロテインGの金を10nmと20μlのアリコート（約2μgの）を混ぜます。これは、エキソソームの直径を決定するのに役立ちます。
- グロー放電さC-フラットホーリーカーボングリッド上にサンプルを転送し、ブロッティングにより、過剰な液体を除去します。直ちに液体エタンにそれらを浸漬することにより、グリッドをフリーズします。
- 液体窒素中cryoholderにグリッドをマウントします。
- 20,000と100,000の倍率で200kVで画像を取得します。
マルチパラメータナノ粒子の光学分析による3エキソソーム同定
- ピペッティングにより100μlのPBSで孤立エキソソームを再懸濁します。
- いくつかの異なる比で600μlのPBS中のエキソソームを希釈（のような1時50分、1：100、1：300、1：600および1：1200）。
- manufactuに応じてリアルタイムで適切な機器およびソフトウェアを用いてレーザー光散乱によってエキソソームを可視化RERのプロトコル20。
- 粒子が見えるようになるまで、粒子が滑らかに見えるようにフォーカスを調整し、撮影モードでカメラのレベルを上げます。
- 標準モードでは、粒子はまだ見ることができる最低レベルにカメラを減少しながら、必要なカメラのシャッターとゲインを調整する場合は、これを達成します。
- 視覚ユニットをフラッシュし、PBSで希釈調整しない場合は、20から100の粒子が画面に表示されていることを確認して下さい。
- その後、30-60間の秒にキャプチャ持続時間を調整します。ビデオがキャプチャされた後、全ての粒子が画面上で確認されるまでの処理パラメータを調整し、ビデオファイルを処理します。
ウエスタンブロット4.エキソソーム特性評価
- 氷冷放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）の100μl中の胆汁2-5 mlで溶解エキソソームペレットピペッティングによりプロテアーゼ阻害剤でバッファリングし、ダウン徹底的に30秒間激しく溶解物を混ぜます効果的にタンパク質を可溶化する渦に。
- ほとんどの時間必要ではないが、完全な溶解を確実にするために10秒ごとに、2パルスと氷上でサンプルのパルス超音波処理を使用します。
- 5分間、4℃で15,000×gで遠心分離することによって不溶性物質をペレット化し、清潔なチューブに上清を移します。
- 選択の方法、製造業者のプロトコルに従って（ すなわち 、ビシンコニン酸（BCA）、クマシー、修正ローリー、660 nmのタンパク質アッセイなど ）でタンパク質濃度を決定します。同様の方法は、実験間で比較することができる結果を達成するために一貫して使用される方法は、長いほど重要ではありません。
- 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル（PAGE）のウェルに5分間95℃で試料を加熱した後、負荷Laemmli緩衝液中でサンプル当たり50μgのタンパク質。
- 1.5時間PAGEゲル上でサンプルを電気泳動し、ナイロン膜上に分離されたタンパク質を移します。
- B次いで、希釈した抗CD63及び抗TSG-101のようなエキソソーム特異的抗体を用いてインキュベートし、1時間、0.1％のTween 20（TBS-T）を用いてトリス緩衝生理食塩水中の5％脱脂乳で膜（複数可）をロックします1の：500 4℃で、好ましくは、O / N。
- TBS-T 3×10分を有する膜を洗浄し、その後、室温で1-2時間、TBS-T中の5％脱脂乳にHRP結合二次抗体と一致する、適切でインキュベートします。
- 膜（複数可）TBS-Tで3×5分間洗浄し、製造業者のプロトコルに従って、化学発光試薬で特定のタンパク質を検出します。
- イメージフィルムか、製造元のプロトコルに従ってデジタルイメージングシステムを有する膜。
単離されたエキソソームから5マイクロRNAの単離
注：胆汁エキソソームからmiRNAの単離は、市販のキットに基づいて修正されたmiRNAの単離を用いて行われるが、他の任意のRNA単離方法を用いるまたは適合させることができます。
- 300＆を追加＃181;リットル（400μlの胆汁から単離された）エキソソームペレットに溶解/ビル・バッファは、渦、ピペットまたは完全に均一溶解液を得るためにエキソソームを溶解するために、針/注射器を通過します。
- miRNAのホモジネート添加剤の1月10日（30μL）ボリュームを追加し、ボルテックスまたはチューブを数時間を反転させてよく混ぜます。
- 氷上で10分間ミックスをインキュベートします。
- 酸性フェノールのボリュームを追加します。最初のホモジネート（300μl）を等しいクロロホルムを。
- 5フェムトモル/μlのCEL-のmiR 39および30から60秒間渦の5μlを添加します。
- 水（上）と有機（下）の相を分離するために、室温で万×gで5分間遠心分離します。
- 転送量に注意しながら、慎重に新しいチューブにピペッティングし、転送することにより、上相を吸引します。適切な有機廃棄物容器内の有機相を捨てます。
- 低分子RNAを濃縮するためには、回収された水相に100％エタノールの1/3量を追加し、徹底的にTUをボルテックスまたは転倒混和します数回です。
- 一度に700μlのまでピペットフィルターカートリッジへのライセート/エタノール混合物、。
- 万XGの最大で15秒間のカートリッジを遠心分離やフィルターを通して混合物を渡すために真空を適用します。
- ろ液を収集し、溶解液/エタノール混合物は700μLを超えた場合、新しいチューブにフロースルーを転送し、すべてのろ液を収集するための手順を繰り返します。これらのフィルタは、低分子RNAを欠くRNA画分を含み、これらのより大きなRNAを回収するために使用することができます。
- 総ろ液にRT 100％エタノールの2/3量を加え、ボルテックスで混和します。
- ピペット第二のフィルタカートリッジにろ液/エタノール混合物。一度に印加できる最大容量は700μlである前にのように。
- 万×gで15秒間遠心分離またはステップ5.10で説明したように真空を適用します。
- フロースルーを捨て、ろ液/エタノール混合物のすべてがフィルタリングされるまで繰り返します。
- 700を適用します81;フィルターカートリッジへリットルのmiRNAの洗浄液1、5〜10秒間遠心分離または真空を適用し、フロースルーを捨てます。
- ステップ5.16で行われるように500μlの洗浄溶液2/3でフィルターを洗ってください。
- 、ステップ5.16のように洗浄溶液2/3の500μlの二回目の洗浄フロースルーを廃棄し、バックコレクションチューブにフィルターを置き繰り返します。
- フィルタからすべての残留流体を除去するために、万×gで1分間フィルターカートリッジをスピン。
- 新鮮なコレクションチューブにフィルターカートリッジを移し、フィルタの中心に熱い（95℃）ヌクレアーゼを含まない水100μlを適用します。
- RNAを回収するために最大速度で20〜30秒間、アセンブリをスピン。
- 溶出液を収集し、直ちに使用するか、または-80℃で保存します。
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Representative Results
エキソソームは、通常の顕微鏡検査によって検出またはフローサイトメトリーするには小さすぎるので、電子顕微鏡またはナノ粒子の光学分析を行う必要があります。ナノ粒子の光学分析は、それはまた、定量的であり、サイズ分布および濃度を提供する電子顕微鏡に勝る利点を有します。計器は、サンプルにガラスプリズムを介して細く絞ったレーザビームを導入しています。孤立した小胞のブラウン運動は、EMCCD高感度カメラを介して捕捉し、フレームごとに追跡されます。ナノ粒子は、分析（NTA）ソフトウェア測定胆汁エキソソーム調製物のサイズ、モード分布を計算するために、フレームには、このブラウン運動のフレームを追跡する。 図1は、ヒト胆汁サンプルから単離したエキソソームの典型的なNTA分析の結果を示します。
代替的に、電子顕微鏡を利用することができます定量化せずにもかかわらず、単離された粒子のサイズを確認する。 図2Aは、ヒトの胆汁から単離したエキソソームのための透過型電子顕微鏡の典型的な結果を示しています。
分離された粒子のエキソソーム性質のさらなる検証のために、 図2（b）に示すTSG101またはテトラスパニンCD63様タンパク質の存在についてプロービングウェスタンブロットは、使用しなければなりません。エキソソーム特異的タンパク質は、 それ自体が存在しませんが、エキソソームは、TSG101とアリックス21のようなエキソソーム形成に関与するなどの古典的エキソソームマーカー、およびタンパク質と呼ばCD63とCD81とのテトラスパニン、特にCD9、CD63、CD81およびCD82に富んでいます。他の熱ショックタンパク質の同族70（Hsc70の）および73（Hsc73）のようなタンパク質、ならびに主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子はまた、Hsc73と周辺膜関連proteようないくつかにエクソソームに富んで見つけることができます乳脂肪球中-上皮成長因子-factor 8（Mfge8）は、樹状細胞21から分泌されるエキソソームのための非常に特異的です。
図3は、ヒト胆汁のエキソソームから抽出されたmiRNA種の様々な典型的なリアルタイム増幅プロットを示します。エキソソームので、細胞とは異なり、18Sまたは28S rRNAのか、正規化のためのGAPDHまたはβアクチンのようなハウスキーピング遺伝子のような信頼性の高い基準を欠いている、合成miRNAとのスパイクが重要です。合成miRNAは、効果的に発現レベルを正常化することを可能にするために線虫（Caenorhabditis elegans）からCEL-のmiR 39のような別の種に由来する必要があります。
再現性のためには、胆汁ができるだけ早く処理され、これらの条件が胆汁中に存在するmiRNAの劣化につながるとして、処理前に凍結されていないことが重要です。一方、一度exoso、単離されました MESは、非常に安定しており、48時間室温で貯蔵として非常に耐性である、または関心のmiRNAのための安定性を経験的に決定されなければならないが、最大3回の凍結融解サイクルは、miRNAの少なくとも二つの種のレベルにほとんど影響を与えます。
図1（ ナノ粒子）NTA分析は、ヒト胆汁エキソソームを特徴付けるために胆汁エキソソームは、1の比でPBSで希釈した：600。電気自動車の（A）のサイズ分布と濃度は、ヒト胆汁から単離されました。 （：エキソソームサイズ、y軸：各サイズ濃度エキソソームx軸）の平均サイズは、このサンプルでは約97 nmであると決定されました。 A.サイズ範囲で分析同じ試料の（B）のサンプルのスナップショットは、30から110ナノメートルの範囲の小胞を示しています。= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
透過型電子顕微鏡とウエスタンブロットによって図の準備のエキソソーム性質の2.検証を。サイズは70から110 nmのヒト胆汁中に存在する球状構造の（A）透過型電子顕微鏡（TEM）。スケールバーは100nmです。 （B）胆管エキソソームのウェスタンブロット分析は、典型的なエキソソームマーカータンパク質TSG101とCD63の存在を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
胆汁エキソソームから単離したmiRNA種の図3リアルタイムPCR。レアル-timeのmiR配列のPCRは、ヒト胆管エキソソーム（x軸、PCRサイクル数; y軸、相対強度）から抽出された複数のmiR種の増幅を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
確実胆汁から単離したエキソソームを利用するためには、引き換えに、高品質のサンプルを得るために、一貫した高品質の単離方法を用いることが重要です。本論文で定義された方法論は、ヒト胆汁からエキソソームとのmiRNAを単離するための十分に確立された方法です。これは、最低でも電子顕微鏡やナノ粒子の光学分析とウェスタンブロットを含むべきである単離されたエキソソームの特性のいくつかの重要なステップを強調しています。
エキソソームの単離の中で最も重要なステップは、少なくともそれがmiRNAの安定性に来るとき、できるだけ早く新鮮な胆汁を処理することです。対照的に、単離されたエキソソームは、室温で保存するか、または複数の凍結融解サイクルを受けた場合であっても非常に安定であるが、室温で全胆汁の長期貯蔵または単一の凍結融解サイクルを大幅miRNAの量を減少させることができます。限り、問題のサンプルは-80°C、エキソソームの成功分離およびmiRで保存されているように胆汁のNAは、サンプル中のmiRNAシグネチャーを同定するための優れた再現性よく行うことができます。当初は、適切なmiRNAの整合性を確保するために、新鮮な胆汁で開始することをお勧めします。患者サンプルに対する場合のように経時胆汁サンプルのコレクションを構築しようとするとき、これは重要な考慮事項です。これは、同時に処理され、評価される数ヶ月または数年にわたって収集されたサンプルを処理することを可能。
これは大幅に癌のような疾患状態の存在または治療的介入に対する疾病の応答を確認したmiRNAの署名を探すためにどちらか、診断目的のために胆汁の使用を強化します。実際には、臨床サンプルからの結果は、胆管19のためのバイオマーカーとしてのmiRNAシグネチャを確立するために使用されてきました。
最初の遠心分離工程は、胆汁中に存在する無傷の細胞を除去します。第二には、高速遠心分離セルDEBRIS、アポトーシス体および他のより大きな細胞小器官は、ペレット化されています。唯一の200nm未満の超遠心分離工程において収集される粒子いることを確実にするために、低タンパク質結合フィルターで濾過工程が重要です。いくつかのプロトコルは、この手順を省略しますが、我々はそれが必要だと思います。 12万×gで超遠心分離後、得られたペレットを-80℃で保存するPBSで直ちにまたは再懸濁後に処理することができますいずれか、かなり純粋なエキソソームが含まれています。この方法の制限は、得られたペレットは、唯一の非常にエクソソームに富んでいるが、これは、このようなサイズ排除およびポリマーの沈殿などの他の濃縮方法にも当てはまることです。さらなる処理は、ショ糖勾配または抗体被覆磁気ビーズに結合することによって、別の精製工程を伴う可能性があります。 （例えば、プラズマ用など）エキソソームのソースは凝固の結果、沈殿物が含まれている場合、これらの粒子は、多くの場合、エキソソームの大きさを持つことができるように、この余分な精製が必要になる場合があります。具体的には、免疫精製は、よりエキソソームマーカー濃縮製剤をもたらします。欠点は、これはさらにエキソソームおよび/またはmiRNAの存在量が減少し、ほとんどの目的のために時間とリソースを消費するプロセスを正当化しないことです。しかし、ウエスタンブロット分析は、カルネキシン、さらに精製すること、特に免疫隔離ベース、小胞体タンパク質を介してミクロソーム汚染の存在を検出した場合お勧めします。我々の経験では、これは1つが生物学的流体の他のソースを使用している場合、免疫系の精製工程が推奨されるであろう、まれに胆汁のためのケースではありません。
胆汁流体からエキソソームを単離し、濃縮する差動超遠心分離を使用することは、比較的迅速かつ費用効果的な方法です。それは、超遠心分離機の使用を必要とするが、好ましくは、スイングバケットローターで、これらのデバイスは、一般的に、多くの施設で見られます。密度遠心分離を介して、さらなる精製はpossiblあります同じ装置及び管を有するeは、洗浄と滅菌後の再利用可能ないくつかの時間です。ポリマーベースの降水量が10,000 XG以下の速度で沈殿物をペレットにマイクロ遠心器または標準の遠心分離機の使用のみが必要ですが、それは一般的に、リポタンパク質を含む非小胞性汚染物質を同時隔離します。リポタンパク質は、一般的に、胆汁中には存在しないが、多くの場合、独自の特許取得済みのポリマーのコストは比較に絶縁が高価にします。ポリマーはまた、質量分析などの下流のアプリケーションと時々互換性がありませんが、下流の分析は、ポリマー（RNAまたはタンパク質の単離）と互換性があるときに、この方法は速く、簡単で、特定の機器を必要としません。
サイズ排除クロマトグラフィーは、長い実行時間の欠点や特別な機器の要件がありますが、大小の粒子の正確な分離を可能にします。免疫親和性精製は、最高puritをもたらしますでも、エキソソーム小胞とのyは、このような派生上皮などの特定のエキソソーム画分の単離を可能にするが、これは全収量のコストがかかります。大量に処理すると、単離されたエキソソームが原因で結合した抗体に機能的活性を失うか、改変された生物学的機能を発揮することができる場合にはまた、第一の濃縮工程を必要とする小さなサンプル体積に制限されます。
エキソソームの単離になると下流側のアプリケーション（複数可）と特殊な装置の利用可能性を考慮することが重要です。孤立/富む粒子の特性に関係なく使用される分離方法の重要です。 （超遠心機が利用可能な場合や費用対効果）超遠心分離は、これまでエキソソーム粒子の濃縮、その堅牢かつ高速に多くの研究室で使用される「ゴールドスタンダード」となっています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
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