Summary
このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。
Abstract
筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、筋ジストロフィーの一般的な形式です。いくつかの動物モデルは、DM1のために確立されてきたが、彼らは細胞および分子事象を研究するための効率的な細胞の代替を提供するので、筋芽細胞モデルは依然として重要です。 C2C12筋芽細胞は広く遺伝子トランスフェクション、またはウイルス形質導入に筋形成、抵抗性を研究するために使用されているが、C2C12細胞の研究を妨げています。ここでは、C2C12筋芽細胞および筋細胞分化の誘導に遺伝子を導入するために日常のメンテナンス、トランスフェクションおよび形質導入手順が含まれて最適化されたプロトコルを記述します。まとめると、これらの手順は、最高のトランスフェクション/形質導入効率を可能にするだけでなく、一貫性の分化の結果。筋緊張性ジストロフィーの研究だけでなく、他の筋肉疾患に利益をもたらすDM1筋芽細胞モデルの確立に記載されているプロトコル。
Introduction
筋強直性ジストロフィー（DM）は、複数のシステム、最も特に心臓および骨格筋1に影響を与える常染色体優性疾患です。この病気、DM1とDM2の2つのサブタイプがあります。 DM1は、より一般的であり、DM2 2よりも深刻な症状を持っています。 DM1の根底にある遺伝的変異は、DMプロテインキナーゼ遺伝子（DMPK）3の3 '非翻訳領域（UTR）に位置するCUGトリプレットリピートの拡大です。影響を受けていない個体でのCUG繰り返し数は対照的に、5から37まで変化し、それが50以上に、そして時にはDM1患者4で数千にまで増加します。その結果、のようなRNA結合タンパク質、マッスルのような1（MBNL1）、CUGBP、及びELAV様ファミリー1（Celf1）、誤調節されています。拡大CUGリピート上の隔離に、MBNL1は、選択的スプライシング5を調節する能力を失います。 Celf1が、一方、6,7アップレギュレートされています。 Celf1の過剰発現は、筋肉の損失に関連付けられていますMBNL1機能の喪失に起因しておらず、衰弱、。 DMPK 3'-UTR CUG拡張、MBNL1の損失、およびCelf1の過剰発現を含むDM1関連の変化をシミュレートする動物モデルは、確立されています。しかし、筋芽細胞にDM1をモデル化することは、特にDM1に関連する細胞および分子事象を解剖するために、効率的な代替手段を提供しています。
C2C12筋芽細胞株は、最初に負傷したC3Hマウスの筋肉から単離され、広く筋原性分化8,9を研究するために使用しました。 C2C12細胞は急速にウシ胎児血清（FBS）培地を含有して増殖し、容易にFBSが枯渇したとき分化を受けます。しかし、この筋芽細胞分化モデルを使用して2つの課題を提示する：C2C12細胞は、多くの場合、遺伝子導入/形質導入、ウイルスに対して耐性です。および細胞取り扱いおよび分化手順のわずかな変動は、筋管形成の著しい変化につながることができます。
私たちの研究室では、日常的に交流としてC2C12筋芽細胞を使用していますエル・モデルと効果的C2C12細胞株10へのプラスミドのトランスフェクション、レトロウイルス形質導入、およびレンチウイルス形質導入によって遺伝子を送達プロトコルを開発しました。ビデオでは、我々は/トランスフェクトC2C12細胞に形質導入し、DM1の筋芽細胞モデルの確立に分化一貫性を維持するための最適化された手順を示しています。
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Protocol
1. C2C12細胞培養
- 20％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充した増殖培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中で100mMのプレートでC2C12マウス筋芽細胞を維持します。 60％コンフルエント - C2C12継代細胞が約50になることを許可します。
- 増殖培地を廃棄3 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でC2C12細胞を洗浄します。 PBSを削除し、細胞を剥離するために、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 5分- 37°C、3、5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。
- 3mlの増殖培地を添加することによりトリプシンを中和します。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。新規の100mmプレートに懸濁させ、細胞1 mlを加え、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
2. C2C12細胞トランスフェクション/形質導入および選択
- C2C12のプラスミドトランスフェクション
- トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。
注：これは50につながる - トランスフェクションの時点で60％コンフルエンス。 - トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。
- 簡単に予熱した無血清培地と渦を200μlにプラスミドDNA（GFP-CUG5またはGFP-CUG200）2μgのを追加します。培地に6μlのトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスを用いて30秒間、すぐに混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。
- 2.5ミリリットルの無血清増殖培地にC2C12細胞のメディアを変更します。インキュベーション後、細胞にトランスフェクション混合物を追加します。 5％CO 2、37℃のインキュベーターにプレートを返します。
- 4時間または一晩までのトランスフェクション混合物/無血清増殖培地中で細胞を保管してください。翌日バック増殖培地へのメディアを変更するか、または細胞傷害性は明らかであるとき。
注：細胞毒性は、CEの顕微鏡検査によって評価されますLLS。細胞の形態と細胞の剥離の変化を観察します。限り、明白な細胞毒性がないように、無血清増殖培地中で一晩インキュベートし、トランスフェクションを増強します。 - （プラスミドなしでトランスフェクト）コントロール培養物は、生細胞を持っていないまで、10日〜のために1.6mg / mlのG418 - 1.2を追加することによって、細胞をトランスフェクション後48時間を選択します。 G418を補充した成長培地で2日毎に培地を変更します。
- その後の実験のために、37℃で増殖培地および5％CO 2でG418耐性細胞を維持します。
- トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。
- レトロウイルスの調製およびC2C12レトロウイルス形質導入
- 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM高グルコースを補充することによりHEK 293培地を準備します。
- 約24時間のトランスフェクションの前に、100ミリメートルプレート（トランスフェクション80％コンフルエンス）に4.0×10 6エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞をプレートContaining細胞培養培地。
- トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。
- 1ミリリットルの無血清増殖培地中で15μgのプラスミドDNA（のpMSCV-PuroのかのpMSCV-Celf1Flag-プーロ）を混ぜます。簡単にボルテックス。 DNA /無血清増殖培地チューブにステップ2.2.2から30μlのトランスフェクション試薬を追加し、ボルテックスを用いてよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。
- エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。静かにプレートを旋回し、5％CO 2、37℃のインキュベーターに戻し、それらを返します。 24時間後、10ミリリットル予め温めた新鮮な増殖培地にメディアを変更します。
- 上清（含むレトロウイルス）ピペットを用いてトランスフェクションの48時間後に収穫し、50mlの遠心チューブに上清を移します。プレートに新しい暖かいメディアの10ミリリットルを加え、インキュベーターに戻します。 4℃で上清を保管してください。
注：メディアはトンに静かに追加されます彼は井戸の側細胞単層を破壊しないように。 - トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収穫し、2.2.5からの上清と、それをプールします。細胞破片を除去するために7分間500×gで、4℃で遠心分離します。
- 新しい50ミリリットルの遠心管に上清を移します。 2.2.9またはアリコートに進み、将来の使用のために-20℃で上清を保存するために進むことによって、この時点でC2C12細胞を形質導入するためにレトロウイルスを使用してください。
- 凍結ストックがここで使用されている場合、室温で2.2.7からレトロウイルスを解凍します。
注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 - 合流の40％ - 30を目指し伝達の同じ日にC2C12細胞をプレート。
- 増殖培地を捨て、3ミリリットルの室温PBSでC2C12細胞を洗います。 PBSを削除し、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加し、37°C、3、5％CO 2インキュベーター内でプレートをインキュベートする- 5分。
- 3ミリリットルの成長MEDを追加することにより、トリプシンを中和イウム。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。血球計数器を用いて細胞を数え、60ミリメートルプレートに8.0×10 5 C2C12細胞を追加します。
- 3ミリリットル成長培地中の細胞の1 60ミリメートルプレートを感染させるために0.5ミリリットルレトロウイルスを追加します。インキュベーターにプレートを返します。
- （ - 3 / mlのピューロマイシン1）感染後48時間で3ミリリットル選択抗生物質を補った新鮮な培地と交換してください。形質導入されていないC2C12制御文化が出て死ぬまで〜5日間、毎日抗生物質を含む培地3ミリリットルを交換してください。
- 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM高グルコースを補充することによりHEK 293培地を準備します。
- レンチウイルスの調製およびC2C12のレンチウイルス形質導入
注：バイオセーフティレベル2キャビネット内のすべてのレンチウイルス関連の手順を実行し、生物学的安全性のガイドラインに従ってください。ウイルスを含有する液体廃棄物は、廃棄前に消毒する必要があります。- 10％の胎児を補充したHEK 293細胞培地（DMEM高グルコース100ミリメートルプレート（〜トランスフェクションの日に80％コンフルエント）でプレート4.0×10 6個の293T細胞を、ウシ血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン）トランスフェクション前に24時間。
- 室温へのトランスフェクション試薬を温めます。 8μgのレンチウイルス導入ベクターと一緒にレンチウイルスパッケージングベクター（4μgのpMD2.Gと6μgのpsPAX2）ミックス（Celf1のshRNAをまたは対照shRNAをスクランブル）1ミリリットルの無血清細胞培養培地中。簡単にボルテックス。
- DNA / DMEMチューブに36μlの予熱したトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスでよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。
- インキュベーターから293T細胞を除去し、プレートにトランスフェクション混合物を追加します。静かにプレートを旋回し、戻って5％CO 2、37℃インキュベーターにそれを返します。 24時間後、10ミリリットルの新鮮な培地でトランスフェクション混合物を交換してください。
- トランスフェクション後にレンチウイルスの48時間を含む上清を収集し、50ミリリットルの遠心分離管にそれを転送します。プレートに10ミリリットル新しい暖かいメディアを追加し、それを返しますインキュベーターへ。 4℃で上清を保管してください。
- トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収集し、2.3.5からの上清とそれを組み合わせます。 7分間500×gで、4℃で遠心分離簡単。
- 新しい50ml遠心管に上清を移します。新鮮なウイルスを使用している場合は、2.3.9に進みます。将来の使用のために、店舗の10ミリリットルの分注して-20℃で上清をウイルス含有。
- 凍結ストックが使用される場合、使用前に室温2.3.7からウイルスを解凍。
注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 - （2.1節）で得られたプレートC2C12-CUG200細胞の形質導入の同じ日に2.2.9で説明したように。
注：30を目指して - コンフルエンスの40％。 - C2C12-CUG200の60ミリメートルプレートに感染し、インキュベーターにプレートを返すために、0.5ミリリットルのウイルスを追加します。
- 形質導入後72時間 - 選択抗生物質（3 / mlのピューロマイシン1）を補った新鮮な培地と培養液を交換してください。すべての形質導入されていないC2C12-CUG200制御文化が出て死ぬまで〜5日間の選択抗生物質で培養培地を毎日更新します。
- GFP-CUG200トランスフェクションした細胞でCelf1ノックダウンを確認するために、ウエスタンブロットを使用してください。
3. C2C12細胞の分化
- プレート分化の開始前に、2.5ミリリットルの増殖培地24時間で6ウェルプレートの1ウェル中の2×10 6個の細胞。
注：完全なコンフルエンスが24時間で達成されるように、プレーティング密度を調整することができます。- PBSでコンフルエント細胞をリンスし、低血清分化培地2.5 mLを加え（2％ウマ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1μMインスリン） 。 2日毎に培地を交換してください。
注：凍結ストックのインスリンを保持し、各培地交換時にメディアに追加します。
- PBSでコンフルエント細胞をリンスし、低血清分化培地2.5 mLを加え（2％ウマ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1μMインスリン） 。 2日毎に培地を交換してください。
- C2C12分化の間に、泉のためのサンプルを収集titative以下の時点でのRT-PCR（セクション4を参照してください）：Day0、1、2、4、6日目に免疫染色のための培養6.プロセス - 8（第5節参照）。
4. RNAの単離および定量的RT-PCR
- RNA単離のために、製造業者のプロトコルを使用してください。単離後、30μlのRNaseフリー水でRNAペレットを再懸濁し、上下に数回をピペットと。
注：サンプルは、定量的RT-PCRに進むか、または-80℃で保存することができます。 - 定量的RT-PCR 10のためのRT定量PCRキットを使用し、製造元の指示に従ってください。 表1に従って反応ミックスを調製します。
| 成分 | 容量（μL） | 最終濃度 |
| 2×反応緩衝液 | 10 | 1倍 |
| フォワードプライマー | 0.5 | 200 nMの |
| リバースプライマー | 0.5 | 200 nMの |
| プローブ | 0.5 | 200 nMの |
| 転写酵素＆RNアーゼ阻害剤を逆に | 0.1 | 0.25 U / mlの |
| テンプレート | 1 | 100 ngの全RNA |
| RNaseを含まない水 | 7.4 | NA |
| 合計ミックス | 20 |
表1定量的RT-PCRマスターミックス調製
- 熱プロファイルの表2を用いて、20μlのRT-qPCRの反応を実行します。
| 逆転写ステップ | 30分間、48°C |
| DNAポリマーアーゼ活性化/逆転写酵素の不活化 | 10分間、95°C |
| 40サイクル | 15秒、95°C |
| 1分、60°C |
表2の定量的RT-PCR温度プロファイル
5.免疫染色
- たて10分間室温で4％パラホルムアルデヒド/ PBSを用意し2.5ミリリットルで単層培養を修正しました。
- 室温で30分間、2.5 mlの0.1％トリトンX-100 / PBSで試料を透過。
- 加湿チャンバーにサンプルを転送します。 37℃で30分間、緩衝液（0.1％の非イオン性界面活性剤/ PBS、10％正常ヤギ血清）でブロッキング2.5 ml中にサンプルを遮断します。
- ブロッキングバッファーを捨て、バッファ（1：100）をブロックで希釈したミオシン重鎖に対して800μlの一次抗体を適用します。室温で一晩加湿チャンバー内でインキュベートします。
- プレート3ティムを洗います2日目に2.5ミリリットルの洗浄緩衝液（0.1％ポリソルベート20 / PBS）とエス（各10分）。
- 洗浄バッファーを削除し、800μlの二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、1：PBSで希釈した500）を適用します。 1時間室温で加湿チャンバー内でインキュベートします。
- 2.5ミリリットル洗浄緩衝液で2回（各10分）を洗浄します。
- 5分間（1μgの/ mlの蒸留脱イオンH 2 Oで希釈）800μlのDAPIと共にインキュベートします。
- 10分間再び2.5ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄します。
- 2.5ミリリットルのPBSに洗浄緩衝液を変更し、イメージをキャプチャするために、蛍光顕微鏡を使用しています。
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Representative Results
C2C12細胞を、GFP-CUG5またはGFP-CUG200でトランスフェクトしました。薬剤耐性の選択の後、安定したプールは、GFP発現（ 図1A）によって可視化することができる、確立しました。分化した筋芽細胞における筋管形成は、10（ 図1B）を免疫染色重鎖ミオシンによって検出しました。筋管形成の定量化は、融合指数は2.6±1.1％に35.4±4.1％から減少し、筋管領域は、GFP-CUG200（ 図1C）に異常CUG拡大により2.7±0.8％に35.6±2.2％から減少したことを実証しました。融合インデックス及び筋管領域が核の総数は、それぞれ、筋管で覆われた総画像面積の割合で割った筋管（≥2核）における核の総数を介してカウントしました。リアルタイムRT-PCR 10は、異なる筋肉の数の発現を分析するために行きました。MyoD、MyoG、MEF2CとCelf1含むiation関連遺伝子。 CUG5培養物と比較して、CUG200は、分化の開始時に筋芽細胞の増殖にCelf1 mRNAの発現を増加させました。以前の報告と一致、Celf1のアップレギュレーションは、筋原性ジストロフィー1（ 図1D）にCUG-拡大と関連していました。さらに、ウェスタンブロッティング10は一貫して示したCelf1タンパク質レベルは、（ 図1E）上昇、およびCUG200は、分化（ 図1D）の間のMyoD、MyoGとMEF2Cの発現を阻害しました。これらの結果は、CUG-拡大が欠陥および減損筋芽細胞分化を筋管につながることを示唆しています。
筋芽細胞分化におけるCelf1の役割を研究するために、pMSCV- Celf1Flagレトロウイルスベクターは、C2C12細胞を形質導入するために構築した。10ピューロマイシン耐性クローンが分化の研究のためにプールしました。ウエスタンブロット結果は、旗-TAgged Celf1はのpMSCV-Celf1Flag形質導入された培養物中にのみ存在し、Celf1タンパク質の発現は、（ 図2A）をアップレギュレートされました。 Celf1の過剰発現は厳しく筋芽細胞分化を阻害することを示唆している対照培養（ 図2B）と比較した場合Celf1過剰発現細胞における筋管の形成は稀です。
Celf1ノックダウンは、CUG-拡張細胞に分化欠乏を救出するかどうかを判断するには、Celf1のshRNAは、レンチウイルスベクターによりGFP-CUG200細胞に送達しました。ダブル耐性クローン（G418およびピューロマイシン）が分化研究のために選択し、プールしました。内因性Celf1タンパク質のレベルは顕著Celf1のshRNA（ 図 3A）の存在下で還元しました。分化の6日後に、増加筋管形成にCelf1 shRNAの効果は、（ 図3B）が明らかでした。フュージョン指標と筋管は、4.6±0.8％と対照培養物（ 図3C）で5.1±1.3％に比べ、それぞれ16.1±3.0％および15.2±1.2％でした。一方、リアルタイムRT-PCRの結果は、MyoDの、MyoGとMEF2Cの発現が有意Celf1ノックダウン救出筋細胞分化の欠乏をサポートCelf1のshRNA細胞（ 図3D）に増加したことを示唆しています。
図1. CUG-拡張は、C2C12細胞における筋細胞の分化を抑制する。 （A）C2C12細胞を選択した後、遍在GFP-CUG5またはGFP-CUG200を表明しました。スケールバーは100μmです。この図は、私たちの前の紙10。（B）筋管から変更されているGFP-CUG200細胞に少ないGFP-CUG5細胞内に形成されたが。筋管は、重鎖（MF-20）、免疫染色をミオシンによって可視化しました。スケールバーは100μmである。（C） 。（D）Celf1のリアルタイムRT-PCR分析は、転写が筋芽細胞分化の間のMyoD、MyoG、およびMEF2C発現因子。 mRNAレベルは、GAPDH正規化された後にプロットしました。エラーバーは標準偏差を表します。スチューデントT検定は、対照と実験を比較しました。 nは> 3、* P <0.05。（E）GFP-CUG200トランスフェクションは、Celf1タンパク質の発現を増加させました。 β-アクチンをローディングコントロールとして示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Celf1損なう筋芽細胞分化の図2.過剰発現。外因性Celf1Flagのexpreの（A）証明ウェスタンブロットによるC2C12細胞におけるssion。（B）筋管形成はCelf1Flag過剰発現C2C12筋芽細胞で損なわれました。筋管は、MF-20の免疫染色により可視化しました。スケールバーは100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Celf1部分的に救助CUG-拡張誘起筋芽細胞分化不全の 図3 ノックダウン。 GFP-CUG200筋芽細胞における（A）、ウェスタンブロットによりCelf1ノックダウンの証明。（B）Celf1のshRNA誘導された筋管形成。筋管は、MF-20の免疫染色により可視化しました。スケールバーは、融合指標と筋管面積を増加した100ミクロン（C）Celf1のshRNA-レスキュー細胞です。エラーバーは標準偏差を表します。（D）Celf1のリアルタイムRT-PCR分析は、転写、分化中のMyoD、MyoG、およびMEF2C発現因子。 mRNAレベルは、GAPDHのものに正規化した後にプロットしました。エラーバーは標準偏差を表します。スチューデントT検定を制御するための実験を比較しました。 nは> 3、* P <0.05。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
C2C12細胞株は、筋形成11-14を研究するためのモデルとして使用されてきました。これらの細胞は、線維芽細胞様の外観を保持し、20％ウシ胎児血清を含む培地中で急速に増殖し、容易に2％ウマ血清15を含む培地中で分化します。速い増殖および分化は、筋形成細胞モデルにおいて有利な特性です。ここでは、C2C12細胞にcDNAを、3'-UTR、およびshRNAをを導入するプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクターの使用を実証します。トランスフェクション/形質導入および分化の一貫性の維持のための重要なポイントは以下の強調表示されます。
毎日の細胞の維持における細胞密度が非常に重要です。 70％コンフルエンス - これらの細胞は、50の下で培養される必要があります。一晩放置したときにより短い集団倍加時間に、高合流（> 70％）C2C12文化が自然に分化します。自然発生的に分化した細胞の割合は小さいかもしれないが、存在分化した細胞のその後の分化実験の不一致に貢献していきます。さらに、低継代数を有する新たに解凍したC2C12細胞であることが好ましいです。それらは24時間後に完全なコンフルエンスに到達するように分化するために、細胞を、予め決定された数で播種されます。インスリンは、小アリコートで凍結保存し、分化培地が変更されるたびに追加されます。これらの措置は、分化の成果を向上させます。
無血清培地は、C2C12細胞のトランスフェクションを増強します。細胞は、トランスフェクション混合物/無血清培地で一晩インキュベートすることができます。私たちの研究室では、細胞毒性のわずかな兆候を伴う20％のトランスフェクション率、最大達成します。 C2C12細胞を選択するために使用される薬剤の濃度は、ピューロマイシン1~3 / mlのより高い、1.2〜1.6 mg / mlでのG418かで、選択の持続時間が長く、ほとんどの他の細胞株よりなります。高い薬物濃度および拡張インキュベーション時間下で潜在的な毒性のために、ロット分化能の変動が生じ得ます。細胞の外観に基づいて選択方式（集中と持続時間）を調整するために、実験群と対照群を一緒に治療することが重要です。
我々は成功しDM1で3'-UTR CUG展開を再現するC2C12細胞にGFP-CUG200を導入しています。 GFP-CUG200 C2C12細胞にC2C12細胞とCelf1のshRNAにCelf1を導入することは、それぞれ、DM1の筋芽細胞分化を助けるためにCelf1をターゲットのCelf1のアップレギュレーションおよび探査によってトリガー細胞および分子事象の評価を可能にしました。要約すると、ここで提示したC2C12筋芽細胞モデルは、筋緊張性ジストロフィーの調査だけでなく、一般的な筋細胞生物学および筋原性分化に利益をもたらします。このモデルの制限は、細胞株における所見は完全に生物を延長しないことです。現行モデルにおける知見は、多くの場合、動物から新鮮な筋芽細胞を単離し、それらの差異を研究に進められまする。最終的に我々は、生物における筋芽細胞の所見を実証します。
この研究のユニークな強さは、DM1におけるシーケンシャル遺伝的/病理学的事象をモデル化可能にする、C2C12筋芽細胞におけるマルチティア遺伝子操作です。 Celf1の病理学的役割を別々のマウスモデル16,17で研究しながら以前は、DMPK CUG拡張のRNA毒性効果は、筋芽細胞11-14に記載されていました。これらのシーケンシャル遺伝的/病理学的事象のモデリングは技術的に困難と時間動物モデルで実行した場合かかるものです。この研究で実証されるように、蛍光及び薬剤耐性マーカーとの併用は、筋強直性ジストロフィーにおける追加の分子事象のモデル化を可能にします。本研究で確立されたモデルは、DM1の病因における詳細なメカニズムを解剖するのに有用です。彼らはまた、DM1の病因の異なるステップを標的とする薬剤をスクリーニングするのに有益であろう。このの戦略と手続き研究では、筋芽細胞内の他の筋肉疾患モデルの確立に光を当てることがあります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
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