Summary
Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de modelos de mioblastos distrofia miotônica 1, incluindo otimizado manutenção C2C12 celular, transfecção gene / transdução e diferenciação dos miócitos.
Abstract
A distrofia miotônica 1 (DM1) é uma forma comum de distrofia muscular. Embora vários modelos animais foram estabelecidos para DM1, modelos celular de mioblastos ainda são importantes porque eles oferecem uma alternativa eficiente celular para estudar eventos celulares e moleculares. Embora as células C2C12 de mioblastos tem sido amplamente utilizado para estudar a miogenese, a resistência à transfecção do gene, ou a transdução virai, dificulta a pesquisa em células C2C12. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado que inclui procedimentos de manutenção diária, transfecção e transdução para introduzir genes em mioblastos C2C12 e a indução de diferenciação dos miócitos. Colectivamente, estes processos permitem melhores eficiências de transfecção / transdução, bem como os resultados consistentes de diferenciação. O protocolo descrito no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1 celulares beneficiaria o estudo de distrofia miotónica, bem como outras doenças musculares.
Introduction
Distrofia miotônica (DM) é uma doença autossômica dominante que afeta vários sistemas, principalmente músculos cardíacos e esqueléticos 1. Existem dois subtipos da doença, DM1 e DM2. DM1 é mais comum e tem uma manifestação mais grave do DM2 2. A mutação genética subjacente DM1 é uma expansão de repetições de tripletos CUG localizado na região não traduzida 3 '(UTR) do gene da proteína quinase MS (DMPK) 3. O número de repetição CUG em indivíduos não afectados varia de 5 a 37. Por outro lado, aumenta a mais de 50, e, por vezes, até milhares em doentes DM1 4. Como resultado, as proteínas de ligação a ARN, tais como muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP, e elav-1 como família (Celf1), são desregulada. Devido ao sequestro nas repetições CUG expandidas, MBNL1 perde a sua capacidade de regular a splicing alternativo 5. Celf1, por outro lado, é sobre-regulada 6,7. A sobre-expressão de Celf1 está associada com a perda de músculoe fraqueza, que não são atribuídos a perda da função MBNL1. Os modelos animais simulando alterações relacionadas-DM1, incluindo DMPK 3'-UTR expansão CUG, perda de MBNL1, e superexpressão de Celf1, foram estabelecidas. No entanto, a modelagem DM1 em mioblastos oferece uma alternativa eficiente, especialmente para dissecar eventos celulares e moleculares relacionados-DM1.
A linha celular de mioblastos C2C12 foi isolado pela primeira vez a partir de músculo de rato C3H feridos e amplamente utilizado para estudar diferenciação 8,9 miogénica. células C2C12 proliferam rapidamente em soro fetal bovino (FBS) molecular contendo meios e prontamente sofrer diferenciação de FBS quando se esgota. No entanto, usando este modelo de diferenciação de mioblastos apresenta dois desafios: células C2C12 são muitas vezes resistentes a transfecção de genes / transdução viral; e pequenas variações na manipulação celular e processo de diferenciação pode levar a alterações marcadas na formação de miotubos.
Nosso laboratório utiliza rotineiramente mioblastos C2C12 como acmodelo ell e desenvolveu protocolos que efetivamente entregar genes por transfecção de plasmídeo, transdução retroviral, e transdução lentiviral em linha celular C2C12 10. No vídeo, demonstramos os procedimentos otimizados para transfecção / transdução C2C12 células e manter a consistência diferenciação no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura celular C2C12
- Manter mioblastos de ratinho C2C12 em uma placa de 100 mm de meio de crescimento (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado com soro de bovino fetal a 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. Permitir células C2C12 passadas para tornar-se cerca de 50 - 60% confluentes.
- Descartar o meio de crescimento e células C2C12 lavar com solução salina de 3 ml à temperatura ambiente de fosfato tamponada (PBS). Remover o PBS e adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA para desprender as células. Colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 3-5 min.
- Neutralizar a tripsina, adicionando meio de crescimento de 3 ml. Pipetar 6 - 8 vezes para suspender as células. Adicionar 1 ml de suspensão de células para uma nova placa de 100 mm e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2.
2. C2C12 transfecção celular / transdução e Seleção
- C2C12 transfecção de plasmídeo
- 24 h antes da transfecção, pfinal 7,0 x 10 5 células C2C12 para um poço de uma placa de seis poços para cada transfecção.
Nota: Isto conduz a 50 - 60% de confluência no momento da transfecção. - Permitir que o reagente de transfecção de vir até à temperatura ambiente antes de usar.
- Adicionar 2 ug de ADN de plasmídeo (GFP-CUG5 ou GFP-CUG200) em 200 ul de pré-aquecido meio isento de soro e vortex brevemente. Adiciona-se reagente de transfecção 6 ul para a forma e misturar imediatamente durante 30 segundos usando um vórtice. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente.
- Mudar os meios de comunicação das células C2C12 de 2,5 ml de meio de crescimento isento de soro. Adicionar a mistura de transfecção às células após a incubação. Devolver as placas para um 5% de CO2, 37 ° C incubadora.
- Manter as células em meio de crescimento da mistura de transfecção / isento de soro durante 4 horas ou até a noite. Mudança de mídia de volta para os meios de crescimento no dia seguinte ou quando citotoxicidade é aparente.
Nota: A citotoxicidade é avaliada através de inspecção microscópica da cells. Observar as mudanças na morfologia celular e descolamento celular. Enquanto não existe uma citotoxicidade evidente, incubação durante a noite em meio de crescimento isento de soro aumenta a transfecção. - Seleccionar as células 48 horas após a transfecção por adição de 1,2-1,6 mg / ml de G418 para ~ 10 dias até que a cultura de controlo (transfectadas sem os plasmídeos) não tem células vivas. Alterar os meios de comunicação a cada dois dias com meio de crescimento suplementado com G418.
- Manter as células resistentes a G418 em meio de crescimento e 5% de CO2 a 37 ° C para as experiências subsequentes.
- 24 h antes da transfecção, pfinal 7,0 x 10 5 células C2C12 para um poço de uma placa de seis poços para cada transfecção.
- preparação de retrovírus e transdução retroviral C2C12
- Prepare meio de cultura de células HEK 293, completando DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina.
- Aproximadamente 24 horas antes da transfecção, 4,0 x 10 placa 6 células de empacotamento ecotrópicas HEK 293 com base em uma placa de 100 milímetros (80% de confluência em transfecção) Cmeio de cultura celular ontaining.
- Permitir que o reagente de transfecção de vir até à temperatura ambiente antes de usar.
- Misturar 15 ug de ADN plasmídeo (pMSCV-puro ou pMSCV-Celf1Flag-Puro) em 1 ml de meio de crescimento isento de soro. brevemente Vortex. Adicionar 30 ul de reagente de transfecção a partir do passo 2.2.2 para dentro do tubo de meio de crescimento de DNA / isento de soro, e misture bem com vórtex. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min.
- Adicionar gota a gota, a mistura de transfecção das células de empacotamento ecotrópico HEK 293 com base em. Agite suavemente as placas e devolvê-los de volta para o CO2 a 5%, 37 ° C incubadora. Após 24 h, alterar os meios de comunicação para meio de crescimento fresco 10 ml de pré-aquecido.
- Colher o sobrenadante (contendo retrovírus) 48 horas após a transfecção utilizando uma pipeta e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 ml. Adicionar 10 ml de novas mídias quentes para a placa e devolvê-lo para a incubadora. Manter o sobrenadante a 4 ° C.
Nota: A mídia é adicionado delicadamente para tele lado do poço de modo a não perturbar a monocamada celular. - Colher o segundo lote de sobrenadante 60 horas ap a transfeco e permitir a sua com o sobrenadante a partir de 2.2.5. Centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min para remover os detritos celulares.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. Use retrovírus para transduzir células C2C12 neste ponto por prosseguir para o passo 2.2.9 ou aliquota e armazenar o sobrenadante a -20 ° C para uso futuro.
- Descongelar o retrovírus de 2.2.7, à temperatura ambiente, se um lote congelado é usado aqui.
Nota: Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento. - Placa células C2C12 no mesmo dia de transdução apontando para 30 - 40% de confluência.
- Descartar o meio de crescimento e células C2C12 lavar com 3 ml de PBS temperatura ambiente. Remover o PBS, adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA, e incuba-se a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 3-5 min.
- Neutraliza-se a tripsina por adição de 3 mL de crescimento Medio. Pipetar 6 - 8 vezes para suspender as células. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e adicionar 8,0 x 10 5 células C2C12 para uma placa de 60 mm.
- Adicionar 0,5 ml de retrovírus para infectar uma placa 60 milímetros de células em 3 media ml crescimento. Retornar a placa para a incubadora.
- Substituir com 3 ml de meios frescos completados com antibiótico de selecção (puromicina 1-3 ug / ml) 48 h após a infecção. Substitua 3 ml de meio com antibióticos todos os dias para a 5 dias até que a cultura de controle C2C12 não transduzidas morre.
- Prepare meio de cultura de células HEK 293, completando DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina.
- preparação lentivírus e transdução lentiviral C2C12
Nota: Execute todos os procedimentos relacionados com o lentivírus no Nível de Biossegurança 2 gabinete e seguir as orientações de segurança biológica. resíduos líquidos contendo o vírus devem ser desinfectados antes de serem eliminados.- Placa de 4,0 x 10 6 células 293T em uma placa de 100 mm (~ 80% de confluência no dia da transfecção) com células HEK 293 de meio de cultura celular (DMEM de alto teor de glucose, suplementado com 10% de fetalde soro bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina) 24 h antes da transfecção.
- Aquecer o reagente de transfecção até à temperatura ambiente. Misturar os vectores de embalagem lentiviral (4 ug pMD2.G e 6 ug psPAX2) em conjunto com o vector de transferência de 8 ug de lentivírus (Celf1 shRNA controlo scrambled ou shRNA) em 1 ml de meio de cultura de células sem soro. brevemente Vortex.
- Adicionar 36 ul de reagente de transfecção pré-aquecido para o tubo de DNA / DMEM e misturar bem por vórtice. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min.
- Remover as células 293T da incubadora e adicionar a mistura de transfecção para a placa. Agite suavemente a placa e devolvê-lo de volta para 5% de CO2, 37 ° C incubadora. Após 24 horas, substitui-se a mistura de transfecção com 10 ml de meio de cultura fresco.
- Recolhe-se o sobrenadante contendo lentivírus 48 h após a transfecção e transferi-lo para um tubo de centrífuga de 50 ml. Adicionar 10 ml quentes novos meios para a placa e devolvê-lopara incubadora. Armazenar o sobrenadante a 4 ° C.
- Recolhe-se o segundo lote de sobrenadante 60 horas ap a transfeco e combiná-la com o sobrenadante a partir de 2.3.5. brevemente centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min.
- Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 ml fresco. Se estiver usando vírus fresco, avance para o passo 2.3.9. No futuro, a loja de vírus contendo o sobrenadante a -20 ° C em alíquotas de 10 ml.
- Descongelar o vírus a partir de 2.3.7, à temperatura ambiente antes da sua utilização, se um lote congelado é usado.
Nota: Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento. - células de chapa de C2C12-CUG200 (obtida na Secção 2.1), tal como descrito em 2.2.9, no mesmo dia da transdução.
Nota: Apontar para 30 - 40% de confluência. - Adicionar 0,5 ml de vírus para infectar uma placa de 60 mm de C2C12-CUG200 e devolver a placa à incubadora.
- Substituir o meio de cultura com meio fresco suplementado com o antibiótico de selecção (puromicina 1-3 ug / ml) 72 horas após a transdução.Atualizar meios de cultura todos os dias com o antibiótico de seleção para a 5 dias até que toda a cultura de controle C2C12-CUG200 não transduzidas morre.
- Use Western blot para verificar a knockdown Celf1 em células transfectadas GFP-CUG200.
3. Diferenciação Celular C2C12
- Placa 2 X 10 6 células em um poço de uma placa de 6 poços em 2,5 ml de meio de crescimento 24 h antes do início da diferenciação.
Nota: A densidade de revestimento pode ser ajustada de modo que confluência completa é atingida em 24 horas.- Lavar as células confluentes com PBS e adicionar 2,5 ml de meio de baixa diferenciação de soro (meio de Eagle modificado suplementado com 2% de soro de equino, penicilina 100 U / ml de Dulbecco, 100 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1? M de insulina) . Substituir o meio de dois em dois dias.
Nota: Mantenha a insulina estoque congelado e adicioná-lo para a mídia em cada mudança de meio.
- Lavar as células confluentes com PBS e adicionar 2,5 ml de meio de baixa diferenciação de soro (meio de Eagle modificado suplementado com 2% de soro de equino, penicilina 100 U / ml de Dulbecco, 100 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1? M de insulina) . Substituir o meio de dois em dois dias.
- Durante a diferenciação C2C12, coleta de amostras para quanquan- RT-PCR (ver secção 4) nos seguintes momentos: Day0, 1, 2, 4 e 6. Processo de cultura para a imunocoloração no dia 6-8 (ver secção 5).
4. Isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo
- Use o protocolo do fabricante para isolamento de RNA. Após o isolamento, ressuspender o sedimento de ARN em 30 de água livre de RNase mL e pipeta cima e para baixo várias vezes.
Nota: As amostras podem prosseguir para RT-PCR quantitativo, ou pode ser armazenado a -80 ° C. - Use um kit de RT qPCR para RT-PCR quantitativa 10 e siga as instruções do fabricante. Preparar a mistura de reacção de acordo com a Tabela 1.
| Componente | Volume (uL) | concentração final |
| tampão de reacção 2x | 10 | 1x |
| iniciador directo | 0,5 | 200 nM |
| iniciador inverso | 0,5 | 200 nM |
| Probe | 0,5 | 200 nM |
| Transcriptase reversa e RNase Inhibitor | 0,1 | 0,25 U / ml |
| Modelo | 1 | 100 ng de ARN total |
| RNase água livre | 7,4 | N / D |
| Mix total | 20 |
Tabela 1. RT-PCR quantitativo mestre preparação da mistura de
- Execute a 20 mL de reação RT-qPCR utilizando perfil térmico Tabela 2.
| passo de transcrição reversa | 30 min, 48 ° C |
| polímero de DNAactivação ase / inactivação transcriptase reversa | 10 min, 95 ° C |
| 40 ciclos | 15 seg, 95 ° C |
| 1 min, 60 ° C |
Tabela perfil térmico 2. RT-PCR quantitativo
5. A imunocoloração
- Fixar a cultura em monocamada em 2,5 mL preparada de fresco paraformaldeído a 4% / PBS à temperatura ambiente durante 10 min.
- Permeabilizar as amostras em 2,5 ml de 0,1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
- Transferir as amostras para uma câmara humidif içada. Bloquear as amostras em 2,5 ml de tampão (0,1% de surfactante não iónico / PBS, 10% soro normal de cabra) de bloqueio durante 30 minutos a 37 ° C.
- Descartar o tampão de bloqueio e aplicar primário 800 ul de anticorpo contra a cadeia pesada da miosina diluída em tampão (1: 100) de bloqueio. Incubar durante a noite numa câmara humidificada à temperatura ambiente.
- Lave a placa 3 timES (10 min cada) com 2,5 ml de tampão de lavagem (0,1% de polisorbato 20 / PBS) no dia 2.
- Remover o tampão de lavagem e aplicar 800 ul de anticorpo secundário (IgG de cabra anti-ratinho, 1: 500 diluído em PBS). Incubar numa câmara humidificada à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lavar duas vezes (10 min cada) com 2,5 ml de tampão de lavagem.
- Incubar com DAPI 800 ul (1 ug / ml, diluiu-se em água destilada desionizada H2O) durante 5 min.
- Lava-se com 2,5 ml de tampão de lavagem mais uma vez durante 10 min.
- Mudar o tampão de lavagem de 2,5 ml de PBS e usar um microscópio fluorescente para capturar as imagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
células C2C12 foram transfectadas com GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Após a selecção de resistência a drogas, estáveis piscinas foram estabelecidas, que podem ser visualizados por expressão da GFP (Figura 1A). Formação de miotubos diferenciadas nos mioblastos foi detectado por imunocoloração miosina de cadeia pesada 10 (Figura 1B). A quantificação de formação de miotubos demonstrou que os índices de fusão foram diminuiu de 35,4 ± 4,1% para 2,6 ± 1,1% e áreas de miotubos foram diminuiu de 35,6 ± 2,2% para 2,7 ± 0,8% por expansão CUG anormal em GFP-CUG200 (Figura 1C). O índice de fusão e a área de miotubos foram contados através do número total de núcleos em miotubos (@ 2 núcleos) dividido pelo número total de núcleos e a percentagem da área total coberta pela imagem miotubos, respectivamente. Em tempo real de RT-PCR 10 foi realizado para analisar a expressão de um número de diferentes músculogenes relacionados iation incluindo MyoD, MyoG, MEF2C e Celf1. Em comparação com culturas CUG5, CUG200 aumentou a expressão de ARNm Celf1 em mioblastos em proliferação no início da diferenciação. Congruente com relatórios anteriores, Celf1 regulação positiva foi associada com CUG-expansão no miogênica distrofia 1 (Figura 1D). Além disso, a transferência de Western mostrou consistentemente 10 Celf1 nível de proteína foi elevada (Figura 1E), e CUG200 inibiu a expressão de MyoD, MyoG e MEF2C durante a diferenciação (Figura 1D). Estes resultados sugerem que o CUG-expansão conduz a defeitos de miotubos e diferenciação de mioblastos prejudicada.
Para estudar o papel de Celf1 na diferenciação de mioblastos, pMSCV- Celf1Flag vector retroviral foi construído para transduzir células C2C12. Os clones resistentes puromicina-10 foram reunidas para os estudos de diferenciação. resultados de Western blot mostraram que o Flag-tagged Celf1 só estava presente nas culturas pMSCV-Celf1Flag transduzidas e a expressão da proteína Celf1 foi regulada (Figura 2A). A formação de miotubos em células que sobre-expressam Celf1 é raro, quando em comparação com as culturas de controlo (Figura 2B), o que sugere que a sobre-expressão de Celf1 prejudica gravemente a diferenciação dos mioblastos.
Para determinar se Celf1 knockdown resgata a deficiência de diferenciação em células CUG-expansão, Celf1 shRNA foi entregue a células GFP-CUG200 por vetores lentivirais. clones resistentes duplos (G418 e puromicina) foram selecionadas e reunidas para estudos de diferenciação. O nível de proteína endógena Celf1 foi marcadamente reduzida na presença de Celf1 shRNA (Figura 3A). Após 6 dias de diferenciação, o efeito de Celf1 shRNA no aumento da formação de miotubo foi evidente (Figura 3B). índices de fusão e miotubos sãocomo foram de 16,1 ± 3,0% e 15,2 ± 1,2%, respectivamente, em comparação com 4,6 ± 0,8% e 5,1 ± 1,3% em culturas de controlo (Figura 3C). Enquanto isso, os resultados em tempo real de RT-PCR indicam que a expressão de MyoD, MyoG e MEF2C foi significativamente aumentado nas células Celf1 shRNA (Figura 3D) de apoio deficiência de diferenciação de miócitos knockdown Celf1 resgatado.
Figura 1. CUG-Expansão Inibe miócitos de diferenciação em células C2C12. (A) células C2C12 expressaram a GFP-CUG5 ou GFP-CUG200 ubiquamente após selecção. As barras de escala são de 100 uM. Esta figura foi modificada do nosso trabalho anterior 10. (B) Miotubos foram formados em células GFP-CUG5 mas menos em células GFP-CUG200. Miotubos foram visualizadas por cadeia pesada de miosina (MF-20) imunocoloração. As barras de escala são de 100 uM. (C) (D) em tempo real A análise de RT-PCR de Celf1, factores de transcrição MyoD, MyoG, e MEF2C expressão durante a diferenciação dos mioblastos. Os níveis de ARNm foram plotados após a GAPDH normalizada. As barras de erro representam os desvios padrão. teste t de Student foi realizado para comparar os testes com os controlos. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-CUG200 transfecção aumento da expressão de proteínas Celf1. ß-actina é mostrado como o controle de carregamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A sobre-expressão de Celf1 danifica mioblasto diferenciação. (A) Prova de expre Celf1Flag exógenassion em células C2C12 por Western blot. formação (B) miotubos foi prejudicada em Celf1Flag-sobre-expressam mioblastos C2C12. Miotubos foram visualizadas por imunocoloração MF-20. Barras de escala são 100 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Knockdown de Celf1 parcialmente resgata CUG-Expansão-Induced mioblasto Diferenciação Deficiência. (A) Prova de Celf1 knockdown por Western Blot. (B) Celf1 shRNA induziu a formação de miotubos em mioblastos GFP-CUG200. Miotubos foram visualizadas por imunocoloração MF-20. Barras de escala são 100 mm células. (C) Celf1 shRNA-resgatados que tinha aumentado áreas de índice de fusão e miotubos. As barras de erro representam os desvios padrão. (D) análise em tempo real de RT-PCR de Celf1, factores de transcrição MyoD, MyoG, e MEF2C expressão durante a diferenciação. nível de ARNm foi representada graficamente após a normalização para que de GAPDH. As barras de erro representam os desvios padrão. teste t de Student foi realizado para comparar os testes de controle. n> 3, * P <0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A linha de células C2C12 foi usado como um modelo para estudar miogénese 11-14. Estas células manter uma aparência do tipo fibroblastos, proliferam rapidamente em meios contendo 20% de soro fetal bovino e facilmente diferenciar em meio contendo 2% de soro equino 15. O rápido crescimento e diferenciação são características vantajosas em um modelo de célula miogénese. Aqui, demonstramos a utilização de plasmídeo, retroviral, e vectores lentivirais para introduzir ADNc, 3'-UTR, e shRNA em células C2C12. Os pontos críticos para transfecção / transdução e manutenção de consistência na diferenciação são destacadas a seguir.
A densidade celular em células de manutenção diária é crítica. Estas células têm de ser cultivadas abaixo de 50 - 70% de confluência. Devido ao curto tempo de duplicação da população, alta confluência (> 70%) cultura C2C12 diferencia-se espontaneamente quando deixados durante a noite. Enquanto a fracção de células diferenciadas espontaneamente pode ser pequeno, a presençade células diferenciadas contribuirá para inconsistências em experimentos de diferenciação subsequentes. células C2C12 Além disso, recém-descongeladas que têm baixo número de passagem são os preferidos. Para a diferenciação, as células são plaqueadas a números pré-determinados de modo a que eles atingem confluência completa após 24 horas. A insulina é mantido congelado em pequenas alíquotas e é adicionado a cada vez que o meio de diferenciação é alterada. Estas medidas melhorar os resultados de diferenciação.
meio sem soro aumenta a transfecção de células C2C12. As células podem ser incubadas em mistura de transfecção de mídia livre / soro durante a noite. Em nosso laboratório, nós conseguimos uma taxa de transfecção de 20%, acompanhada por ligeiros sinais de citotoxicidade. A concentração de droga usada para seleccionar células C2C12 é superior, 1,2 a 1,6 mg / ml de G418 ou 1 a 3 ug / ml de puromicina, e a duração da selecção é mais longo do que a maioria das outras linhas celulares. Devido à potencial toxicidade sob alta concentração de fármaco e o período de incubação prolongado, de lote para lotevariação em potencial de diferenciação podem surgir. É crucial para ajustar o método de selecção (concentração e duração) com base na aparência das células e para tratar os grupos experimental e controle em conjunto.
Nós introduzimos com sucesso GFP-CUG200 em células C2C12 que reproduzem 3'-UTR expansão CUG em DM1. Apresentando Celf1 em células C2C12 e Celf1 shRNA em células GFP-CUG200 C2C12 permitiu a avaliação de eventos celulares e moleculares desencadeadas por Celf1 regulação positiva e exploração de segmentação Celf1 para ajudar a diferenciação de mioblastos DM1, respectivamente. Em resumo, o modelo de mioblastos C2C12 aqui apresentada beneficia a investigação de distrofia miotónica, bem como biologia de células de músculo geral e diferenciação miogénica. A limitação deste modelo é que os achados em linhas celulares podem não completamente estender para os organismos. Os resultados nos modelos atuais são frequentemente avançou para isolar mioblastos frescos de animais e estudar suas differentiação. Em última análise, fundamentar as conclusões de mioblastos em organismos.
A força original deste estudo é a manipulação genética multi-tier em mioblastos C2C12, que permite a modelagem dos eventos sequenciais genéticos / patológicas no DM1. Anteriormente, o efeito da expansão toxicidade ARN DMPK CUG foi documentada em mioblastos 11-14, enquanto os papéis patológicos de Celf1 foram estudadas separadamente em modelos de ratinho 16,17. Modelando esses eventos patológicos / genéticas seqüenciais é tecnicamente desafiador e demorado, se realizado em modelos animais. Como demonstrado neste estudo, o uso combinado de marcadores fluorescentes e resistentes droga permite a modelagem de eventos moleculares adicionais na distrofia miotónica. Os modelos estabelecidos neste estudo seria útil em dissecar os mecanismos detalhados em DM1 patogênese. Eles também seria valioso na triagem de drogas que visam diferentes etapas do DM1 patogênese. As estratégias e procedimentos desteestudo pode lançar luz sobre a criação de outros modelos de doenças musculares em mioblastos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
