Abstract
exosome la investigación en los últimos tres años ha ampliado considerablemente el alcance hacia la identificación y caracterización de biomarcadores y sus usos terapéuticos.
Los exosomas han sido recientemente demostrado que contienen microRNAs (MIR). MIRS mismos han surgido como biomarcadores valiosos para fines de diagnóstico. Como la recogida de muestras en clínicas y hospitales es bastante variable, miARN aislamiento de la bilis toda varía sustancialmente. Para lograr perfiles de miARN robustos, precisos y reproducibles de muestras de bilis recogidos de una manera sencilla requerido el desarrollo de un protocolo de alta calidad para aislar y caracterizar los exosomas de la bilis. El método requiere varias centrifugaciones y una etapa de filtración con una etapa de ultracentrifugación final para sedimentar las exosomas aisladas. La microscopía electrónica, transferencias Western, citometría de flujo y análisis óptico de nanopartículas de múltiples parámetros, si están disponibles, son pasos cruciales para validar la caracterización de la calidad del correoxosomes. Para el aislamiento de los genes miARN de estos exosomas, Rematar el lisado con una, miRNA sintético no específica de una especie como Caenorhabditis elegans, es decir, Cel-miR-39, es importante para la normalización de la eficacia de la extracción de ARN. El aislamiento de exosomas del líquido biliar siguiendo este método permite que el éxito miARN perfiles de las muestras de bilis acumulada durante varios años a -80 ° C.
Introduction
Al igual que otros fluidos biológicos, es decir, la leche materna, plasma u orina, bilis contiene lípidos exosomas, vesículas ricas 1-4. Los exosomas pueden inducir o alterar las funciones biológicas en células receptoras 5, 6, una forma de comunicación célula-célula que podría ser parte de su función normal 4, 7-9. Los exosomas pueden contener especies miARN que pueden proporcionar una valiosa fuente de biomarcadores para el diagnóstico 10. perfiles de miRNAs han ganado considerable atención en los últimos años como marcadores de diagnóstico y pronóstico para una variedad de enfermedades 11-14.
sí miARN puede encontrarse en fluidos biológicos, posiblemente liberada por las células muertas y la cantidad de células que se desprenden pueden ser influenciados en gran medida por una enfermedad subyacente. El perfil de miARN de exosomas no refleja necesariamente el perfil de miRNA de las células originarias 6, 10, 15-17, sin embargo, puede llevar a exosomas firmas de miARN que podrían ser característico de la CE de los padreste gusta una célula tumoral. Exosomas derivado de un tumor se han identificado en el plasma de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, cáncer de próstata y otros tumores 8, 16, 18.
El objetivo de este método es el aislamiento fiable y robusto de exosomas de muestras biliares humanos, en gran parte independientes de sus procedimientos de manipulación anteriores. Fue desarrollado para utilizar bilis como una fuente fiable de miARN para el diagnóstico potencial de las enfermedades de las vías biliares tales como colangiocarcinoma 19. Consta de varias etapas de centrifugación con el aumento de las velocidades de aislar exosomas y podría ser aplicable a otros fluidos biológicos.
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Protocol
La obtención de la bilis de pacientes por la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) requiere la aprobación de un protocolo de estudio los sujetos humanos por la Junta de Revisión Institucional. Todo el trabajo que aquí se presenta ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins.
1. Aislamiento de exosomas de la bilis
- Realizar la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE). Colocar al paciente en posición supina y intubar.
- Pasar un duodenoscopio a través de la boca del paciente y la inserta en la segunda parte del duodeno e identificar la papila mayor.
- Selectivamente canular el conducto biliar común mediante la inserción de un triple lumen esfinterotomo pre-cargado con una guía hidrofílica 0,035 pulgadas (0,9 mm).
- Avanzar la guía bajo guía fluoroscópica con el conducto hepático izquierdo ya que en ocasiones puede ser difícil diferenciar el conducto cístico desde el conducto hepático derecho, a continuación, hacer avanzar elesfinterótomo 5 cm en el conducto biliar para adquirir una posición estable.
- Retire el alambre guía, acople una jeringa de 10 ml al puerto de alambre guía a través del cierre Luer y aspirar la bilis utilizando 10 ml de presión negativa.
- Retire la jeringa que contiene la bilis para proceder con la CPRE volviendo a insertar el alambre de guía y el agente de contraste a través de la inyección de la abertura de inyección para opacificar el árbol biliar.
- La transferencia de la bilis recogido en un tubo de 15 ml en hielo y mantener en hielo hasta que esté listo para proceder con la etapa de centrifugación.
Precaución: Use guantes para protegerse y proteger a las muestras! El tratamiento de la bilis como una fuente potencial de infección, ya que puede contener partículas virales de hepatitis A! - Mantenga la muestra (s) en hielo. Cualquiera de proceder con el paso 1.2 o centrifugar a 500 xg a 4 ° C durante 10 min y luego se congelan a -80 ° C hasta su uso posterior.
Nota: Las muestras almacenadas de esta manera durante varios años de forma rutinaria se han utilizado con buenos resultados 19. - Transferencia de 400 l de bilis en un tubo de microcentrífuga y recoger las células y los restos celulares por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante con la pipeta, transferir a un tubo de microcentrífuga fresco y centrifugar la muestra (s) a 16.500 xg durante otros 20 min a 4 ° C para borrar el sobrenadante de desechos adicionales. Desechar los tubos en los residuos de riesgo biológico. Como alternativa, girar las muestras en una ultracentrífuga lugar.
- Recoger el sobrenadante y filtrar en una cabina de bioseguridad con una jeringa a través de un filtro de membrana de 0,2 micras de polietersulfona (PES) que tiene buenas tasas de flujo y baja en proteínas de unión para eliminar las partículas más grandes que 200 nm fue.
- Pipetear el sobrenadante se filtró para ultracentrífuga tubos y añadir PBS de modo que los tubos son más de 2/3. Si los tubos contienen menos líquidos que eso, los tubos se derrumbará durante la centrifugación! Los tubos pueden ser lavados, en autoclave y volver a utilizar varias veces.
- Pelly los exosomas mediante ultracentrifugación a 120.000 xg durante 70 min a 4 ° C. Después de la centrifugación mirada en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga para ver a veces pequeñas bolitas amarillas; estos son los exosomas.
- Eliminar el sobrenadante por decantación con cuidado y desinfectar los residuos mediante la adición de cloro para una concentración final de 10% v / v y se deja reposar durante 20 minutos.
- Para los experimentos de aguas abajo, o bien procesar la pastilla (s) en un pequeño volumen de la solución apropiada (es decir, ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón para el aislamiento de proteínas, tampón de lisis de ARN para el aislamiento MIR) o resuspender en 50 a 150 l de fosfato tamponada de solución salina (PBS) que puede ser almacenado, ya sea a -80 ° C para su uso futuro (reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) o la extracción de proteínas etc.) o se utiliza para la caracterización de la preparación exosome por TEM o análisis óptico de nanopartículas .
2. Identificación por exosomeMicroscopía Electrónica de Transmisión (TEM) o cryoEM
- Volver a suspender las vesículas extracelulares en 100 l de PBS con la pipeta. Lo ideal es utilizar exosomas que no han sido almacenadas a -20 ° C o -80 ° C, especialmente cuando se realiza el aislamiento por primera vez.
- Adsorber una alícuota de 20 l (aproximadamente 2 g) a 400 rejillas de cobre Parlodion recubiertas de carbono de malla durante 2 minutos y dejar secar a temperatura ambiente.
- Fijar el exosoma en 1% (v / v) de glutaraldehído (EM-grado) durante 5 min a RT mediante la colocación de gotas cuidadosamente sobre la preparación seca.
- Lavar las rejillas dos veces con agua durante 5 min y luego contrastar EVs mancha con ácido fosfotúngstico al 1% (PTA) durante 30 s.
- Adquirir imágenes con un microscopio electrónico con un voltaje de aceleración de 80 kilovoltios a partir de las ampliaciones de 20.000X y se eleva a 100,000X al determinar el tamaño de las partículas.
Nota: Otras preparaciones como capas en 200 rejillas de malla de carbono recubiertos con Formvar de cobre o níquel y li contraste tinciónke 1% o 2% de acetato de uranilo durante 10-15 min también son posibles. - Para cryoEM, mezclar una parte alícuota de 20 l (aproximadamente 2 g) con 60 l de proteína G de oro 10 nm (relación 1: 3). Esto ayudará a determinar el diámetro de exosomas.
- La transferencia de las muestras sobre rejillas de carbón perforado descargada resplandor-C-plana y eliminar el exceso de líquido mediante secado. Congelar las rejillas sumergiéndolos inmediatamente en etano líquido.
- Montar las rejillas en un cryoholder en nitrógeno líquido.
- Adquirir las imágenes en 200 kV con magnificaciones de 20.000X y 100,000X.
3. Identificación por exosome multiparámetros de nanopartículas análisis óptico
- Volver a suspender los exosomas aislados en 100 l de PBS con la pipeta.
- Diluir exosomas en 600 l de PBS en varias proporciones diferentes (como 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 y 1: 1200).
- Visualizar los exosomas por dispersión de luz láser con el instrumento y el software adecuado en tiempo real de acuerdo con la fabriel protocolo del RER 20.
- Aumentar el nivel de la cámara en el modo de captura hasta que las partículas se hacen visibles, a continuación, ajustar el enfoque para hacer que las partículas se vean sin problemas.
- Mientras que en el modo estándar, disminuir la cámara al nivel más bajo que las partículas todavía pueden verse, si es necesario ajustar obturador de la cámara y la ganancia para lograr esto.
- una inspección visual para asegurarse de 20-100 partículas son visibles en la pantalla, si no eliminar la unidad y ajustar la dilución en PBS.
- A continuación, ajuste la duración de captura de entre 30-60 seg. Después de que se capturó el vídeo, ajustar los parámetros de proceso hasta que todas las partículas se clasifican en la pantalla y procesar el archivo de vídeo.
4. Caracterización de exosomas por Western Blot
- Lyse gránulos de exosoma de 2-5 ml de bilis en 100 l de ensayo de radioinmunoprecipitación enfriado con hielo (RIPA) tampón con un inhibidor de la proteasa pipeteando arriba y abajo a fondo y mezclar lisados vigorosamente durante 30 secen un vórtice para solubilizar las proteínas de manera eficaz.
- Mientras que la mayoría de las veces no es necesario, utilizar pulsos de sonicación de las muestras en hielo con 2 impulsos de 10 segundos cada uno para asegurar la lisis completa.
- Se precipitan material insoluble por centrifugación a 15.000 xg a 4 ° C durante 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
- Determinar la concentración de proteína con un método de elección (es decir, el ácido bicinconínico (BCA), Coomassie, Lowry modificado, 660 nm de ensayo de proteínas, etc.) según el protocolo del fabricante. El método no es tan importante como el tiempo que se utiliza el mismo método consistente para lograr los resultados que se pueden comparar a través de experimentos.
- Cargar 50 g de proteína por muestra en tampón de Laemmli después de calentar la muestra a 95 ° C durante 5 min en un pozo de un gel de poliacrilamida para electroforesis (PAGE).
- La electroforesis de las muestras en los geles PAGE durante 1,5 horas y transferir las proteínas separadas a una membrana de nylon.
- segundobloquear la membrana (s) con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween 20 (TBS-T) durante 1 h, después se incuba con anticuerpos de exosoma específica como anti-CD63 y anti-TSG-101 a una dilución de 1: 500, preferiblemente O / N a 4 ° C.
- Lavar las membranas con TBS-T 3 x 10 min, a continuación se incuba con un apropiado, búsqueda de anticuerpo secundario conjugado con HRP en 5% de leche sin grasa en TBS-T durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
- Lavar la membrana (s) 3 x 5 min con TBS-T y detectar las proteínas específicas con reactivos de quimioluminiscencia de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Image las membranas con película o un sistema de imagen digital de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. El microARN aislamiento de los exosomas aislados
Nota: El aislamiento de los genes miARN de exosomas biliares se lleva a cabo utilizando un aislamiento de los genes miARN modificado basado en un kit disponible en el mercado, pero cualquier otro método de aislamiento de ARN puede utilizarse o adaptarse.
- Añadir 300 y# 181; l tampón de lisis / edificio al sedimento de exosomas (aislado de la bilis 400 l), vórtice, pipeta o pasar a través de una aguja / jeringa para lisar completamente los exosomas para obtener un lisado homogénea.
- Añadir 1/10 (30 l) volumen de miARN homogeneizado aditivo, y mezclar bien por agitación o invirtiendo el tubo varias veces.
- Incubar la mezcla durante 10 min en hielo.
- Añadir un volumen de ácido-fenol: cloroformo igual al homogeneizado inicial (300 l).
- Añadir 5 l de 5 fmol / l cel-MIR 39 y agitar durante 30-60 segundos.
- Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg a la temperatura ambiente para separar la fase acuosa (superior) y las fases orgánicas (inferiores).
- aspirar con cuidado la fase superior con la pipeta y transferir a un tubo nuevo al tiempo que observa el volumen transferido. Descartar la fase orgánica en el contenedor de residuos orgánico apropiado.
- Para enriquecer a los pequeños ARN añaden 1/3 volumen de etanol al 100% a la fase acuosa recuperada y mezclar mediante agitación o invirtiendo muchísimo de la maser varias veces.
- Pipetear la mezcla de lisado / etanol en el cartucho de filtro, hasta 700 l a la vez.
- Centrifugar los cartuchos de 15 segundos a un máximo de 10.000 xg o aplicar vacío para pasar la mezcla a través del filtro.
- Recoger el filtrado y si la mezcla de lisado / etanol es superior a 700 l, transferir el flujo a través de un tubo nuevo y repita el procedimiento para recoger todos los filtrados. Estos filtro contiene fracciones de ARN desprovistos de ARN pequeños y se puede utilizar para recuperar estos ARN de mayor tamaño.
- Añadir 2/3 volumen de RT 100% de etanol al filtrado total y mezclar bien con un vórtex.
- Pipetear la mezcla de filtrado / etanol en un segundo cartucho de filtro. Al igual que antes de que el volumen máximo que se puede aplicar a la vez es de 700 microlitros.
- Centrifugar durante 15 segundos a 10.000 xg o aplicar vacío como se describe en el paso 5.10.
- Desechar el flujo continuo, y repetir hasta que todos mezcla de filtrado / etanol ha sido filtrada.
- aplicar 70081; l miARN solución de lavado 1 al cartucho de filtro, se centrifuga durante 5-10 segundos o aplicar vacío y deseche el flujo continuo.
- Lavar el filtro con 500 l de solución de lavado 2/3 como se hizo en el paso 5.16.
- Repetir el lavado por segunda vez con 500 l de solución de lavado como en el paso 2/3 5.16, desechar el flujo a través y colocar el filtro en el tubo de recogida.
- Girar el cartucho de filtro durante 1 min a 10.000 xg para eliminar todo el fluido residual desde el filtro.
- Transferir el cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco y aplicar 100 l de agua libre (95 ° C) nucleasa caliente para el centro del filtro.
- Girar los montajes de 20-30 segundos a la máxima velocidad para recuperar el ARN.
- Recoger el eluido y utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C.
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Representative Results
Desde exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por microscopía regular o citometría de flujo, microscopía electrónica o análisis óptico de nanopartículas tiene que ser realizada. El análisis óptico de nanopartículas tiene la ventaja sobre la microscopía electrónica que también es cuantitativa y proporciona distribución de tamaño y la concentración. El instrumento presenta un haz de láser finamente enfocada a través de un prisma de cristal en la muestra. El movimiento browniano de las vesículas aisladas se captura a través de una cámara de alta sensibilidad EMCCD y rastreado sobre una base de trama a trama. Los análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) software mide este marco movimiento browniano para enmarcar para calcular el tamaño, el modo y la distribución de las preparaciones de exosomas biliares. La figura 1 muestra el resultado de un análisis típico de NTA exosome aislado de una muestra de bilis humana.
Alternativamente, la microscopía electrónica se puede utilizarpara confirmar el tamaño de las partículas aisladas, aunque sin cuantificación. La Figura 2A muestra el resultado típico de la microscopía electrónica de transmisión para exosome aislado a partir de la bilis humana.
Para una verificación adicional de la naturaleza exosomal de las partículas aisladas, transferencias de Western de sondeo para la presencia de proteínas como Tsg101 o tetraspanin CD63, que se muestran en la Figura 2B, tienen que ser utilizados. Proteínas-exosoma específica no existen per se, pero exosomas se enriquecen en tetraspanins, especialmente CD9, CD63, CD81 y CD82 con CD63 y CD81 se hace referencia a los marcadores de exosoma como clásica, y proteínas implicadas en la formación de exosoma como TSG101 y Alix 21. Otras proteínas como la proteína de choque térmico 70 afines (Hsc70) y 73 (Hsc73), así como las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II también se pueden encontrar en los exosomas enriquecidos con algunos como Hsc73 y la protección de bi asociada a la membrana periféricaen la leche de los glóbulos grasos - factor de crecimiento epidérmico-factor 8 (Mfge8) siendo bastante específico para exosomas secretadas por las células dendríticas 21.
Figura 3 muestra las gráficas de amplificación en tiempo real típicos de una variedad de especies miARN extraídos de exosomas de la bilis humana. Dado que los exosomas, a diferencia de las células, carecen de normas fiables como 18S o 28S rRNA genes de limpieza o como GAPDH o β-actina para la normalización, el clavar con un miARN sintético es importante. Los miARN sintéticos deben derivarse de una especie diferente como cel-MIR 39 de Caenorhabditis elegans para permitir una para normalizar los niveles de expresión de manera efectiva.
Para la reproducibilidad es fundamental que la bilis se procesa tan pronto como sea posible y no debe congelarse antes de su elaboración ya que estas condiciones conducen a la degradación de miRNAs presentes en la bilis. Por otra parte, una vez aislado, exoso mes son muy estables y bastante resistente como almacenamiento a temperatura ambiente durante 48 hr o hasta tres ciclos de congelación-descongelación causan efectos insignificantes sobre los niveles de al menos dos especies de miARN, aunque la estabilidad de los genes miARN de interés tiene que ser determinado empíricamente.
Figura 1. Análisis (nanopartículas) NTA para caracterizar exosomas biliares humanos se diluyeron exosomas biliares en PBS en una proporción de 1:. 600. (A) La distribución de tamaño y concentración de los vehículos eléctricos aislados de bilis humana. El tamaño medio se determinó que era aproximadamente 97 nm para esta muestra (eje x: exosomas tamaño, eje y: exosomas de concentración para cada tamaño). (B) Muestra vista instantánea de la misma muestra analizada en A. El rango de tamaño de muestra vesículas que van desde 30-110 nm.= "_ Blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Verificación de la naturaleza exosomal de la preparación por microscopía electrónica de transmisión y transferencia de Western. (A) Transmisión microscopía electrónica (TEM) de las estructuras esféricas presentes en la bilis humana 70-110 nm de tamaño. La barra de escala es de 100 nm. (B) Análisis de transferencia Western de exosomas biliares muestra presencia de los típicos proteínas marcadoras exosome Tsg101 y CD63. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3.-PCR en tiempo real de las especies aisladas de miARN exosomas biliares. Real-tiempo de PCR de una matriz de miR demuestra la amplificación de múltiples especies de miR extraídos de exosomas humanos biliares (eje x, número de ciclos de PCR; eje-y, intensidad relativa). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para utilizar de forma fiable exosomas aisladas de la bilis, es importante emplear los métodos de aislamiento de alta calidad consistentes para obtener muestras de alta calidad a cambio. La metodología definida en este trabajo es una manera bien establecida para aislar los exosomas y miARN de la bilis humana. En él se destacan varios pasos cruciales en la caracterización de los exosomas aisladas que como mínimo deberían formar parte de microscopía electrónica de análisis óptico o de nanopartículas y transferencias de Western.
El paso más importante en el aislamiento de los exosomas, al menos en lo que respecta a la estabilidad de los genes miARN, es procesar la bilis fresca tan pronto como sea posible. El almacenamiento prolongado de la bilis todo a temperatura ambiente o incluso un solo ciclo de congelación-descongelación puede reducir significativamente el contenido de miRNA mientras que en contraste los exosomas aisladas son muy estables incluso cuando se almacenan a temperatura ambiente o sometidos a varios ciclos de congelación-descongelación. Mientras las muestras en cuestión se han almacenado a -80 ° C, el aislamiento exitoso de exosomas y miRNA de la bilis puede ser realizado con gran reproducibilidad para identificar los genes miARN firmas en las muestras. Se recomienda comenzar inicialmente con la bilis fresca para asegurar la integridad de los genes miARN adecuada. Esta es una consideración importante cuando se trata de crear una colección de muestras de bilis en el tiempo como sería el caso para las muestras de pacientes. Se le permite a uno para procesar muestras que han sido recogidas durante meses o incluso años para ser procesados y evaluados al mismo tiempo.
Esto mejora en gran medida el uso de la bilis para fines de diagnóstico, ya sea para buscar firmas de miARN que confirman la presencia de un estado de enfermedad como el cáncer o la respuesta de una enfermedad a las intervenciones terapéuticas. De hecho, los resultados de las muestras clínicas se han utilizado para establecer firmas miARN como biomarcadores para colangiocarcinoma 19.
La primera etapa de centrifugación elimina las células intactas que están presentes en la bilis. En el segundo, una velocidad más alta de células centrifugación debris, cuerpos apoptóticos y otros orgánulos más grandes se sedimentan. Para asegurarse de que sólo las partículas más pequeñas de 200 nm se recogen en la etapa de ultracentrifugación, la etapa de filtración con una proteína bajo filtro de unión es importante. Algunos protocolos omiten este paso, pero creemos que es necesario. Después de la ultracentrifugación a 120.000 xg el precipitado obtenido contiene exosomas bastante puros que pueden ser procesados ya sea inmediatamente o después de la resuspensión en PBS ser almacenado a -80 ° C. Una limitación de este método es que el sedimento obtenido solamente es altamente enriquecido en exosomas, pero esto es cierto para otros métodos de enriquecimiento, tales como exclusión de tamaño y precipitación polimérico. El procesamiento adicional puede implicar otra etapa de purificación por gradiente de sacarosa o la unión a perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo. Si la fuente de los exosomas (como por ejemplo plasma) contiene precipitados como resultado de la coagulación, esta purificación adicional puede ser necesario ya que estas partículas a menudo pueden tener el tamaño de los exosomas.En particular, la inmuno-purificación conduce a una preparación enriquecida marcador más exosoma. La desventaja es que esto reduce adicionalmente la cantidad de exosomas y / o miRNA presente, y para la mayoría de los propósitos no justifica el tiempo y el proceso que consume recursos. Si, sin embargo, el análisis de transferencia Western detecta la presencia de contaminación de microsomas a través de una proteína del retículo endoplásmico, como calnexina, purificación adicional, en particular de inmuno-aislamiento basado, se aconseja. En nuestra experiencia, esto es raramente el caso de la bilis, si uno utiliza otras fuentes de fluidos biológicos se recomendará una etapa de purificación de base inmunológica.
El uso de ultracentrifugación diferencial para aislar y enriquecer exosomas de líquido biliar es un método relativamente rápido y rentable. A pesar de que requiere el uso de una ultracentrífuga, preferiblemente con un rotor de oscilación cubo, estos dispositivos se encuentran comúnmente en muchas instituciones. La purificación adicional a través de centrifugación de densidad son posible con el mismo equipo y los tubos son varias veces reutilizables después de la limpieza y esterilización. Si bien la precipitación a base de polímero sólo requiere el uso de microcentrífugas o centrífugas estándar para sedimentar los precipitados a la velocidad de 10.000 xg o menos, por lo general, co-aísla contaminantes no vesiculares incluyendo lipoproteínas. Mientras que las lipoproteínas no están generalmente presentes en la bilis, el coste de los polímeros a menudo propietarias y patentadas hacer el aislamiento caro en comparación. Los polímeros también son a veces incompatibles con las aplicaciones posteriores tales como la espectrometría de masas, pero cuando el análisis de aguas abajo es compatible con el polímero (ARN o proteína aislada), el método es fácil, rápido y no requiere un equipo específico.
cromatografía de exclusión por tamaño tiene la desventaja de tiempos de funcionamiento largos y el requerimiento de equipo especial, pero permite la separación precisa de partículas grandes y pequeñas. purificación por inmunoafinidad da la más alta purity de las vesículas exosomal e incluso permite el aislamiento de fracciones exosomal específicos, tales como derivados del epitelio, pero esto viene a costa de rendimiento total. Además, se limita a los volúmenes de muestras pequeñas que requieren una primera etapa de enriquecimiento si un gran volumen se va a procesar y los exosomas aislado puede perder actividad funcional o exhibir la función biológica alterada debido a los anticuerpos unidos.
Es importante tener en cuenta la aplicación de aguas abajo (s) y la disponibilidad de equipo especializado cuando se trata de el aislamiento de exosomas. La caracterización de las partículas aisladas / enriquecidos es importante independientemente del método de aislamiento utilizado. Ultracentrifugación ha sido hasta ahora un "patrón oro" utilizado por muchos laboratorios debido a su robusta y rápido (y rentable si una ultracentrífuga está disponible) el enriquecimiento de partículas exosomal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
