Summary
في هذا البروتوكول، ونحن تقديم الإجراءات في تأسيس العضلي ضمور 1 نماذج بالخلايا العضلية الجذعية، بما في ذلك تحسين صيانة C2C12 الخلية، ترنسفكأيشن الجينات / التنبيغ، والتمايز العضلية.
Abstract
العضلي ضمور 1 (DM1) هو شكل شائع من الضمور العضلي. على الرغم من أن وضعت عدة نماذج حيوانية لDM1، ونماذج خلية بالخلايا العضلية الجذعية لا تزال مهمة لأنها توفر بديلا الخلوي فعال لدراسة الأحداث الخلوية والجزيئية. على الرغم من الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية C2C12 استخدمت على نطاق واسع لدراسة تكون العضل، ومقاومة للترنسفكأيشن الجينات، أو تنبيغ الفيروسية، يعيق البحوث في الخلايا C2C12. هنا، نحن تصف بروتوكول الأمثل الذي يتضمن إجراءات الصيانة اليومية، ترنسفكأيشن والتنبيغ لإدخال الجينات إلى myoblasts C2C12 وتحريض التمايز العضلية. بشكل جماعي، وتمكن هذه الإجراءات أفضل الكفاءات ترنسفكأيشن / تنبيغ، فضلا عن نتائج المفاضلة متسقة. بروتوكول صفها في إنشاء DM1 نماذج الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية يمكن أن تستفيد الدراسة من الضمور العضلي، فضلا عن غيرها من أمراض العضلات.
Introduction
العضلي الضمور (DM) هو مرض وراثي جسمي قاهر التي تؤثر على أنظمة متعددة، وأهمها القلب والهيكل العظمي العضلات 1. هناك نوعين من هذا المرض، DM1 وDM2. DM1 هو أكثر شيوعا، ولها مظهر أكثر شدة من DM2 2. الطفرة الوراثية الكامنة DM1 هو التوسع في تكرار ثلاثية CUG تقع في منطقة غير مترجمة 3 '(UTR) من DM بروتين كيناز الجين (DMPK) 3. عدد CUG تكرار في الأفراد تتأثر يختلف من 5 إلى 37. في المقابل، ترتفع إلى أكثر من 50 عاما، وأحيانا تصل إلى الآلاف في المرضى الذين يعانون DM1 4. ونتيجة لذلك، والبروتينات ملزم RNA، مثل muscleblind مثل 1 (MBNL1)، CUGBP، وElav مثل العائلة 1 (Celf1)، هي misregulated. بسبب الحراسة على تكرار CUG الموسعة، MBNL1 يفقد قدرته على تنظيم الربط البديل 5. Celf1، من ناحية أخرى، يصل ينظم 6،7. ويرتبط overexpression من Celf1 مع فقدان العضلاتوالضعف، والتي لا تنسب إلى فقدان وظيفة MBNL1. النماذج الحيوانية محاكاة التعديلات المتعلقة DM1، بما في ذلك DMPK 3'-UTR CUG التوسع، وفقدان MBNL1، وoverexpression من Celf1، أنشئت. ومع ذلك، والنمذجة DM1 في myoblasts يوفر بديلا فعالا، خاصة بالنسبة للتشريح الأحداث الخلوية والجزيئية ذات الصلة DM1.
تم عزل C2C12 خط الخلية بالخلايا العضلية الجذعية أول من أصيب العضلات C3H الماوس وتستخدم على نطاق واسع لدراسة عضلي 8،9 التمايز. خلايا C2C12 تتكاثر بسرعة في مصل بقري جنيني (FBS) المحتوية على وسائل الإعلام وبسهولة الخضوع التمايز عندما يتم استنفاد FBS. بعد، وذلك باستخدام هذا النموذج بالخلايا العضلية الجذعية التمايز يقدم تحديين: خلايا C2C12 مقاومة لترنسفكأيشن الجينات / تنبيغ الفيروسية كثير من الأحيان؛ وهناك اختلافات طفيفة في معالجة الخلايا وإجراء المفاضلة يمكن أن يؤدي إلى تغيرات ملحوظة في تشكيل myotube مركزيا.
مختبرنا يستخدم بشكل روتيني myoblasts C2C12 كما ميلانوقد وضعت الذراع نموذج والبروتوكولات التي تقدم على نحو فعال الجينات ترنسفكأيشن البلازميد، تنبيغ فيروسات، وتنبيغ lentiviral إلى خط الخلية C2C12 10. في الفيديو، ونحن لشرح إجراءات الأمثل لtransfecting / transducing C2C12 الخلايا والحفاظ على التمايز الاتساق في إنشاء DM1 نماذج بالخلايا العضلية الجذعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C2C12 خلية ثقافة
- الحفاظ على myoblasts الماوس C2C12 في لوحة 100 ملم في وسط النمو (المتوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM)) تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين. السماح C2C12 خلايا passaged لتصبح حوالي 50 - 60٪ متموجة.
- تجاهل متوسطة النمو وغسل خلايا C2C12 مع المالحة الفوسفات-3 مل درجة حرارة الغرفة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA لفصل الخلايا. وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة لل3-5 دقيقة.
- تحييد التربسين بإضافة 3 مل متوسطة النمو. ماصة 6-8 مرات للتعليق الخلايا. إضافة 1 مل من خلية علقت لوحة جديدة 100 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
2. C2C12 خلية ترنسفكأيشن / تنبيغ والاختيار
- C2C12 البلازميد ترنسفكأيشن
- 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، صأواخر 7.0 × 10 5 C2C12 الخلايا في بئر واحدة من لوحة ستة جيدا لكل ترنسفكأيشن.
ملاحظة: هذا يؤدي إلى 50-60٪ التقاء في الوقت ترنسفكأيشن. - السماح للكاشف ترنسفكأيشن أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
- إضافة 2 ميكروغرام من البلازميد (GFP-CUG5 أو GFP-CUG200) إلى 200 ميكرولتر قبل تحسنت المصل خالية المتوسطة ودوامة لفترة وجيزة. إضافة 6 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن إلى المتوسطة وخلط فورا لمدة 30 ثانية باستخدام الدوامة. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تغيير وسائل الإعلام من الخلايا C2C12 إلى 2.5 مل وسائط النمو خالية من المصل. يضاف خليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا بعد الحضانة. العودة لوحات ل5٪ CO 2، 37 درجة مئوية الحاضنة.
- إبقاء الخلايا في خليط ترنسفكأيشن / وسائط النمو خالية من المصل لمدة 4 ساعة أو حتى ليلة وضحاها. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام نمو في اليوم التالي أو عندما السمية الخلوية هو واضح.
ملاحظة: يتم تقييم السمسة عن طريق التفتيش المجهري للمLLS. مراقبة التغييرات في شكل الخلية ومفرزة الخلية. طالما لا يوجد السمية الخلوية العلنية، حضانة بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام نمو المصل خالية يعزز ترنسفكأيشن. - حدد الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن بإضافة 1،2-1،6 ملغ / مل G418 ب ~ 10 أيام حتى لا يكون للثقافة التحكم (transfected دون البلازميدات) الخلايا الحية. تغيير وسائل الاعلام كل يومين مع وسائل الاعلام النمو تستكمل مع G418.
- الحفاظ على الخلايا المقاومة G418 في متوسط النمو و 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة تجارب لاحقة.
- 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، صأواخر 7.0 × 10 5 C2C12 الخلايا في بئر واحدة من لوحة ستة جيدا لكل ترنسفكأيشن.
- إعداد الارتجاعي وC2C12 فيروسات تنبيغ
- تحضير كلوة 293 مستنبت من خلال استكمال DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز مع 10٪ مصل بقري جنيني، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين.
- ما يقرب من 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، لوحة 4.0 × 10 خلايا التعبئة والتغليف كلوة 293 المستندة إلى 6 ecotropic في 100 لوحة ملم (80٪ التقاء في ترنسفكأيشن) جontaining مستنبت الخلية.
- السماح للكاشف ترنسفكأيشن أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
- خلط 15 ميكروغرام DNA البلازميد (pMSCV-بورو أو pMSCV-Celf1Flag-بورو) في 1 مل متوسطة النمو خالية من المصل. لفترة وجيزة دوامة. إضافة 30 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن من الخطوة 2.2.2 في الحمض النووي المصل خالية أنبوب / متوسطة النمو، وتخلط جيدا باستخدام دوامة. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة خليط ترنسفكأيشن قطرة قطرة إلى الخلايا التعبئة والتغليف ecotropic كلوة 293 المستندة. دوامة بلطف لوحات والعودة إليها مرة أخرى إلى 5٪ CO 2، 37 درجة مئوية الحاضنة. بعد 24 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام إلى 10 مل قبل تحسنت متوسطة النمو الطازجة.
- حصاد طاف (التي تحتوي على الفيروس الارتجاعي) 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن باستخدام ماصة ونقل طاف في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الحارة الجديدة على لوحة وإعادته إلى الحاضنة. إبقاء طاف في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يتم إضافة وسائل الإعلام بلطف إلى tانه جانب من البئر حتى لا تعطل أحادي الطبقة الخلية. - حصاد الدفعة الثانية من طاف 60 ساعة بعد ترنسفكأيشن وتجمع مع طاف من 2.2.5. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لإزالة الحطام الخلوي.
- نقل طاف في 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. استخدام الارتجاعي لتنبيغ الخلايا C2C12 في هذه النقطة من خلال المتابعة إلى الخطوة 2.2.9 أو قسامة وتخزين طاف في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- ذوبان الجليد في الارتجاعي من 2.2.7 في درجة حرارة الغرفة، إذا تم استخدام الأوراق المالية المجمدة هنا.
ملاحظة: تجنب متعددة تجميد أذاب دورات. - لوحة الخلايا C2C12 في نفس اليوم تنبيغ تهدف ل30 - 40٪ من التقاء.
- تجاهل متوسطة النمو وغسل خلايا C2C12 مع 3 مل درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 500 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة لل3-5 دقيقة.
- تحييد التربسين بإضافة 3 مل ميد النموالبوتاسيوم. ماصة 6-8 مرات للتعليق الخلايا. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإضافة 8.0 × 10 5 C2C12 الخلايا إلى لوحة 60 ملم.
- إضافة 0.5 مل الارتجاعي لإصابة واحدة لوحة 60 ملم من الخلايا في 3 وسائل الاعلام مل النمو. العودة إلى لوحة الحاضنة.
- استبدال 3 وسائل الإعلام الجديدة مل تستكمل مع المضادات الحيوية التحديد (بوروميسين 1-3 ميكروغرام / مل) 48 ساعة بعد الإصابة. استبدال 3 مل المتوسطة مع المضادات الحيوية كل يوم ل~ 5 أيام حتى تموت الثقافة untransduced السيطرة C2C12 بها.
- تحضير كلوة 293 مستنبت من خلال استكمال DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز مع 10٪ مصل بقري جنيني، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين.
- إعداد الفيروسة البطيئة وC2C12 lentiviral التنبيغ
ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات المتعلقة الفيروسة البطيئة في السلامة الأحيائية المستوى 2 مجلس الوزراء واتباع إرشادات السلامة البيولوجية. النفايات السائلة التي تحتوي على الفيروس يجب تطهيرها قبل التخلص منها.- لوحة 4.0 × 10 6 293T الخلايا في لوحة 100 ملم (~ 80٪ التقاء في يوم من ترنسفكأيشن) مع كلوة 293 خلية ثقافة المتوسط (DMEM الجلوكوز المرتفع، على أن تستكمل مع 10٪ الجنينالمصل البقري، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين) 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن.
- تدفئة كاشف ترنسفكأيشن إلى درجة حرارة الغرفة. مزيج من ناقلات lentiviral التعبئة والتغليف (4 ميكروغرام pMD2.G و 6 ميكروغرام psPAX2) جنبا إلى جنب مع ناقل 8 ميكروغرام نقل lentiviral (Celf1 shRNA أو مشوشة تحكم shRNA) في 1 مل مصل مستنبت الخلية الحرة. لفترة وجيزة دوامة.
- إضافة 36 ميكرولتر قبل تحسنت كاشف ترنسفكأيشن على الحمض النووي / DMEM أنبوب ومزيج جيد من قبل دوامة. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إزالة الخلايا 293T من الحاضنة وإضافة خليط ترنسفكأيشن إلى اللوحة. دوامة بلطف لوحة والعودة مرة أخرى إلى 5٪ CO 2، 37 درجة مئوية الحاضنة. بعد 24 ساعة، يستعاض عن خليط ترنسفكأيشن مع 10 مل المتوسطة ثقافة جديدة.
- جمع طاف تحتوي على الفيروسة البطيئة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 10 وسائل الاعلام الحارة الجديدة مل إلى لوحة وإعادتهإلى الحاضنة. تخزين طاف في 4 درجات مئوية.
- جمع الدفعة الثانية من طاف 60 ساعة بعد ترنسفكأيشن والجمع بين ذلك مع طاف من 2.3.5. لفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
- نقل طاف في 50 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة. في حالة استخدام فيروس جديد، انتقل إلى الخطوة 2.3.9. لاستخدامها في المستقبل، مخزن الفيروس التي تحتوي على طاف في -20 درجة مئوية في aliquots من 10 مل.
- ذوبان الجليد الفيروس من 2.3.7 في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، إذا تم استخدام الأوراق المالية المجمدة.
ملاحظة: تجنب متعددة تجميد أذاب دورات. - لوحة الخلايا C2C12-CUG200 (تم الحصول عليها في القسم 2.1) كما هو موضح في 2.2.9 في نفس اليوم تنبيغ.
ملاحظة: الهدف عن 30 - 40٪ من التقاء. - إضافة 0.5 مل الفيروس تصيب لوحة 60 ملم من C2C12-CUG200 والعودة إلى لوحة الحاضنة.
- استبدال مستنبت مع وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع المضادات الحيوية التحديد (بوروميسين 1-3 ميكروغرام / مل) بعد 72 ساعة تنبيغ.تحديث وسائل الإعلام ثقافة كل يوم مع المضادات الحيوية اختيار ~ 5 أيام حتى تموت كل ثقافة untransduced السيطرة C2C12-CUG200 بها.
- استخدام لطخة غربية للتحقق ضربة قاضية Celf1 في الخلايا transfected GFP-CUG200.
3. C2C12 تمايز الخلايا
- لوحة 2 × 10 6 خلايا في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا في 2.5 مل سائل الإعلام نمو 24 ساعة قبل بدء التمايز.
ملاحظة: يمكن تعديل كثافة الطلاء المعدني بحيث يتم التوصل إلى نقطة التقاء الكامل في 24 ساعة.- شطف الخلايا متموجة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2.5 مل من المصل منخفضة التمايز المتوسطة (المعدلة المتوسطة النسر تستكمل مع 2٪ مصل الخيول، و 100 U / البنسلين مل Dulbecco و، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1 ميكرومتر الأنسولين) . استبدال المتوسطة كل يومين.
ملاحظة: حافظ على الأنسولين الأسهم المجمدة وإضافته إلى وسائل الإعلام في كل تغيير المتوسط.
- شطف الخلايا متموجة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2.5 مل من المصل منخفضة التمايز المتوسطة (المعدلة المتوسطة النسر تستكمل مع 2٪ مصل الخيول، و 100 U / البنسلين مل Dulbecco و، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1 ميكرومتر الأنسولين) . استبدال المتوسطة كل يومين.
- خلال C2C12 التمايز، وجمع عينات للتشيوانtitative RT-PCR (انظر القسم 4) في النقاط الزمنية التالية: Day0، 1، 2، 4، و 6. عملية الثقافة لالمناعية في يوم 6-8 (انظر القسم 5).
عزل 4. RNA والكمي RT-PCR
- استخدام بروتوكول الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي. بعد العزلة، resuspend وبيليه الحمض النووي الريبي في 30 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر والماصة صعودا وهبوطا عدة مرات.
ملاحظة: عينات يمكن المضي إلى الكمية RT-PCR أو يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية. - استخدام عدة RT QPCR لالكمي RT-PCR 10 و اتباع تعليمات الشركة المصنعة. تحضير مزيج رد فعل وفقا للجدول 1.
| مكون | الحجم (ميكرولتر) | تركيز النهائي |
| رد فعل العازلة 2X | 10 | 1X |
| التمهيدي إلى الأمام | 0.5 | 200 نانومتر |
| التمهيدي عكسي | 0.5 | 200 نانومتر |
| مسبار | 0.5 | 200 نانومتر |
| عكس الناسخ وريبونوكلياز المانع | 0.1 | 0.25 U / مل |
| قالب | 1 | 100 الحمض النووي الريبي مجموع نانوغرام |
| ريبونوكلياز المياه مجانا | 7.4 | NA |
| إجمالي ميكس | 20 |
الجدول 1. الكمية RT-PCR ماستر تحضير مزيج
- تشغيل 20 ميكرولتر RT-QPCR رد فعل باستخدام ملف الحرارية الجدول 2.
| خطوة النسخ العكسي | 30 دقيقة، 48 ° C |
| الحمض النووي البوليمرتفعيل بورصة عمان / الناسخ العكسي تعطيل | 10 دقيقة، 95 ° C |
| 40 دورات | 15 ثانية، 95 ° C |
| 1 دقيقة، 60 ° C |
الجدول 2. الكمية RT-PCR ملف الحرارية
5. المناعية
- إصلاح الثقافة أحادي الطبقة في 2.5 مل الطازجة 4٪ بارافورمالدهيد / برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- Permeabilize العينات في 2.5 مل 0.1٪ تريتون X-100 / برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل العينات إلى غرفة ترطيب. منع عينات في 2.5 مل عازلة تمنع (السطحي 0.1٪ غير أيوني / برنامج تلفزيوني، و 10٪ مصل الماعز العادي) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تجاهل عازلة تمنع وتطبيق 800 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية ضد سلسلة الميوسين الثقيلة المخفف في عرقلة العازلة (1: 100). احتضان في ليلة وضحاها غرفة مرطب في درجة حرارة الغرفة.
- غسل لوحة 3 تيموفاق (10 دقيقة لكل منهما) مع 2.5 مل العازلة غسل (0.1٪ بوليسوربات 20 / PBS) في يوم 2.
- إزالة غسل العازلة وتطبيق 800 الضد الثانوية ميكرولتر (الماعز المضادة للمفتش الماوس، 1: 500 المخفف في برنامج تلفزيوني). احتضان في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- غسل مرتين (10 دقيقة لكل منهما) مع العازلة 2.5 مل غسل.
- احتضان مع 800 دابي ميكرولتر (1 ميكروغرام / مل، مخففة في المقطر منزوع الأيونات H 2 O) لمدة 5 دقائق.
- يغسل مع 2.5 مل العازلة يغسل مرة أخرى لمدة 10 دقيقة.
- تغيير غسل العازلة إلى 2.5 مل برنامج تلفزيوني واستخدام المجهر الفلورسنت لالتقاط الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
و transfected خلايا C2C12 مع GFP-CUG5 أو GFP-CUG200. بعد اختيار مقاومة المخدرات، تم إنشاء مجمعات مستقرة، والتي يمكن أن تصور من قبل التعبير GFP (الشكل 1A). تم الكشف عن تشكيل myotube مركزيا في myoblasts متباينة من قبل الميوسين السلسلة الثقيلة المناعية 10 (الشكل 1B). أظهر الكمي لتشكيل myotube مركزيا أن مؤشرات الاندماج وانخفضت من 35.4 ± 4.1٪ إلى 2.6 ± 1.1٪ وكانت انخفضت المناطق myotube مركزيا من 35.6 ± 2.2٪ إلى 2.7 ± 0.8٪ من التوسع CUG غير طبيعي في GFP-CUG200 (الشكل 1C). تم احتساب مؤشر الانصهار ومنطقة myotube مركزيا عبر عدد من النوى في myotubes (≥ 2 نوى) مقسوما على العدد الكلي للنواة، والنسبة المئوية من المساحة الكلية للصورة عن طريق myotubes مغطاة، على التوالي. وأجريت في الوقت الحقيقي RT-PCR 10 لتحليل التعبير لعدد من العضلات المختلفةالجينات المرتبطة ينتقم منها MyoD، MyoG، Mef2c وCelf1. مقارنة CUG5 الثقافات، وزيادة CUG200 التعبير عن Celf1 مرنا في المتكاثرة myoblasts في بداية التمايز. تنسجم مع التقارير السابقة، وارتبط Celf1 upregulation مع CUG التوسع في عضلي ضمور 1 (1D الشكل). رقي وعلاوة على ذلك، والغربية النشاف 10 أظهرت باستمرار مستوى البروتين Celf1 (الشكل 1E)، وCUG200 تحول دون التعبير عن MyoD، MyoG وMef2c خلال التمايز (1D الشكل). وتشير هذه النتائج إلى أن التوسع CUG يؤدي إلى myotube مركزيا عيوب وضعف التمايز بالخلايا العضلية الجذعية.
لدراسة دور Celf1 في التمايز بالخلايا العضلية الجذعية، شيد pMSCV- Celf1Flag ناقلات فيروسات لتنبيغ الخلايا C2C12. وكان يتم تجميع الحيوانات المستنسخة المقاومة للبوروميسين 10 للدراسات التمايز. وأظهرت النتائج طخة غربية أن العلم تاكان gged Celf1 الحاضر فقط في الثقافات pMSCV-Celf1Flag transduced وupregulated التعبير عن بروتين Celf1 (الشكل 2A). تشكيل myotubes في Celf1-overexpressing خلايا نادرة بالمقارنة مع الثقافات التحكم (الشكل 2B)، مما يوحي بأن overexpression من Celf1 يضعف بشدة بالخلايا العضلية الجذعية التمايز.
لتحديد ما إذا Celf1 ضربة قاضية تنقذ نقص التمايز في الخلايا CUG التوسع، وتم تسليم Celf1 shRNA إلى خلايا GFP-CUG200 بواسطة ناقلات lentiviral. وقد تم اختيار استنساخ مقاومة مزدوجة (G418 وبوروميسين) وتجميع للدراسات التمايز. تم تخفيض مستوى البروتين Celf1 الذاتية بشكل ملحوظ في ظل وجود Celf1 shRNA (الشكل 3A). بعد 6 أيام من التمايز، وكان تأثير Celf1 shRNA على زيادة تكوين myotube مركزيا واضحا (الشكل 3B). مؤشرات الاندماج وmyotube مركزيا لكما كانت 16.1 ± 3.0٪ و 15.2 ± 1.2٪، على التوالي، مقارنة مع 4.6 ± 0.8٪ و 5.1 ± 1.3٪ في الثقافات التحكم (الشكل 3C). وفي الوقت نفسه، تشير النتائج في الوقت الحقيقي RT-PCR أن التعبير عن MyoD، MyoG وMef2c وزيادة كبيرة في الخلايا Celf1 shRNA (الشكل 3D) دعم Celf1 ضربة قاضية انقاذ نقص العضلية التمايز.
الشكل 1. CUG-التوسع يحول دون العضلية التمايز في الخلايا C2C12. خلايا (A) C2C12 أعربت GFP-CUG5 أو GFP-CUG200 بتواجد مطلق بعد الاختيار. الحانات هي مقياس 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من ورقتنا السابقة (10). (ب) تشكلت Myotubes في الخلايا GFP-CUG5 لكن أقل في الخلايا GFP-CUG200. وتصور Myotubes من الميوسين السلسلة الثقيلة (MF-20) المناعية. الحانات هي مقياس 100 ميكرون. (C) (D) في الوقت الحقيقي تحليل RT-PCR من Celf1، النسخ عوامل MyoD، MyoG، والتعبير Mef2c خلال التمايز بالخلايا العضلية الجذعية. تم التخطيط مستويات مرنا بعد GAPDH تطبيع. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. تم إجراء اختبار T الطالب على المقارنة بين اختبارات لضوابط. ن> 3، * P <0.05. (E) GFP-CUG200 زيادة ترنسفكأيشن Celf1 تعبير البروتين. يظهر SS-الأكتين كما تحكم التحميل. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. overexpression من Celf1 يضعف بالخلايا العضلية الجذعية التمايز. (أ) إثبات expre Celf1Flag خارجيssion في الخلايا C2C12 لطخة غربية. كان لديه عجز تشكيل (ب) myotube مركزيا في Celf1Flag-overexpressing myoblasts C2C12. وتصور Myotubes التي كتبها MF-20 المناعية. الحانات هي مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ضربة قاضية من Celf1 جزئيا تنقذ CUG-التوسع الناتج عن بالخلايا العضلية الجذعية التمايز نقص. (أ) إثبات Celf1 ضربة قاضية لطخة غربية. (ب) Celf1 shRNA الناجم عن تشكيل myotube مركزيا في myoblasts GFP-CUG200. وتصور Myotubes التي كتبها MF-20 المناعية. الحانات هي مقياس 100 ميكرون الخلايا. (C) Celf1 shRNA انقاذ التي زادت المناطق مؤشر الانصهار وmyotube مركزيا. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. (D) في الوقت الحقيقي تحليل RT-PCR من Celf1، النسخ عوامل MyoD، MyoG، والتعبير Mef2c خلال التمايز. وقد تآمر مستوى مرنا بعد تطبيع إلى أن من GAPDH. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. تم إجراء اختبار T الطالب على المقارنة بين الاختبارات لمراقبة. ن> 3، * P <0.05. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم استخدام خط الخلية C2C12 كنموذج لدراسة تكون العضل 11-14. هذه الخلايا تحتفظ نظرة تشبه الخلايا الليفية، تتكاثر بسرعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ الجنين المصل البقري والتفريق بسهولة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 2٪ مصل الخيول 15. نمو سريع والتمايز هي الخصائص مفيدة في نموذج خلية تكون العضل. هنا، ونحن لشرح استخدام البلازميد، فيروسات، وناقلات lentiviral لتقديم كدنا]، 3'-UTR، وshRNA إلى خلايا C2C12. ويسلط الضوء على النقاط الحرجة لترنسفكأيشن / تنبيغ وصيانة الاتساق في التمايز أدناه.
كثافة الخلية في صيانة الخلايا اليومية أمر بالغ الأهمية. لا بد من مثقف أقل من 50 هذه الخلايا - 70٪ التقاء. ويرجع ذلك إلى وقت قصير السكان مضاعفة، يميز التقاء عالية (> 70٪) ثقافة C2C12 بشكل عفوي عندما ترك بين عشية وضحاها. في حين أن جزء من خلايا متباينة بشكل عفوي قد تكون صغيرة، وجودمن خلايا متمايزة سيسهم في التناقضات في التجارب التمايز اللاحقة. ويفضل خلايا C2C12 بالإضافة إلى ذلك، تحسنت حديثا أن لديهم انخفاض عدد مرور. للتمايز، ومطلي الخلايا في أرقام محددة مسبقا بحيث تصل التقاء كامل بعد 24 ساعة. يتم الاحتفاظ الأنسولين المجمدة في قسامات صغيرة ويضاف في كل مرة يتم تغيير متوسطة التمايز. هذه التدابير تحسين نتائج المفاضلة.
متوسطة الحرة في الدم يعزز C2C12 خلية ترنسفكأيشن. الخلايا يمكن المحتضنة في ترنسفكأيشن / خليط سائل الإعلام الحرة المصل بين عشية وضحاها. في المختبر، ونحن تحقيق ما يصل إلى معدل ترنسفكأيشن 20٪، يرافقه إشارات طفيفة للخلايا. تركيز دواء يستخدم لتحديد خلية C2C12 أعلى، 1،2-1،6 ملغ / مل G418 أو 1-3 ميكروغرام / مل بوروميسين، ومدة اختيار أطول من معظم خطوط الخلايا الأخرى. بسبب السمية المحتملة في ظل تركيز الدواء عالية وفترة حضانة طويلة، الكثير إلى الكثيرقد تنشأ التباين في إمكانية التمايز. ومن الأهمية بمكان ضبط نظام التحديد (تركيز والمدة) على أساس المظهر الخلية ولعلاج التجربة و مجموعة المراقبة معا.
وأدخلنا بنجاح GFP-CUG200 إلى خلايا C2C12 التي تتكاثر 3'-UTR التوسع CUG في DM1. وسمحت بإدخال Celf1 إلى خلايا C2C12 وCelf1 shRNA إلى خلايا GFP-CUG200 C2C12 تقييم الأحداث الخلوية والجزيئية الناجمة عن Celf1 upregulation والتنقيب عن استهداف Celf1 للمساعدة DM1 بالخلايا العضلية الجذعية التمايز، على التوالي. وباختصار، فإن نموذج بالخلايا العضلية الجذعية C2C12 المقدمة هنا يفيد التحقيق من الضمور العضلي وكذلك عام بيولوجيا الخلايا العضلية وتمايز عضلي. الحد من هذا النموذج هو أن النتائج في خطوط الخلايا قد لا تمتد تماما للكائنات الحية. وغالبا ما تقدم هذه النتائج في النماذج الحالية لعزل myoblasts جديدة من الحيوانات ودراسة فارق بهمنشوئها. في نهاية المطاف نحن استنتاجاته بالخلايا العضلية الجذعية في الكائنات الحية.
القوة الفريدة لهذه الدراسة هي التلاعب الجيني متعدد المستويات في myoblasts C2C12، والتي تمكن النمذجة الأحداث المتتابعه الوراثية / المرضية في DM1. سابقا، وقد تم توثيق تأثير الحمض النووي الريبي سمية التوسع DMPK CUG في myoblasts 11-14، في حين أن أدوار المرضية من Celf1 تمت دراستها على حدة في نماذج الماوس 16،17. نمذجة هذه الأحداث المرضية / الجينية المتتابعة هي صعبة وتستغرق وقتا طويلا إذا أجريت في النماذج الحيوانية من الناحية الفنية. كما هو موضح في هذه الدراسة، والجمع بين استخدام علامات مقاومة الفلورسنت والمخدرات يسمح للنمذجة الأحداث الجزيئية إضافية في الضمور العضلي. إن النماذج التي أنشئت في هذه الدراسة أن تكون مفيدة في تشريح آليات مفصلة في DM1 المرضية. فإنها أيضا تكون ذات قيمة في الكشف عن المخدرات التي تستهدف مختلف خطوات DM1 المرضية. استراتيجيات وإجراءات هذاالدراسة قد تلقي الضوء على وضع نماذج للأمراض العضلات الأخرى في myoblasts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
