Summary
מודל גידול ראשוני orthotopic סרטן השד סר כירורגית של גידול ראשוני כדי להאריך את חיי עכבר כדי ליצור גרורות ספונטניות מתוארים. גידול הגידול ולהתפתחותו מנוטר לכמת ידי דימות פלואורסצנטי בלוציפראז.
Abstract
גרורה היא הגורם העיקרי לתמותה של חולות סרטן השד. המנגנון שבבסיס גרור של תאים סרטניים, כולל גרורות סרטן השד, הוא ידוע בעיקר ומהווה מוקד בחקר הסרטן. שוני סרטן השד הוקמו ספונטניים במודלים של עכברים גרורים. כאן אנו מדווחים על הליך פשוט להקים גידול ראשוני מושתל orthotopic סרטן השד כתוצאת גרורות ספונטניות מחקי גרורות סרטן השד אנושיים. בשילוב עם הדמיה לחיות גידול פליטת אור, במודל עכבר זה מאפשר את התפתחות הגידול קינטיקה התקדמות להיות פיקוח לכמת. במודל זה, מינון נמוך (1 x 10 4 תאים) של תאים סרטניים בשד 4T1-לוק הוזרק כרית שומן חלב עכבר BALB / ג באמצעות מזרק טוברקולין. עכברים הוזרקו luciferin הדמיה בנקודות זמן שונות באמצעות מערכת הדמיה bioluminescent. כאשר הגידולים הראשוניים גדלו עד קצה גבול היכולת הגודל כמו בפרוטוקול שאושר IACUC (approximately 30 ימים), העכברים היו מורדמים תחת זרם בלתי פוסק של isoflurane וחמצן 2%. אזור הגידול מעוקר עם 70% אתנול. עור העכבר סביב הגידול נכרת לחשוף את הגידול שהוסר עם זוג מספרי סטרילית. הסרת הגידול הראשוני מרחיבה את ההישרדות של העכברים 4T-1 גידול הנושא למשך חודש ימים. העכברים אז הם צילמו שוב ושוב עבור גידול גרורתי התפשטות לאיברים מרוחקים. סוכנים טיפוליים יכולים להינתן דיכוי גרור של גידולים בשלב זה. מודל זה הוא פשוט עדיין רגיש בכימות צמיחת תאי סרטן שד האתר הראשי קינטיקה התקדמות לאיברים מרוחקים, ובכך הוא מודל מצוין לחקר גידול סרטן השד והתקדמות, ולבדיקת סוכנים טיפוליים אנטי גרור ואת חיסוני in vivo .
Introduction
על פי האגודה האמריקנית לסרטן, סרטן השד הוא הצורה המאובחנת בתדירות הגבוהה ביותר של הסרטן אצל נשים בארצות הברית. גילוי מוקדם בשילוב עם טיפולים ממוקדים שפותחו לאחרונה צמצם באופן משמעותי את התמותה מסרטן השד בשני העשורים האחרונים. עם זאת, סרטן השד הוא עדיין הגורם המוביל השני למוות מסרטן בקרב נשים בארצות הברית 1. רוב מקרי המוות של חולי סרטן שד מתקיימות בשל גרורות תאים סרטניים. למרבה הצער, רוב סרטן השד הוא פולשני גרור לעתים קרובות את הלימפה ובהמשך לאיברים מרוחקים, כוללים עצם, ריאות, בכבד ובמוח. 1,2 אין כרגע טיפול יעיל לסרטן שד גרורתי. לכן, פיתוח של תרופות כימותרפיות לבין חיסוני לדכא סרטן שד גרורתי הוא בעל משמעות רבה.
מודלי עכבר גרור ספונטני שונה סרטן השד been פותח כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התקדמות תא שד גידול וגרור וכדי לשמש כמודלים לפיתוח של תרופות. 1,3-5 עם זאת, רוב דגמי עכבר אלה דגמי גידול גנטיים, בעוד מודלים מצוינים מכניסטית מחקרים, אינם מתאימים לבדיקת סוכני טיפולית מאז גרורות לוקח חודשים כדי לפתח מודלים גנטיים אלה, ובכך הדורשים שימוש ארוך יותר יקר של תרופות אנטי-סרטניות. 6,7 ניטור התקדמות הגידול בעכברים חיים הוא גם מאתגר מבחינה טכנית. לעומת זאת, מודל גרורות סרטן שד מושתל יש את היתרונות של התקדמות גידול בטווח קצרה מעקב קל של התקדמות גידול בעכברים חיים. 4T1 במודל עכבר הגרורות ספונטניות orthotopic סרטן השד הוא מודל גידול כגון מושתלים. 8 במודל זה, התאים הסרטניים בשד מושתלים לתוך כרית שומן החלב להקים גושי גידול ראשוניים. הגידול הראשונילאחר מכן ניתן להסיר בניתוח כמו חולי סרטן אנושיים השד. 4T1 תאים סרטניים הם מאוד פולשני. 8,9, 3,10 כמעט כל גידול נושאות עכברים לפתח גרורות ב -30 ימים לאחר השתלת גידול לתוך כרית שומן החלב. עם זאת, גידולי 4T1 לגדול באגרסיביויות האתרים העיקריים ואת גדלי הגידול לעתים קרובות עולים על המגבלות שמורשות ברוב הפרוטוקולים חיים. בשלב זה, הגרורות הן לעתים קרובות micrometastases. לכן, זה הכרחי כדי להסיר גידולים ראשוניים כדי לאפשר התקדמות גרורה לבדיקת סוכנים טיפוליים. כאן אנו מדווחים על הקמת הליך פשוט ועם זאת רגיש של השתלת הגידול הראשוני, הסרה כירורגית של הגידול הראשוני וכימות מבוססי הדמיה פליטת אור של צמיחת הגידול 4T1 והתקדמות in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים עומדים בכללים ופרוטוקולים אושרו על ידי ג'ורג'יה העוצר אונ' Animal שימוש וטיפול ועדה.
1. הקמת הגידול בסרטן השד Orthotopic
- יום אחד לפני הניסוי, תרבות כ 2 x 10 תאים 6 4T1-לוק הגידול בצלחת תרבות 10 ס"מ 10 מ"ל בינוני RPMI המכיל 10% FBS. דגירת תרבות הצלחת בתוך CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- ביום הזרקת תאים סרטניים, להסיר בינוני תרבות מצלחת התרבות עם ואקום, להוסיף 5 מ"ל בופר פוספט סטרילית (PBS), pH 7.4 כדי בצלחת תרבות, ובעדינות לנער את צלחת לשטוף את המשטח תרבות, להסיר את PBS על ידי ואקום.
- הוסף 2 מ"ל טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין 0.53 mM EDTA) כדי בצלחת תרבות, דגירה אותו ב CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ -5 דקות. בדקו תאים על מיקרוסקופ הפוכה כדי לוודא כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של מנת התרבות. </ Li>
- להרוות את טריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל בינוני סרום המכיל, התאים והעברת צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל התאים ב כ 450 XG 3 דקות ב RT.
- הסר את supernatant על ידי תאי ואקום resuspend ב 10 מ"ל PBS. תאי צנטריפוגה ב כ 450 XG במשך 3 דקות. הסר את supernatant ידי ואקום, ואת resuspend התאים 10 מ"ל PBS.
- פיפטה 10 μl של השעיה התא על גבי hemocytometer תחת כיסוי זכוכית. ספירת התאים כדי לקבוע את ריכוז התאים. תאים Resuspend ב PBS בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / מ"ל HBSS. העבר התאים לצינור microfuge 1.5 מ"ל סטרילי לשמור על התאים על הקרח עד לשימוש.
- השתמש נקבת עכברי BALB / ג של 6 - 8 שבוע להזרקת תאים סרטניים.
- לגלח את השיער ליד שמסביב לפטמת # 3 באמצעות גוזם שיער אלקטרוני. הזרקת 4T1 תאים לתוך כרית שומן בלוטת 3 חלב מייצרת reproducibly גרורה ריאה. נקו את האזור המגולח באמצעות מקלון צמר גפן טבול לתוך 70% ethanol. Resuspend תאים על ידי היפוך הצינור microcentrifuge 2 - 3 פעמים. לשאוב בעדינות 50 μl של השעיה התא לתוך CC ½ 27 G 1/2 מזרק טוברקולין.
- להזריק את התאים הסרטניים לתוך כרית שומן החלב תחת בלוטת החלב # 3 של עכבר BALB / ג. מניחים את העכבר בכלוב נקי להחזיר את הכלוב למתקן דיור בעלי חיים. יש להמתין כ 21 - 30 ימים עבור התפתחות גידולים. צמיחת גידול צריך להיות פיקוח על בסיס קבוע בהתאם לתקנון של מוסד ללימודי גידול.
2. הדמית פליטת אור עכבר החי של גידול
- עכברי תמונה כל 3 ימים לאחר עכברי העברת הזרקת גידול למתקן ההדמיה. להזריק 100 luciferin μl (30 מ"ג / מ"ל ב PBS) intraperitoneally (IP) לעכברים לפני הדמיה. לאחר כ -10 דקות, להרדים עכברים בתא אינדוקציה עם 2% isoflurane / O 2 זרימה. השתמש מלקחיים לגעת ברגלו של העכבר. אין תגובה למגע מאשרת that העכבר הוא מודע באופן מלא.
- מניח את העכברים בחדר ההדמיה עם isoflurane 2% רציפים O 2 בקצב זרימה של 2 ליטר / דקה. מניח את העכבר כך השטח של עניין (כלומר, כרית החלב של זריקת גידול הראשונית) במסרטה של מערכת ההדמיה. ודא האף והפה של העכבר נקבעים בתקיפות בתוך צינורות הרדמה. בעלי חיים צריכים להיות מורדם לפי סטנדרטים וטרינרי במוסד.
- רוכשת הדמית פליטת אור עם מערך של זמן חשיפה שונה. לדוגמא, גדר חשיפת 30, שדה הראייה (FOV) עד 25, גובה עצם עד 1.5 סנטימטר, ולקבל צילומים זורחים עם רנטגן צריכת חשמל נמוך. הגדר את יחידות המדידה "זוהר."
- השתמש מגוון ליניארי אוטומטי עם מקסימום של כ 2.4 x 10 7 יחידות זוהרות. לאחר רכישת תמונות ראשוניות, ולהתאים את הגדרות ולקבל דימוי אופטימיזציה (איורים 3 ו -4).
- חזור עכברים לנקות כלובים ולהבטיח עכברים להכרתו עם ambulation לפני חזרת בעלי החיים למתקן הדיור.
- ניתוח נתונים באמצעות תוכנת הדמית חיים קשורה מכשיר ההדמיה. באמצעות תכנית הדמיה, לצייר קו סגור סביב האזור של (ROI) ריבית. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לקבוע את עוצמת הקרינה של ROI. רשום את העוצמות היחסיות של כל החזר על השקעה עבור כל עכבר.
הערה: עוצמות קרינה גבוהות מצביעות רמות גבוהות יותר של תאים זורחים, ובכך צמיחת גידול גדולה. - מבחינה ויזואלית לבחון את העכבר כל 3 ימים לתופעות לוואי.
הערה: עכברים יישקלו פעם בשבוע. ירידה במשקל של משקל גוף 15% תיחשב השפעה שלילית ועכברי נושאות הגידול יהיו מורדמים כמתואר בשלב 5. עכברים עם גידולי כיבים יהיו גם מורדם.
3. הסרה כירורגית של גידולים ראשוניים
לאTE: מספרי חיטוי, מלקחיים קליפים פצע פצע applier קליפ (איור 1).
- לבצע את הניתוח במנדף סטרילי כדי לשמור על מצב סטרילי כדי להפחית את הסיכון של זיהום. יום אחד לפני הניתוח, לגלח את האזור שסביב הגידולים של בעכברים נושאי-הסרטניים עם גוזם שיער חשמלי.
- כ 2 - 4 שעות לפני הניתוח, להאכיל את טבליות לעיסה carprofen עכברים ניסח עבור עכברים במינון של 5 מ"ג / ק"ג משקל גוף.
- שם העכברים בתא המכיל 2% isoflurane חמצן למשך כ -30 שניות. ברציפות להרדים את העכבר באמצעות מנגנון הרדמה בתקופת הכירורגי כולו.
- השתמש במקל צמר גפן סטרילי כדי להחיל משחת וטרינר כדי בעין בעכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. השתמש מלקחיים לגעת ברגלו של העכבר. אין תגובה למגע מאשרת כי העכבר הוא מודע באופן מלא.
- לחטא את אזור העור סביב לאזור הגידול עם שלושה לסירוגיןמגבונים של לשפשף חיטוי סבון. נגב את אזור הניתוח עם אלכוהול 70% לנגב.
- השתמש אזמל מעוקר (איור 1) לחתוך חתך קטן ליד הגידול.
- הכנס את קצה זוג מספריים מעוקרים כדי החתך לחתוך את העור סביב הגידול לחשוף גולה הגידול (איור 2 א). החזק את הגידול עם מלקחיים סטרילית להשתמש במספריים כדי להפריד את הגידול מן העור (איור 2 ב). שמור מדגם הגידול על ידי הקפאת -80 ° C במקפיא או על ידי תיקון בתמיסת פורמלין 10% לשימוש עתידי.
- לסגור את האתר כירורגית עם 9 קליפים מ"מ פצע באמצעות applier האוטומטי קליפ (איור 1). החזר את העכבר לכלוב נקי עם מצעים autoclaved. החיות צריכות להיות במעקב בהתאם להנחיות מוסדיות.
הערה: העכבר בדרך כלל להכרתו מספיק ומתחיל לנוע בכלוב כ 10 - 30 דקות לאחר הניתוח. - נהל carprofen כדיעכברים שוב 24 שעות לאחר הניתוח. Carprofen הוא על שיכוך כאבים שלאחר ניתוח וכן קבע של שיכוך כאבים שלאחר ניתוח צריך להיות מאומת על ידי התייעצות הישירה עם צוות הווטרינרים של המוסד. הסר קליפים הפצע לאחר מרפא הפצע (בדרך כלל תוך 5 - 7 ימים לאחר הניתוח). הסר קליפים הפצע באמצעות מסיר אוטומטית קליפ.
4. הדמית פליטת אור עכבר החי של גרורות של גידולים
- עכברים תמונה כל 3 ימים לאחר הניתוח כמתואר בשלב 2.
5. אימות של גרורות סרטניות בריאות באמצעות אינפלציה בהודו דיו של ריאות נושאי גידול
הערה: כדי לאמת את תוצאות הדמית גידול החיות בלוציפראז, לבצע אינפלציה דיו הודו של ריאות עכבר גידול נושא לכמת גושים סרטניים. 4T1 תאים גם גרורים לאיברים ורקמות אחרים (איור 5) ולכן, בדיקה היסטולוגית של איברים אלה כדי לאמת גרורות של גידולים צריכה להתבצע במידת הצורך. לון שימוש בפרוטוקול זהגרורות גרם כדוגמה.
- שמור עכברים בכלוב הבתים הקיימים שלהם להמתת חסד. כאשר שוכן עם בעלי חיים אחרים, להעביר עכברים אלה לא להיות מורדמים לכלוב אחר.
- סר העליון כלוב מסנן ולהחליף העליון המסנן 2 CO. הפעל את בלון גז דחוס CO 2 (100%), שמחובר אל ראש המסנן 2 CO. הגדר את קצב הזרימה ב 2 ליטר / דקה ולשמור CO 2 במשך 10 דקות לפחות. אם העכברים עדיין נושמים בסוף 10 דקות, לעזוב את CO 2 עד 1 דקות לפחות אחרי עכברים להפסיק לנשום. בטל מלא גליל CO 2 ואת מד הזרימה. חכה 3 דקות יותר ולהסיר העליון המסנן.
- מניחים את העכבר הקריב על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים כדי להבטיח גישה בלא הפרעה אל קנה הנשימה. תרסיס העכברים עם אתנול 70%.
- בעזרת זוג מספריים, לחתוך לאורך קו האמצע של הבטן האמצע של העכבר דרך בית החזה ומעלה לכיוון saliלהשתנות בלוטות. שים את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להסיר רקמות סביב קנה הנשימה כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- מפרסם קצה פיפטה מתחת קנה הנשימה. החזקת הקצה ביד אחת, בעדינות להרים את קנה הנשימה מעלה מהגוף.
- סובב את הפלטפורמה מחזיקה את העכבר 180 °. השתמש ½ CC 27 G 1/2 מזרק טוברקולין להזריק דיו הודו (10% דיו הודו 0.1% אמוניום הידרוקסיד) לריאות דרך קנה הנשימה. לגמרי לנפח את הריאות עם הדיו, אלא הוא חש התנגדות חזקה.
- השתמש זוג מספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העכבר וכנס קבוצה נוספת של מלקחיים תחת הריאות ולמשוך את האונה של הריאות מן העכבר. שוטפים את בקצרה הריאות בתוך מים המכילים מבחנה.
- במנדף כימי, להעביר את הריאות כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית המכיל 3 מ"ל של הפתרון של פקטה (אתנול 50%, 6% פורמלדהיד, וחומצה אצטית קרחונית 3%). כיסוי או בקבוקון כדי למנוע את הפתרון מן מתאדים.
הערהניתן לאחסן רקמות בתמיסה של פקטה ללא הגבלת זמן:. - אחרי כמה דקות, להתבונן גושים סרטניים כמו נקודות לבנות על הריאות השחורות (איור 5). גולה הגידול הלבן גלוי על ידי עיניים. מעבירים את הריאות לצלחת במנדף ולספור את מספר כתמים לבנים. כל כתם לבן מייצג גולה גידול גרורתי יחיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקמת מודל סרטן שד עכבר Orthotopic
4T1 היא שורת תאים אגרסיבית חלב קרצינומה. הזרקה של מעט ככל 1 x 10 4 תאים לתוך כרית שומן החלב יכולה להוביל להקמת גולת גידול יחידה באתר ההזרקה (איור 2 א). לכן, הגידול מחק קרצינומה חלב ראשונית אדם. כמעט 100 עכברים% לפתח את הגידול orthotopic. גודל הגידול ניתן לכמת באמצעות קליפר דיגיטלי או על ידי הדמית גידול חייה (איור 3). גידולים ניתנים לזיהוי כ 3 ימים לאחר ההזרקה הגידול באמצעות מערכת הדמיה פליטת אור, והעליות עוצמת הארה כמו מגדילה גודל הגידול (איור 3). לכן, מודל זה הוא מודל אידיאלי orthotopic סרטן השד לבדיקת יעילות של כימותרפיות וסוכנים חיסוניים נגד כל שלבי קרצינומה חלב.
ther.within-page = "1"> גרורה ספונטנית
בחולי סרטן אנושיים השד, הגידולים העיקריים הם הוסרו בניתוח לאחר אבחון. עם זאת, מספר רב של חולים שכבר יש LN או גרורות מרוחקות בעת האבחנה. בנוהל, רוב העכברים פיתחו LN ו גרורות מרוחקות לאחר 30 ימים של השתלת הגידול. הליך כירורגי המתואר מוחקת את הגידול הראשוני (תרשים 2B). אין גידולים ראשוניים שיורית מזוהים באתרי הגידול הראשוניים 10 - 30 ימים לאחר הניתוח (איור 2 ב). הסרה כירורגית של הגידול הראשוני מרחיב את תוחלת החיים של עכברים נושאות הגידול אך אינה מונעת גרורות של גידולים לחלקים שונים של עכברים. גרורות אלה יכולים להיות מזוהים על ידי שיטת הדמיה חיה (איור 4). מודל זה ובכך הוא מודל של סרטן ספונטני גרורות שד מחקת חולי סרטן השד אנושיים. מודל זה שימושי: 1) לימוד BRE הספונטניתגרורות סרטן האס '(למשל, תאי 4T1 ניתן transfected עם גן של עניין לבדוק את הפונקציות של הגנים הללו בסרטן השד גרור ספונטני); ו -2) בדיקת יעילותם של חומרים כימותרפיים ו חיסוניים נגד גרורות שד ספונטניות מארח חיסון מוסמך. האתרים של והתארים של גרורות ניתן לאתרם באמצעות הדמית חיה (איור 4) ולאמת עם גישה שנייה (איור 5). הדמיה הארה יכול לכמת הגידול בנטל של הריאה כולה. אינפלצית דיו של ריאות נושאות גידול מאפשרת ספירה מדויקת של הגושים הסרטניים בפועל של כל ריאה (איור 5), ובכך, מייצג שיטת כימות מחמיא של גרורות של גידולים.
איור 1. כלי ניתוח. 1.Stainless אזמל, 2. מלקחיים. 3. מספרי נירוסטה. 4. Autoclip applier קליפ הפצע. 5. מסיר קליפ פצע Autoclip. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. דגם גידול Orthotopic 4T1. א. 4T1 תאים סרטניים (1 x 10 4 תאים 100 μl PBS) התאים הוזרקו לתוך כרית שומן החלב. שלושים יום לאחר הזרקת גידול, העכבר הוקרב ובחן עבור צמיחת גידול. המוצג הוא בעכברים נושאי-הסרטני עם גולת גידול יחידה באתר ההזרקה (חץ צהוב). ב. הגידול כפי שמוצג ב- הוסר בניתוח. המוצג הוא עכברים 4T1 נושאות הגידול 10 ימים לאחר הסרה כירורגית של הגידול הראשוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.
איור 3. הדמית גידול חייה של הדמית גידול חייה מבוססת בלוציפראז. 4T1 תאים סרטניים (1 x 10 4 תאי 100 μl PBS) תאים הוזרקו לתוך כרית שומן החלב. העכבר היה צלם בבית הימים 7, 14 ו 28. מוצג הוא עוצמת ההארה של הגידול הראשוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ויזואליזציה של התקדמות גידול על ידי הדמית גידול חייה מבוססת בלוציפראז. 4T1 תאים סרטניים (1 x 10 4 תאי 100 μl PBS) תאים הוזרקו לתוך כרית שומן החלב. הגידול הראשוני בניתוח הוסר כמו shעצמו באיור 3. העכבר היה צילמו אז 17 ימים לאחר הסרה כירורגית של הגידול הראשוני. המוצג הוא תמונה של גרורות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ויזואליזציה איור 5. של גושים סרטניים ריאות ידי הודו דיו אינפלציה. הריאה של עכבר נושאות גידולים נופחת בדיו וקבוע בתמיסה של פקטה. הנקודות הלבנות הן גרורות ריאה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סוגים רבים של דגמי עכבר מהונדסים של גרורות סרטן השד פותחו. 1 אלה עכברים מהונדסים יש שכיחות גבוהה גידול בין 60 ל 100%. עם זאת, השכיחות הגרורות של עכברים טרנסגניים אלה הן נמוכות בהרבה מאשר שכיחות הגידול (14 - 100%). תאים סרטניים מתפשטים LN וריאות ברוב המכריע של מודלי עכבר המהונדסים אלה של גרורות סרטן השד. השהית הגרורות משתנית מדגם לדגם ו נעה בין 2 עד 8 חודשים. 6,11-16 אלה מודלי עכבר המהונדסים של גרורות סרטן השד הם מערכות מצוינות לחקר המנגנונים הגנטיים ו מולקולריים שבבסיס גרורות סרטן השד. עם זאת, שכיחות הגרורות הנמוכות חביון גרורות הארוך להגביל את השימושיות של המודלים האלה במבחן של תרופות אנטי-סרטניות.
השתלת orthotopic של 4T1 תאי כרית שומן החלב, עם הקמתה של גידולים ראשוניים וצמיחה גרורתי עוקבת resembles שלבי מרובים מסרטן השד ממאיר, הכוללים השקעת גידול ראשונית, גרורות צומת לימפה וגרורות איבר רחוקות. יתר על כן, השתלת syngenic ימנע אימונולוגית מארח-versus-שתל התגובה המאפשר מחקר על תרומת המיקרו-סביבה של הגידול, כולל המערכת החיסונית, כדי התקדמות הגידול ממאיר. מודל זה הוא גם שימושי לחקר תגובה חיסונית נגד סרטן המארח. לכן, הזרקה של 4T1 תאי כרית שומן החלב ייצג שיטה מהירה כמוני ללמוד גרורות סרטן השד.
מודל גידול orthotopic 4T1 השתלה יש שכיחויות גידול 100% תוך פחות מ -30 ימים ל -100% גרורות שכיחות בתוך פחות מ -60 ימים (איור 2-4). יתר על כן, בניגוד לרוב הדגמים עכבר מהונדס של גרורות סרטן השד, תאים סרטניים 4T1 גם גרורות לעצם (איור 4), ובכך, הדומה גרורות סרטן שד אנושיים.
expressi Stableעל בלוציפראז קידוד cDNA ב 4T1 תאים סרטניים מאפשר ניטור של הגידול והתקדמות בעכברים חיים לאורך זמן (איור 3). נטל הגידול קינטיקה גרורות ניתן לכמת על בסיס עוצמת ההארה. יתר על כן, באתרי הגרורות ניתן לזהות גם על ידי ההדמיה בלוציפראז (איור 4) ומאומתים עם גישה משלימה (איור 5). לכן, מודל גרורות הספונטני סרטן השד הזה הוא מודל מצוין לקביעת היעילות של תרופות אנטי-גרורות in vivo.
רוב הניתוח כרוך סגירת חתכים עם תפרים. הנה, צפינו כי קליפים פצע חלד לעבוד היטב (איור 1). הקליפ הפצע ניתן לעקר בקלות ליישם בקלות עם applier autoclip (איור 1). קליפים הפצע ניתן להסיר בקלות עם מסיר קליפ (איור 1) לאחר שהפצע נרפא. יש לנו OBשירת שום זיהומים עם טכניקה כירורגית זו בלמעלה מ -20 ניתוחים.
מגבלה אחת של מודל זה היא שיעור צמיחת גידול המהיר. רוב העכברים נושאות גרורות מת 1 - 2 חודשים לאחר הניתוח בשל נטל גרורות נרחב. מגבלה נוספת היא כי 4T1 קו תא עכבר תגובתה תרופות ניסיוניות עשויה להיות שונה לתגובה מתאי אדם. זה צריך להיחשב בעיצוב מחקר לבדיקת תרופה ניסיונית.
לסיכום, יש לנו אופטימיזציה הליך פשוט ועם זאת רגיש של מודל גרורות ספונטניות סרטן שד orthotopic. מודל זה מחק גרורות סרטן השד אנושיות. קינטיקה התקדמות הגידול ניתן לנטר לכמת לאורך זמן. מודל זה הנו אחד אידיאלי לא רק ללימוד צמיחת סרטן שד גרור, אלא גם עבור בדיקת יעילותם של חומרים כימותרפיים ו חיסוני 17 בדיכוי של גרורות סרטן השד ספונטניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ami-X Imaging System | Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ | ||
| IsoTec SurgiVet | Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA | ||
| AutoClip Physicians Kit | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427638 | |
| 9 mm AutoClip Applier | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427630 | |
| 9 mm AutoClip Remover | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427637 | |
| 9 mm AutoClip Wound Clip | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427631 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher | 8940 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher | 8875 | |
| 1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe | Becton Dickinson and Co. NJ | 305620 | |
| RPMI 1640 medium | Mediatech Inc | 10-040-CV | |
| PBS | Mediatech Inc | 21-040-CV | |
| 70% Ethanol | Ultrapure-usa.com | ||
| Trypsin-EDTA | Mediatech Inc | 25-040-CI |
References
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van 't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat Rev Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. J Vis Exp. , (2015).
- Stewart, T. J., Abrams, S. I. How tumours escape mass destruction. Oncogene. 27, 5894-5903 (2008).
- Lopez, J. I., et al. CD44 attenuates metastatic invasion during breast cancer progression. Cancer Res. 65, 6755-6763 (2005).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26, 513-523 (2005).
- Cuevas, B. D., Winter-Vann, A. M., Johnson, N. L., Johnson, G. L. MEKK1 controls matrix degradation and tumor cell dissemination during metastasis of polyoma middle-T driven mammary cancer. Oncogene. 25, 4998-5010 (2006).
- Danna, E. A., et al. Surgical removal of primary tumor reverses tumor-induced immunosuppression despite the presence of metastatic disease. Cancer Res. 64, 2205-2211 (2004).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC Cancer. 8, 228 (2008).
- Hu, X., et al. Deregulation of apoptotic factors Bcl-xL and Bax confers apoptotic resistance to myeloid-derived suppressor cells and contributes to their persistence in cancer. J Biol Chem. 288, 19103-19115 (2013).
- Kwan, H., et al. Transgenes expressing the Wnt-1 and int-2 proto-oncogenes cooperate during mammary carcinogenesis in doubly transgenic mice. Mol Cell Biol. 12, 147-154 (1992).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Almholt, K., et al. Reduced metastasis of transgenic mammary cancer in urokinase-deficient mice. Int J Cancer. 113, 525-532 (2005).
- Gallego, M. I., Bierie, B., Hennighausen, L. Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways. Oncogene. 22, 8498-8508 (2003).
- Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
- Ridgeway, A. G., McMenamin, J., Leder, P. P53 levels determine outcome during beta-catenin tumor initiation and metastasis in the mammary gland and male germ cells. Oncogene. 25, 3518-3527 (2006).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. J Vis Exp. , (2010).
