Biology

解剖やイトヨ鰓スケルトンのフラットマウント

Published: May 7, 2016 doi: 10.3791/54056

¹Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

Introduction

多様性の信じられないほどの量は、特に魚類の中で、脊椎動物のうち、頭部骨格に存在します。多くの場合、この多様性は、異なる給餌戦略¹を容易に^- ^4を、そして外部と内部の両方の頭蓋顔面パターン形成に大きな変更を伴うことができます。鰓スケルトンは魚の喉の内部に位置し、口腔の大部分を取り囲みます。鰓骨格は鰓をサポート前部4そのうちの5連続的相同セグメントで構成されています。一緒にこれらの5つのセグメントは、魚や彼らの食糧⁵との間のインタフェースとして機能します。鰓耙、咽頭歯、および鰓骨などの形質の多数の変動は、食品のさまざまな種類の効率的な採餌に貢献しています。

トゲウオは、北半球全体の淡水湖や小川植民地化先祖の海洋形後の適応放散を受けました。食生活の変化海の小さな動物プランクトンから淡水でより大きな獲物には、いくつかの頭蓋顔面の特性⁶の劇的な栄養変化をもたらしました。多くの研究は、トゲウオ⁷で外部頭蓋顔面の違いに焦点を当ててきたが^- ^13、重要な頭蓋顔面の変更は内部鰓スケルトンで繰り返し進化します。形態学的に異なるトゲウオ集団との間の肥沃なハイブリッドを作成する機能は、鰓スケルトンへの進化の変化の遺伝的基礎をマッピングするための絶好の機会を提供します。

生態学的意義の一つ栄養特性は、鰓耙、鰓骨の前部と後部の顔を並べると獲物のアイテムをフィルタリングするために使用されている定期的な皮膚、骨のパターニングです。一般的に小さな獲物のアイテムを餌に魚がより長く、より密に間隔を置い鰓が大きい獲物^14,15を餌に魚に比べ耙持っている傾向があります。鰓耙の変化が報告されている両方のwithinと種間^14-19、および鰓放蕩者のパターニングの側面は、栄養ニッチとフィットネス¹⁶に貢献しています。数十年にわたる研究が盛んthreespineトゲウオで¹⁷鰓放蕩者の数と長さの変化を報告している^- ^21;しかし、これらの研究は、一般的に鰓耙の最初の行に焦点を当てます。最近の研究は、1または単一の鰓の放蕩者が理解するために行以上のことを学ぶことの重要性を強調^23、長さ^24間隔鰓スケルトン^22,23を横断し、鰓放蕩者で単一の行全体で鰓放蕩者数の遺伝的制御にモジュール性を示しています鰓放蕩者の減少の発生遺伝的基盤。

生態系と生物医学の両方の重要性の第二の栄養特性は、咽頭歯のパターニングです。魚類における歯は咽頭歯として知られている、両方の口腔顎にし、鰓スケルトンに配置することができます。口腔歯は、pのために主に使用されています²⁷ ^-咽頭歯は咀嚼と獲物操作²⁵のために使用されている間レイキャプチャします。両方のセットは、共有発達機構を介して形成し、相同²⁸発達と考えられています。このようなゼブラフィッシュ、不足口腔および背側咽頭歯²⁹のようないくつかの種は、他の種は、複数の歯付きceratobranchialsを持ってpharyngobranchials、時にはbasihyal歯と^30を hypobranchialsながら、それによって興味深いモジュール性が発生します。トゲウオでは、咽頭歯は前部と後部^31を pharyngobranchials上の第五ceratobranchialと背に腹側に発見されました。トゲウオ供給上のキネマティクスは、口腔顎は主に獲物捕獲および咽頭顎に咀嚼を残して吸引送り^9を容易^にするために使用されることを示します。シクリッドでは、下咽頭顎形態は劇的^32,33が変化し、適応および栄養ニッチ³⁴と相関することが示されています。マルチPLE淡水トゲウオ集団は腹側咽頭歯数^23,35,36の劇的な増加を進化させてきました。最近の研究は、この進化した歯利得の発達の遺伝的基礎は淡水トゲウオ³⁶の2つの独立して誘導された集団における大部分は別個のものであることを示しました。哺乳動物の歯とは違って、魚は成人期³⁷を通じて継続的に自分の歯を再生成します。これらの前述の高い歯付淡水集団の両方が再生³⁶の遺伝的基礎を研究するまれな脊椎動物のシステムを提供すること、加速歯の交換レートを進化させてきました。

淡水トゲウオで繰り返し進化してきた第三の栄養特性は長く、それぞれ³⁸ epibranchialとceratobranchial骨、上下の顎の鰓弓の分節同族体、です。長い鰓の骨が大きく口腔を与え、おそらくより大きな獲物アイテムはcできるようにするために適応されていますonsumed。また、他の魚で、epibranchial骨は背側咽頭歯プレート²⁵のうつ病のために重要です。鰓耙と咽頭歯と同じように、鰓骨は、内部および容易に視覚化または定量化することは、困難です。

ここでは、分析する詳細なプロトコルを提示し、重要な頭蓋顔面形質の様々な簡単に可視化および定量化を可能にする、鰓骨格をフラットマウント。このプロトコルは、トゲウオの解剖を説明しているが、これと同じ方法は、他の魚の様々に取り組んでいます。

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Protocol

すべての魚の作業は、カリフォルニア大学バークレー校の施設内動物管理使用委員会（プロトコル番号R330）によって承認されました。安楽死は、0.1％炭酸水素ナトリウム³⁹で緩衝0.025％トリカイン-Sへの浸漬を使用して行きました。全ての工程は室温で実施されます。

1.準備

注意：しっかりと封止することができると水平に置くことが円錐管またはシンチレーションバイアルの手順1.1から1.5を実行します。魚は常に振とうする必要がありますが、静かに反転または染色液に魚のすべての側面を露出させ、汚れが均等に組織を貫通できるようにするために、チューブまたはバイアルのラックを振ることによってできるだけ頻繁に溶液を混合しないでください。液体の重い重量がシェーカーを破るように、プラットフォームシェーカー上で魚の大規模なバッチを置かないでください。

10％中性緩衝ホルマリン（NBF）に一晩でエタノール中で保存したばかりの安楽死させた魚または魚のいずれかを修正しました。あるいは、4％のパラホルムを使用1×PBS溶液の代わりに10％NBF中のアルデヒド。
注：DNAを抽出した場合、エタノール中で固定し、店の前に尾や胸ひれの小さな部分をクリップ。
2時間（すなわち、pH約7.0である）、化学フード内で適切に修正を処分し、水道水で交換してください。それは多くの場合、酸性にすることができ、骨を脱灰することができるように脱イオン水を使用しないでください。
24時間水に1％KOHで0.008パーセントアリザリンレッドSで水や汚れの魚を削除します。魚が20mm未満の標準的な長さは、0.004パーセントアリザリンレッドSである（その後、希釈することができるアリザリンレッドSの100倍（0.8％）のストック溶液を作る）を使用します。
（フード内の適切な廃棄容器に入れて）汚れを取り除き、数時間水道水に魚を置きます。必要に応じて水リンスはほとんど透明になるまで水を変更します。
軽度の清算およびその後の解剖のために水を除去し、50％グリセロールに魚を置き、0.25％KOH。
注：この染色プロトコルは、前述の方法^40,41から変更されています。

注：関連するヘッド骨格形態の見直しについては、 図1を参照してください。

図1：トゲウオヘッド骨格形態アリザリンレッドは、ローダミンBフィルターセットの下で蛍光を用いて画像化イトヨヘッドを染色しました。有用な形態は標識されている：OP =主鰓蓋骨、Subop = subopercle、BSRの=鰓線、術前=前鰓蓋骨、Infraorb 1-3 =眼窩下1-3（またcircumorbitalsまたはsuborbitalsと呼ばれる）、デント=歯骨、Premax =前上顎骨、マックス=上顎、ナズ=鼻、緯度。 ethm =横篩骨、PSPH =副蝶形骨、フロン=前頭骨。トゲウオの頭部骨格のより詳細な説明については、アンカー^{（1974）31を}参照^してください。の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

フラットフィッシュ（ 図2A）を置き、目を覆っている膜を穿刺するために〜45°の角度で、眼の側に鋭い＃5の時計メーカーの鉗子を挿入します。
ピールヨーグルトのふた（ 図2B）を剥離に似た眼から離れた膜。
、目の後ろに開いた鉗子を挿入し、目の後ろの視神経のホールドをつかむと、目（ 図2C）を取り外します。それはメラニンをリークしますように目を開けたりしないでください。パンクした場合、メラニンは、後の工程の間に洗い流すことができます。
反対側に繰り返します。
後方から出発し、主鰓蓋骨フラップの下に一つの小さな切開鋏ブレードを置き、ドラッグ鋏ブレードは、背側主鰓蓋骨の上に、その後、眼窩（ 図2D）までの軟組織をカット。主鰓蓋骨の骨に背をカットします。
前頭骨（アイソケットに背側）（ 図2E）をカットします。
トンの周りの正中線副蝶形骨骨をカット眼窩（ 図2F）の彼が中心。
反対側に主鰓蓋骨カットを繰り返します。
主鰓蓋骨の下に鉗子を挿入し、ゆっくりと、まだ（ 図2G - H）結合した任意の軟組織をトリミングし、体から離し、顔の皮をむきます。鰓耙の最初の行を破壊しないように注意してください。
1. 外装真皮主鰓蓋骨、前鰓蓋骨、subopercleを含む全体の舌骨の骨格を、そして、鉗子で、剥がしと前頭蓋顔面の骨格（歯骨、前上顎骨、および上顎を含む全体の顎を除去しながら正中basihyalから両側にceratohyalsを切り離します鰓線や根底にある背側と腹側の軟骨内の要素;および鼻、横篩骨洞、および眼窩下骨を含む頭蓋骨の前部には、図1および図 2I）を参照してください。
2. 骨盤棘が体から出て折り畳むことができる、とホールドOをつかむために鉗子のハンドルとして機能することができますFが存在する場合。棘がロックされています。ロックを解除するには、静かに直接離れた魚体から鉗子で背骨を引っ張って、その後静かに魚に対して平ら背骨を押すように後方に曲がります。
挿入は離れて鰓スケルトン（ - K 図2J）に取り付けられ、残りの筋肉や靭帯をからかって、前方およびドラッグ鉗子（ちょうど腸管以下）鰓骨格に鉗子後部と腹側を閉じました。
閉じた鉗子の先端を使用して、前方方向（ 図2L）に後方に腹braincaseに背鰓骨格を取り付ける筋肉を削り取ります。
反対側に2.9と2.10を繰り返します。
腸管のベースをつかみ、鰓骨格と腸管（図2M - N）を除去するために前方に引き出します。
第五ceratobranchial（ 図2Oの最後に垂直なカット後部を行うことで、腸管を分離
鰓骨格の背側にbraincaseから残りの骨片を除去した後、背側歯プレートの二国間の組（ - D 図3A）との間に背側カット（後部に前方をカット）を作るために鰓バスケットにはさみを挿入します。カットが背側歯板の損傷を防ぐために、センタリングされていることを確認。
鰓スケルトン（ 図3E）を開くを支援するために鰓スケルトン（腸管の前端）の後方端にゴム状の腸管内腔に2つの浅い横方向のカットを行います。
魚や瓶にすべての組織片を置き、それ以上の清算が必要とされない場合は、穏やかなクリア、または100％のグリセロールを継続するために50％グリセロール、0.25％KOHでマイクロ遠心チューブに鰓骨格を配置します。彼らは追跡することができるように、一意の識別子とジャー、チューブにラベルを付けます。必要なクリア量が40メートルにわたって（主に魚、大きな大人の魚の大きさの関数であります標準的な長さのメートル）は、通常、追加の決済を必要とします。

図2：トゲウオ鰓スケルトン解剖アリザリンレッドは、解剖の準備ができてイトヨの魚を染色しました。目は大規模なクリアから脱色されます。青い矢印は、動きの方向を示します。 （A）トゲウオヘッドの側面図、前部は右にあります。 （B）の目を覆っている膜の除去。 （C）目の除去。 （D）背側は、主鰓蓋骨の上にカット。 （E）前頭骨カット。 （F）副蝶形骨カット。（G - I）顔面骨格の除去。腹鰓スケルトンの軟組織接続の（J）の除去。（K - L）背鰓スケルトン接続の除去。（<強い> M - N）鰓骨格の除去。 （O）鰓スケルトンから腸管を区切ります。詳細については、手順2.16を介して2.1を参照してください。スケールバー= 5ミリメートル。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3.鰓スケルトン再染色（必要な場合）

より鰓スケルトン暗いまたは明確な組織を染色するために、50％グリセロール、0.25％KOH溶液を除去し、二回1％KOH（プラットフォームシェーカー上に水平に振とうしながら第二の24時間洗浄した1 5分間の洗浄）で洗浄しました。
24時間、1％KOHで0.008パーセントアリザリンレッドSで1％KOHおよび再汚れを取り除きます。
汚れを削除し、24時間、1％KOHで交換してください。
KOH溶液を除去し、50％グリセロール、0.25％KOHで交換してください。

鰓スケルトンを取り付け4.

鰓骨格を削除します背側、22ミリメートル×60ミリメートルのガラスカバースリップの下の方に50％グリセロール、0.25％KOHまたは100％グリセロールと場所から（ 図3F）を上向き。鰓骨格の上に0.25％KOHまたは100％のグリセロール、50％グリセロールを数滴加えます。マイクロチューブに50％グリセロール、0.25％KOH〜100％グリセロール、変更溶液からの移行および> 5分間の前に組織を平衡化するために実装に振る場合。
スペーサーとして機能するようにカバースリップのどちらかの端に粘土と場所の二つの小さなボールをロールアウト。
緩く前部鰓スケルトン（ 図3G）を平坦化するのに十分な圧力で上に第二のカバースリップを配置。
ピールは、背側の歯のプレートを含む左背側フラップを開いて平らにし、カバースリップ（ 図3H）との間にスライド。
右背側フラップ付き繰り返し技術とは、カバーガラス（ 図3I）の縁から離れて全体鰓骨格を押してください。
1. 変更しますネイティブに、ピンセットでオープン両方の背側のフラップを保持し、慎重にカバースリップを置き、1滑らかな動きで鰓スケルトンを平坦化します。
2. 重力が鰓スケルトンがバックアップクローズすることはできませんので、別の方法として、アウト側方にそれぞれの背側を扇形に開く、1つのカバースリップ上で逆さま鰓骨格をマウントします。次に、2番目の22ミリメートルX 60ミリメートルガラスカバースリップでカバーし、準備を反転。
  注：異なる実装技術は、個々のために良いか悪いか仕事する傾向があります。それぞれを試してみて、最も快適に感じるものを参照してください。
軽く鰓骨格を維持するのに十分粘土ボールを平らにするため、トップカバースリップ上に平らに取り付けられたキーを押しますが、試料を粉砕しないように注意してください。
1. 実装工程中に、ceratobranchialsが回転し、耙の行を曖昧にすることができます。カバースリップして再配向ceratobranchialsまたは全体鰓スケルトンの間に鉗子をスライドさせることによってこの問題を解決。
店はROでスライドトレイに平らプレップオム温度。 100％グリセロール中にマウントされ、調製物は、少なくとも十年ブリッジカバースリップの間保存することができます。イソプロパノールまたはエタノールとカバーのヒントとクリーン鉗子とはさみ。

図3：鰓スケルトンのフラット鰓骨格を取り付け操作と実装が示されています。青い矢印は、動きの方向を示します。 （A）鰓スケルトン背側を上に。（B - D）背側の歯のプレート間の回転と切開。さらに腸管のベースを開くには、軟組織中の（E）横カット。 （F）取り付けるための準備ができてカバーガラスの下の方に置かれて鰓スケルトン。 （G）（背側歯プレート上）鰓骨格の前半に配置された第2のカバースリップ。（H - I）背歯プレートのフラップを開けると2つのカバースリップの間にスライドさせることによって鰓骨格のフラットマウント。詳細については、4.6まで手順4.1を参照してください。スケールバー= 5ミリメートル。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Representative Results

重要な栄養形質の様々な定量化することができる解剖し、フラットマウントさ鰓骨格にこのプロトコルの結果（ 図4）。背側から見ると、鰓耙、すべての咽頭歯板、およびほぼすべての鰓骨のすべての行を簡単に可視化し^、22定量することができる^- ^{24,35,36,38,42を} 。アリザリンレッドSはまた、他のマーカー（ 例えば 、トランスジェニックGFP ^42）との二重標識し、可視化する別の方法を可能ローダミンまたは類似の赤色フィルタに蛍光を発します。蛍光イメージングまたは表現型が計画されている場合、蛍光が暗闇の中で店舗プレップので、光の中ですぐにフェードインします。腹側から見ると、鰓を可視化し、それらの色素沈着は^、43を定量化することができます。プレップは年間100％グリセロール中で保存することができます。

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図4：代表トゲウオ鰓骨格染色し、クリア鰓骨格の2つの例が示されています。 （A）赤ラベルされた骨を示す明視野像。 （B）ローダミンBフィルターセットの下で蛍光画像。耙、歯、および骨の例は、それぞれ、キャレット、矢じり、およびアスタリスクで標識されています。スケールバー= 2ミリメートル。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	AX0485-3
Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm	VWR	16004-350
100 mm x 10 mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic Petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1 lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	986586	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7 ml	Denville	C2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10