Abstract
son üç yılda exosome araştırma büyük ölçüde biyomarkerların ve bunların terapötik kullanımları tanımlanması ve karakterizasyonu doğru kapsamını genişletmiştir.
Eksozomlar en son microRNA (MIRS) içerdiği gösterilmiştir. MIRS kendileri tanısal amaçlı değerli biyomarkerların olarak ortaya çıkmıştır. klinik ve hastanelerde numune toplama oldukça değişken olduğundan, tüm safra gelen miRNA izolasyon önemli ölçüde değişir. basit bir şekilde toplanan safra örnekleri, sağlam, güvenilir ve tekrar MiRNA profilleri elde etmek için izole etmek ve safradan eksozomlar karakterize etmek için yüksek kaliteli bir protokolünün geliştirilmesi gerekmektedir. yöntem, birkaç santrüfüj ve izole eksozomlar pelet nihai ultrasantrifügasyon adım bir filtre etme adımı gerektirir. Elektron mikroskobu, Western blot, flow sitometri ve çok parametreli nanoparçacık optik analiz, mevcut, e kalitesini doğrulamak için çok önemli karakterizasyon adımlardırxosomes. Örneğin Caenorhabditis elegans gibi bir türden gelen bir spesifik olmayan sentetik miRNA'nın ile lisat spike bu eksozom Mirna izolasyonu için, Cel-miR-39, RNA ekstraksiyon verimi normalleştirilmesi için önemlidir. Bu yöntem aşağıdaki safra sıvısından eksozom izolasyonu başarılı MiRNA -80 ° C'de birkaç yıl boyunca saklanabilir safra örnekleri profil sağlar.
Introduction
Diğer biyolojik yani sıvıların, anne sütü, plazma veya idrar gibi, safra ekzozomlar, lipit zengin veziküller 1-4 içerir. Eksozomlar neden veya alıcı hücreler 5, 6, normal fonksiyon 4, 7-9 bir parçası olabilir, hücre-hücre iletişiminin bir biçimde biyolojik fonksiyonları değiştirebilir. Eksozomlar tanı 10 biyomarkerların değerli bir kaynak sağlayabilir miRNA türlerini içerebilir. miRNA'lar profilleri hastalıkların 11-14 çeşitli tanısal ve prognostik belirteç olarak son yıllarda önemli önem kazanmıştır.
miRNA kendisi biyolojik sıvılarda, muhtemelen ölü hücrelerden salınan ve döken hücrelerin miktarı büyük ölçüde altta yatan hastalığa etkilemiş olabilir bulunabilir. Eksozom miRNA profili mutlaka kaynak hücresine 6, 10, 15-17 miRNA profili yansıtmaz, henüz ekzozomlar ebeveyn ce için karakteristik olabilir miRNA imzaları taşıyabilirBir tümör hücresi gibi olacağım. Tümör kaynaklı eksozomlar, akciğer adenokarsinom, prostat kanseri ve diğer tümörlerin 8, 16, 18 olan hastaların plazmasında belirlenmiştir.
Bu yöntemin amacı, onların önceki kullanım prosedürleri büyük ölçüde bağımsız insan safra örneklerinden gelen eksozomlann güvenilir ve sağlam izolasyon olduğunu. Böyle kolanjiokarsinomlar 19 olarak safra kanalının hastalıkların potansiyel tanısı için miRNA güvenilir bir kaynak olarak safra kullanmak için geliştirilmiştir. Bu eksozomlar izole etmek hızları artan santrifüj birkaç aşamadan oluşmaktadır ve diğer biyolojik sıvılarda uygulanabilir olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
endoskopik retrograd kolanjiopankreatografi ile hastaların safra elde edilmesi (ERCP) Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından bir insan denekler çalışma protokolünün onaylanması gerekiyor. Burada sunulan tüm çalışmalar Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı.
Bile 1. Exosome İzolasyon
- endoskopik retrograd kolanjiyopankreatografi (ERCP) gerçekleştirin. yatar pozisyonda hastayı ve entübe.
- Hastanın ağız yoluyla bir duodenoskop Pass ve duodenum ikinci bölümü takın ve büyük papilla belirlemek.
- Seçici bir üçlü lümen 0.035 inç (0.9 mm) hidrofil kılavuz tel ile önceden yüklenmiş sfinkterotom takarak koledok cannulate.
- vesileyle sağ hepatik kanalından kistik kanal ayırt etmek zor olabilir çünkü sol hepatik kanala floroskopi altında kılavuz teli ilerletmek, daha sonra ilerlemekistikrarlı bir pozisyon elde etmek için safra kanalına 5 cm sfinkterotom.
- Luer kilidi sayesinde kılavuz tel bağlantı noktasına 10 ml şırınga takmak, kılavuz teli çıkarın ve negatif basınç 10 ml kullanılarak safra aspire.
- Kılavuz teli reinserting ve safra yolları opaklaşmaz için enjeksiyon portu üzerinden kontrast madde enjekte edilerek ERCP ile devam etmek safra içeren şırınga çıkarın.
- buz üzerinde 15 ml tüp içine toplanmış safra aktarın ve santrifüj adımla devam hazır olana kadar buz üzerinde tutmak.
Dikkat: Kendinizi ve örnekleri korumak için eldiven giyin! o Hepatit A virüs partikülleri içerebilir olarak potansiyel infeksiyon kaynağı olarak safra davranın! - buz üzerinde örnek (ler) tutun. Her iki durumda da, 10 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'de adım 1.2 veya santrifüj ile devam etmek ve daha sonra kullanılana kadar -80 ° C'de dondurun.
Not: birkaç yıl bu şekilde depolanmış numuneler rutin iyi sonuçlar 19 kullanılmıştır. - mikrosantrifüj tüpü içine transferi safra 400 ul ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler ve hücre artıkları toplar.
- , Pipetleme süpernatantı taze mikrosantrifüj tüpüne transfer ve daha fazla kalıntı yüzey maddesi temizlemek için 4 ° C'de 20 dakika daha 16,500 x g hızında örnek (ler) santrifüj. biohazard atık tüpleri atın. Alternatif olarak, yerine ultrasantrifüjdeki örnekleri dönerler.
- Süpernatant toplayın ve sol nm 200 daha büyük herhangi bir parçacıkları çıkarmak için bağlayıcı iyi akış hızı ve düşük protein olan 0.2 mikron polyethersulfone (PES) membran filtreden bir şırınga ile bir biyogüvenlik kabini filtre.
- Pipet süzülmüş süpernatant tüpleri ultrasantrifüjdeki ve tüpler fazla 2/3 tam böylece PBS ekleyin. Tüpler daha az likit içeriyorsa, tüpler santrifüj sırasında çökecek! Tüpler, yıkandı, otoklavlanmış ve birkaç kez tekrar edilebilir.
- pellve 4 ° C'de 70 dakika boyunca 120,000 x g'de ultrasantrifugasyon ile eksozomlar. bazen küçük sarı topaklar görmek için ultrasantrifüjdeki tüpün dibinde santrifüj bakmak sonra; Bu eksozomlar bulunmaktadır.
- dikkatli bir şekilde boşaltma yoluyla süpernatan atılır ve% 10 v / v nihai bir konsantrasyona kadar ağartıcı ekleyerek atık dezenfekte ve 20 dakika boyunca bekletildi.
- Alt deneyler için, ya da uygun bir çözelti küçük bir hacme pelet (lar) işleme (örneğin, radyoimmunopresipitasyon analizi (RIPA) Protein izolasyonu, mıR izolasyonu için RNA liziz tamponu için tampon A) ya da fosfat 50-150 ul içinde tekrar süspansiyon tamponlu ya TEM veya nanopartikül optik analizle eksozom hazırlama karakterizasyonu için -80 ileride kullanmak üzere ° C (kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ya da protein çıkarımı vs.) depolanabilir veya kullanılabilir tuz (PBS) .
tarafından 2. Exosome KimlikTransmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) ya da cryoEM
- pipetleme PBS 100 ul dışı kesecikler süspanse. İlk kez izole performans özellikle İdeal olarak, -20 ° C'de saklandı veya edilmemiş -80 ° C eksozomlar kullanımı.
- 2 dakika boyunca 400 meş karbon kaplı Parlodion bakır ızgaralar için 20 ul bir kısım (yaklaşık olarak 2 ug) adsorbe oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- kurutuldu hazırlanması dikkatle damla yerleştirerek oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 1 (h / h), glutaraldehid (EM dereceli) 'de eksozom düzeltildi.
- 5 dakika boyunca iki kez su ile ızgaralar yıkayın ve daha sonra 30 saniye boyunca% 1 fosfotungstik asit (PTA) boyanan EVs kontrast.
- 80 kilovolt bir ivme gerilimi 20,000X büyütmelerde başlayan ve parçacıkların boyutu belirlenirken 100,000X için artan bir elektron mikroskobu ile görüntü kazanır.
Not: Diğer preparatlarıyla Formvar karbon kaplı 200 örgü bakır veya nikel ızgaraları ve kontrast boyama li üzerine katman gibi10-15 dakika ke% 1 veya% 2 uranil asetat da mümkündür. - (: 3 oranında 1) cryoEM için, 60 ul protein G altın 10 nm ile 20 | il bir kısım (yaklaşık olarak 2 ug) karıştırılır. Bu exosome çapını belirlemek için yardımcı olacaktır.
- Glow-deşarj C-düz holey karbon ızgaraları üzerine örnekleri aktarın ve blot fazla sıvıyı çıkarın. sıvı etan içine hemen onları batırarak ızgaraları dondurun.
- Sıvı azot içinde cryoholder ızgaraları monte edin.
- 20,000X ve 100,000X büyütmelerde 200 kV görüntü kazanır.
Çok parametreli Nanoparçacık Optik analizi ile 3. Exosome Kimlik
- pipetleme PBS 100 ul izole eksozomlar süspanse.
- çeşitli oranlarda 600 ul PBS içinde eksozomlar sulandırınız (benzeri 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 ile 1: 1,200).
- üreticilerinin göre, gerçek zamanlı olarak uygun bir araç ve yazılım ile lazer ışını tarama ile eksozomlar görselleştirmeRER protokol 20.
- parçacıklar görünür hale gelene kadar sonra parçacıklar düzgün görünmesi için odağı ayarlamak, çekim modunda kameranın düzeyini artırmak.
- standart modda, parçacıklar hala görülebilmektedir en düşük seviyesine kamerayı azaltmak iken gerekli kamera deklanşörü ve kazanç ayarlamak durumunda, bunu başarmak için.
- Görme üniteyi temizlemek ve PBS seyreltme ayarlamak değilse, 20-100 parçacıklar ekranda görünür olduğundan emin olmak için kontrol edin.
- Ardından 30-60 arası sn yakalama süresini ayarlayın. Video çekildikten sonra, tüm partiküller ekranda tanımlanır kadar işleme parametrelerini ayarlamak ve video dosyasını işlemek.
Western Blot tarafından 4. Exosome Karakterizasyonu
- buz soğukluğunda Radyoimmunopresipitasyon tahlilinde 100 ul safra 2-5 mi den Lyse eksozom peletleri (RIPA) pipetleme bir proteaz inhibitörü ile tampon ve aşağı doğru tamamen ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın lizatlarıBir girdap üzerinde etkili bir proteinleri çözünür.
- çoğu zaman gerekli olmasa da, tam parçalama sağlamak için 10 saniye, her 2 darbeleri ile buz üzerinde numunelerin darbe sonikasyon kullanın.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de 15,000 x g'de santrifüj ile çözünmeyen malzemenin pelet ve temiz bir tüp süpernatantı aktarın.
- Tercih edilen bir yöntem, üreticinin protokolüne uygun olarak (yani, bisinkoninik asit (BCA) Coomassie, modifiye edilmiş Lowry, 660 nm Protein Deneyi, vs.) protein konsantrasyonunu belirleyin. aynı yöntem kullanılır deneyde mukayese edilebilir sonuçlar elde etmek için sürekli olarak kullanıldığı gibi bir yöntem sürece önemli değildir.
- elektroforezi (PAGE) bir poliakrilamit jel kuyuya 5 dakika boyunca 95 ° C 'de örnek ısıtılmasından sonra yükleme Laemmli tamponu içinde örnek başına proteinin 50 ug.
- 1.5 saat PAGE jelleri üzerinde örnekleri Electrophorese bir naylon zara ayrılmıştır proteinleri aktarın.
- Bdaha sonra bir seyreltmede anti-CD63 ve anti-TSG-101 gibi bir eksozom özgü antikorlar ile inkübe 1 saat süre ile% 0.1 Tween 20 (TBS-T) Tris-tamponlu tuzlu su içinde% 5 yağsız süt ile membran (lar) kilidi 1: 500, tercihen O / N 4 ° C'de.
- TBS-T 3 x 10 dk membranları yıkamak, sonra oda sıcaklığında 1-2 saat TBS-T içinde% 5 yağsız süt içinde HRP-konjüge edilmiş ikincil antikor eşleşen uygun olan inkübe edin.
- membran (lar) TBS-T ile 3 x 5 dk yıkayın ve üreticinin protokolüne uygun olarak kemilüminesans reaktifleri ile spesifik proteinlerin algılar.
- Resim film veya üreticinin protokolüne göre bir dijital görüntüleme sistemi ile membranlar.
İzole eksozomlar 5. mikroRNA İzolasyon
Not: Safra eksozom gelen miRNA'nın izolasyonu piyasada mevcut olan kit göre bir tadil edilmiş MiRNA izolasyon kullanılarak gerçekleştirilir, ancak herhangi bir başka RNA izolasyon yöntemi kullanılabilir veya adapte edilebilir.
- Ekle 300# 181; l lizis / (400 ul safra izole) exosome pelet, girdap, pipet veya tamamen homojen bir lizat elde etmek eksozomlar lyse bir iğne / şırınga geçmek bina tampon.
- miRNA Homojenat Katkılı 1/10 (30 ul) hacim ekleyin ve karıştırın veya tüp birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın.
- Buz üzerinde 10 dakika süre ile bir karışım inkübe edin.
- asit fenol hacmi ekleyin: Initial Homojenat (300 ul) ile eşit kloroform.
- 30-60 saniye için 5 5 fmol / ul Cel-miR 39 ul ve vorteks ekleyin.
- 10.000 RT, sulu (üst) ayırmak için en xg ve organik (alt) fazlar, 5 dakika boyunca santrifüj.
- transfer hacmi belirterek ederken dikkatli yeni bir tüp pipetle ve transferi ile üst faz aspire. uygun bir organik çöp bidonuna organik faz atın.
- küçük RNA iyice TU vorteks veya çevrilmesi ile geri kazanılan sulu faza 1/3 hacim% 100 etanol eklenir ve karıştırılır zenginleştirmek içinbirkaç kez.
- Pipetleyin bir seferde 700 ul filtre kartuşunun üzerine lizat / etanol karışımı.
- 10,000 x maksimum 15 saniye kartuşları santrifüj veya filtre ile karışımı geçmek vakum uygulayın.
- süzüntü toplamak ve lizat / etanol karışımı 700 ul aşarsa, yeni bir tüp akış yoluyla aktarmak ve tüm süzüntüler toplamak için işlemi tekrarlayın. Bu filtre, küçük RNA'ların yoksun RNA fraksiyonları içeren ve bu büyük RNA'ların kurtarmak için kullanılabilir.
- Toplam süzüntüye RT% 100 etanol 2/3 hacim ekleyin ve vorteks ile iyice karıştırın.
- Pipet ikinci bir filtre kartuşu üzerine filtre ürünü / etanol karışımı. seferde uygulanabilecek maksimum hacim 700 ul gibi önce.
- 10.000 x g'de 15 saniye santrifüj veya adım 5.10 açıklandığı gibi vakum uygulamak.
- akış oranı atın ve filtrelendi süzülen madde / etanol karışımı tüm kadar yineleyin.
- 700 uygula81; filtre kartuşu l miRNA Yıkama Çözeltisi 1, 5-10 sn veya vakum uygulanır ve flow-through atmak için santrifüj.
- Adım 5.16 yapıldığı gibi 500 ul yıkama solüsyonu 2/3 ile filtre yıkayın.
- Adım 5.16 gibi yıkama yıkama solüsyonu 2/3 500 ul ile ikinci kez tekrarlayın flow-through atın ve geri toplama tüpünün filtreyi yerleştirin.
- Filtreden kalan tüm sıvıyı almak için 10,000 x g'de 1 dakika için filtre kartuşunu dönerler.
- taze toplama tüpünün içine filtre kartuşunu aktarın ve filtrenin merkezine sıcak (95 ° C) nükleaz serbest su 100 ul geçerlidir.
- RNA kurtarmak için maksimum hızda 20-30 saniye derlemeler Spin.
- eluat toplayın ve hemen kullanın veya -80 ° C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
eksozomlar normal mikroskobu ile tespit ya da akış sitometrisi için çok küçük olduğu için, elektron mikroskopisi ya da optik nanopartikül analizi gerçekleştirilmelidir. nanoparçacık optik analizi, aynı zamanda niceliksel ve boyutu dağılımına ve konsantrasyonu sağlar elektron mikroskobu üzerinde bir avantaja sahiptir. alet numune içine cam prizmadan ince odaklanmış lazer ışını tanıttı. İzole veziküllerin Brown hareketi bir EMCCD yüksek hassasiyet kamera ile çekilen ve bir kare-kare bazında izlenir. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) yazılım tedbirler bu Brown hareketi çerçeve. Boyut, mod ve safra exosome hazırlıkları dağılımını hesaplamak için çerçeve 1 insan safra örneğinden izole eksozomla tipik NTA analizinin sonucunu göstermektedir Şekil.
Alternatif olarak, elektron mikroskopisi kullanılabilirŞekil 2A insan safra izole eksozomla için transmisyon elektron mikroskobu tipik sonucunu göstermektedir olmadan miktar. olsa izole parçacıkların boyutu, onaylamak için.
Izole edilmiş parçacıklar exosomal yapısını daha doğrulaması için Şekil 2B'de gösterildiği Tsg101 benzeri veya CD63 tetraspanin proteinlerin varlığı için tarama Western blotlar, kullanılmalıdır. Exosome-spesifik proteinler başına yoktur, ama ekzozomlar TSG101 ve Alix 21 gibi exosome oluşumunda rol oynayan klasik eksozom belirteçleri ve proteinler sevk CD63 ve CD81 ile tetraspanins, özellikle BS9, CD63, CD81 ve CD82 olarak zenginleştirilmiştir. Diğer ısı şok proteini kognatı 70 (HSC70) ve 73 (Hsc73) gibi proteinler, yanı sıra büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) sınıf II molekülleri de Hsc73 ve periferik membran bağlantılı prote gibi bazı eksozomlarla zenginleştirilmiş bulundu edilebilirdendritik hücreler 21 salgılanan Eksozomlann için oldukça spesifik olan epidermal büyüme faktörü-faktör 8 (Mfge8) - süt yağı küreden içinde.
Şekil 3, insan safra eksozom elde MiRNA türlerin çeşitli tipik gerçek zamanlı amplifikasyon çizimini gösterir. Eksozomlann yana, hücrelerin aksine, 18S veya 28S rRNA veya normalleşmesi için GAPDH veya β-aktin gibi temizlik genler gibi güvenilir standartlar eksikliği, sentetik miRNA ile spike önemlidir. Sentetik miRNA etkin bir ifade seviyelerini normale döndürmek için bir sağlamak için Caenorhabditis elegans gelen cel-miR 39 gibi farklı türlerden elde edilen edilmelidir.
yeniden üretilebilirlik için safra en kısa sürede ve işlenmiş bu koşullar safra içinde mevcut miRNA'ların bozulmasına neden olarak işlemden önce dondurulur kritiktir. Öte yandan, bir kez exoso izole Çevrede miRNA kararlılık ampirik bir şekilde tespit edilmesi gerekir, ancak MES, kararlı ve dondurma-çözme çevrimi miRNA'nın en az iki türün seviyeleri üzerinde ihmal edilebilir etkilere neden 48 saat boyunca ya da üç kadar oda sıcaklığında depolama oldukça dirençlidir.
Şekil 1. (Nanopartikül) NTA analizi, insan safra eksozomlar karakterize etmek için safra eksozomlar 1 oranında PBS içinde seyreltilmiştir. 600. Insan safra izole EVs (A) boyut dağılımı ve konsantrasyon. (X-ekseni: boyutu, y-ekseni ekzozomlar: her boyut için konsantrasyon eksozomlar) ortalama büyüklüğü bu örnek için yaklaşık 97 nm olarak belirlenmiştir. A. boyutu aralığı analiz aynı örnek (B) Örnek ek atış 30-110 nm arasında değişen veziküller gösterir.= "_ Blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Boyutunda insan safra 70-110 nm İletim elektron mikroskobu ve Western Blot. (A) Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), mevcut küresel yapıların tarafından hazırlık exosomal doğanın Şekil 2. doğrulanması. Ölçek çubuğu 100 nm'dir. (B), safra Eksozomlann Western blot analizi tipik exosome işaretleyici proteinleri TSG101 ve CD63 varlığını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Safra Eksozomlann izole miRNA türlerinin Şekil 3. Real-time PCR. Gerçek-zaman bir mıR dizinin PCR insan safra Eksozomlann (x ekseni, PCR döngüsü sayısı, y-ekseni, nispi yoğunluk) çıkarılan çok sayıda miR türlerinin amplifikasyonu gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
güvenilir safra izole eksozomlar yararlanmak için, karşılığında yüksek kaliteli örnekleri elde etmek için tutarlı, yüksek kaliteli izolasyon yöntemleri kullanılması önemlidir. Bu yazıda tanımlanan metodoloji, insan safra gelen eksozomlar ve miRNA izole etmek köklü bir yoldur. Bu en azından elektron mikroskobu ya da nanoparçacık optik analiz ve Western lekeleri içermelidir izole Eksozomlann karakterizasyonu birkaç önemli adımlar vurgulamaktadır.
o miRNA istikrar geldiğinde Eksozomlann izolasyonunda en önemli adım, en azından, en kısa sürede taze safra işlemektir. Oda sıcaklığında veya birkaç dondurma-eritme çevrimleri geçiren depolandıklarında aksine izole eksozomlar çok kararlı ise, oda sıcaklığında bütün bir safra hatta tek bir dondurma-eritme döngüsü uzun süreli depolama anlamlı MiRNA içeriğini azaltabilir. Sürece Söz konusu numuneler -80 ° C, Eksozomlann ve miR başarılı izolasyon saklanan edilmiş olaraksafra NA örneklerinde miRNA imzalarını tespit etmek büyük bir tekrarlanabilirlik ile yapılabilir. Başlangıçta uygun miRNA bütünlüğünü sağlamak için taze safra ile başlamak tavsiye edilir. Bu hasta numuneleri için durumda olacağını zamanla safra örneklerinin bir koleksiyon oluşturmak için çalışırken önemli bir husustur. Aynı anda işlenir ve değerlendirilmek üzere aylarca hatta yıllarca üzerinde toplanmıştır örnekleri işlemek için bir olanak sağlar.
Bu büyük kanser gibi bir hastalık durumunun varlığını veya terapötik müdahaleler bir hastalığın yanıtı teyit miRNA imzalar bakmak için ya tanısal amaçlı safra kullanımını artırır. Aslında, klinik örneklerde elde edilen sonuçlar, kolanjiyokarsinom 19 için biyolojik olarak MiRNA imza oluşturmak için kullanılmıştır.
İlk santrifüj adımı safra mevcut bozulmamış hücrelerini temizler. İkinci olarak, yüksek hızda santrifüj hücresi debris, apoptotik organları ve diğer büyük organelleri pelet. Sadece daha küçük 200 nm ultrasantrifüj aşamasından sonra toplanır parçacıklar sağlamak için, düşük protein filtre bağlayıcı filtreleme adımı önemlidir. Bazı protokoller bu adımı atlarsanız, ama biz gerekli olduğunu düşünüyorum. 120,000 x g'de ultrasantrifugasyon sonra, elde edilen topak -80 ° C'de saklanabilir PBS içinde hemen veya yeniden süspansiyon işleminden sonra işlenebilir ya derecede saf eksozomlar içerir. Bu yöntemin bir sınırlaması elde edilen topak, sadece yüksek eksozom içinde zenginleştirilmiş olan, ancak bu, boyut dışlama ve polimerik çökeltme gibi diğer zenginleştirme yöntemleri için geçerli olmasıdır. Daha ileri işlenişi sakroz gradyanı veya antikor kaplı manyetik boncuklar bağlanarak bir saflaştırma adımı gelmesine yol açabilir. eksozomlann kaynağı (benzeri gibi örneğin plazma için) pıhtılaşma sonucu çökeltiler içeriyorsa, bu partiküller, genellikle eksozomlann boyutuna sahip olabilir, bu ilave saflaştırma gerekli olabilir.Özellikle, bağışıklık saflaştırma daha eksozom markör zenginleştirilmiş hazırlanmasına yol açmaktadır. Dezavantajı bu daha da eksozom ve / veya miRNA mevcut miktarını azaltır ve çoğu amaç için zaman ve kaynak tüketen süreci haklı olmamasıdır. Bununla birlikte, Western blot analizi göre, özellikle immüno-izole gibi calnexin, bir daha arıtılmadan olarak endoplazmik retikulum proteini ile mikrozom kontaminasyon varlığını tespit ederse, tavsiye edilir. biri bir bağışıklık tabanlı arıtma adımı tavsiye edilebilir biyolojik sıvılarda diğer kaynaklardan kullanıyorsa bizim deneyim bu, nadiren safra için geçerlidir.
Safra sıvısından eksozomlar izole etmek ve ettirecek ayırıcı ultra-santrifüj kullanımı nispeten hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Bu, bir ultra santrifüj kullanılmasını gerektirir ise, tercihen bir sallanan kepçeli rotor, bu cihazlar genellikle birçok merkezde bulunmaktadır. yoğunluk santrifüj ile de arıtılması possibl olanAynı ekipman ve tüpler e temizlik ve sterilizasyon sonrası yeniden kullanılabilir birkaç kez bulunmaktadır. polimer esaslı yağış 10,000 x veya daha az hızında çökeltileri pelet mikrosantrifüjler veya standart santrifüjler sadece kullanımını gerektirir, ancak genellikle lipoproteinler de dahil olmak üzere olmayan veziküler kirletici ortak ayırır. lipoproteinler safra genellikle mevcut olmasa da, sık sık özel ve patentli polimerlerin maliyeti karşılaştırıldığında izolasyon pahalı hale. polimerler, örneğin kütle spektrometrisi gibi alt uygulamalarla zaman uyumsuz fakat alt baş analizi polimer (RNA veya protein izolasyon) uyumlu olduğunda, yöntem, hızlı, kolay ve özel ekipman gerektirmez.
Ebat eksklüzyon kromatografı uzun çalışma sürelerinde olumsuz ve özel ekipman gereksinim vardır, ancak büyük ve küçük partiküller hassas ayrılmasını sağlar. Immün afinite temizliği en purit verirHatta exosomal veziküller ve y gibi türetilmiş epitel gibi belirli exosomal fraksiyonları izolasyonunu sağlar, ancak bu toplam verim pahasına geliyor. büyük hacimli işlenecek olan ve izole edilmiş eksozomlar nedeniyle bağlanan antikorların fonksiyonel aktivitesi kaybeder ya da değiştirilmiş biyolojik fonksiyonunu sergileyebilir Dahası, birinci zenginleştirme adımı gerektiren küçük örnek hacimlerinin sınırlıdır.
O Eksozomlann izolasyonu geldiğinde aşağı uygulama (lar) ve özel ekipman durumu dikkate almak önemlidir. izole edilmiş / zenginleştirilmiş partiküllerin karakterizasyonu, kullanılan izolasyon yönteminin önemlidir. Ultrasantrifügasyon bugüne kadar dolayı exosomal parçacıkların sağlam ve hızlı (ve maliyet-etkin bir ultrasantrifüjdeki varsa) zenginleştirme birçok laboratuvarlar tarafından kullanılan bir "altın standart" olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
