Summary
Dans ce protocole, nous présentons les procédures pour établir la dystrophie 1 modèles de myoblastes myotonique, y compris la maintenance optimisée C2C12 cellulaire, la transfection de gènes / transduction, et la différenciation des myocytes.
Abstract
La dystrophie myotonique 1 (DM1) est une forme courante de dystrophie musculaire. Bien que plusieurs modèles animaux ont été établis pour DM1, les modèles de cellules myoblastes sont encore importants, car ils offrent une alternative cellulaire efficace pour étudier les événements cellulaires et moléculaires. Bien que les cellules de myoblastes C2C12 ont été largement utilisés pour étudier la myogenèse, la résistance à la transfection de gènes, ou une transduction virale, empêche la recherche dans des cellules C2C12. Ici, nous décrivons un protocole optimisé comprenant des procédures d'entretien quotidien, la transfection et de transduction pour introduire des gènes dans des myoblastes C2C12 et l'induction de la différenciation des myocytes. Collectivement, ces procédés permettent de meilleurs rendements de transfection / transduction, ainsi que des résultats de la différenciation cohérente. Le protocole décrit dans l'établissement de modèles de cellules myoblastes DM1 bénéficierait l'étude de la dystrophie myotonique, ainsi que d'autres maladies musculaires.
Introduction
La dystrophie myotonique (DM) est une maladie autosomique dominante qui affecte plusieurs systèmes, plus particulièrement les muscles cardiaques et squelettiques 1. Il existe deux sous-types de cette maladie, DM1 et DM2. DM1 est plus fréquente et a une manifestation plus sévère que DM2 2. La mutation génétique sous - jacente DM1 est une expansion de répétitions de triplets CUG situées dans la région 3 'non traduite (UTR) du gène de la protéine kinase de DM (DMPK) 3. Le nombre de répétitions CUG dans les individus non affectés varie de 5 à 37. En revanche, elle augmente à plus de 50, et parfois jusqu'à des milliers de patients DM1 4. En conséquence, les protéines liant l'ARN, tels que muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP et Elav comme la famille 1 (Celf1), sont misregulated. En raison de la séquestration des répétitions CUG expansées, MBNL1 perd sa capacité à réguler 5 l' épissage alternatif. Celf1, d'autre part, est régulée à la hausse de 6,7. La surexpression de Celf1 est associée à la perte de muscleet la faiblesse, qui ne sont pas attribués à la perte de la fonction MBNL1. Les modèles animaux simulant des altérations DM1-connexes, y compris DMPK 3'-UTR extension CUG, la perte de MBNL1, et la surexpression de Celf1, ont été établis. Cependant, la modélisation DM1 dans les myoblastes offre une alternative efficace, en particulier pour disséquer les événements cellulaires et moléculaires DM1 liées.
C2C12 lignée cellulaire de myoblastes a été isolé à partir du muscle de souris C3H blessés et largement utilisé pour étudier la différenciation myogénique 8,9. les cellules C2C12 prolifèrent rapidement dans le sérum de fœtus bovin (FBS) contenant des médias et facilement subissent une différenciation lorsque FBS est épuisée. Pourtant, l'utilisation de ce modèle de différenciation des myoblastes présente deux difficultés: Des cellules C2C12 sont souvent résistantes aux gènes de transfection / transduction virale; et de légères variations dans la manipulation des cellules et de la procédure de différenciation peut conduire à des changements marqués dans la formation de myotubes.
Notre laboratoire utilise régulièrement myoblastes C2C12 comme acmodèle et ell a développé des protocoles qui fournissent efficacement des gènes par transfection plasmidique, la transduction rétrovirale et lentiviral transduction en C2C12 lignée cellulaire 10. Dans la vidéo, nous démontrons les procédures optimisées pour la transfection / transduction C2C12 cellules et le maintien de la cohérence de la différenciation dans l'établissement de modèles de myoblastes DM1.
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Protocol
1. C2C12 Culture cellulaire
- Maintenir les myoblastes de souris C2C12 dans une plaque de 100 mm dans du milieu de croissance (milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)) supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 20%, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Laisser les cellules C2C12 à des passages à devenir environ 50 - 60% de confluence.
- Jeter le milieu de croissance et laver les cellules C2C12 avec une solution saline 3 ml température ambiante tamponnée au phosphate (PBS). Retirer le PBS et on ajoute 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA pour détacher les cellules. Placer la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 3 - 5 min.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant 3 ml de milieu de croissance. Pipeter 6 - 8 fois de suspendre les cellules. Ajouter 1 ml de cellules en suspension dans une nouvelle plaque de 100 mm et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2.
2. C2C12 cellulaire Transfection / transduction et sélection
- C2C12 transfection plasmidique
- 24 h avant la transfection, pfin 7,0 x 10 5 cellules C2C12 dans un puits d'une plaque à six puits pour chaque transfection.
Note: Ceci conduit à 50 - 60% de confluence au moment de la transfection. - Laisser le réactif de transfection à venir à la température ambiante avant utilisation.
- Ajouter 2 pg d'ADN plasmidique (GFP-CUG5 ou GFP-CUG200) dans 200 ul préchauffé milieu sans sérum et vortex brièvement. Ajouter 6 ul réactif de transfection au milieu et mélanger immédiatement pendant 30 secondes en utilisant un vortex. Laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante.
- Changer les médias de cellules C2C12 à 2,5 ml de milieu de croissance sans sérum. Ajouter le mélange de transfection aux cellules après incubation. Retourner les plaques à 5% de CO2, 37 ° C incubateur.
- Maintenir les cellules dans le mélange de transfection / milieu de croissance exempt de sérum pendant 4 heures ou jusqu'à la nuit. Changer les médias vers les médias de croissance le lendemain ou lorsque cytotoxicité est apparente.
Remarque: La cytotoxicité est évaluée par inspection microscopique de la CElls. Observer les modifications de la morphologie cellulaire et le détachement des cellules. Tant qu'il n'y a pas de cytotoxicité manifeste, une nuit d'incubation dans un milieu de croissance sans sérum améliore la transfection. - Sélectionner les cellules 48 h après la transfection par l'addition de 1,2 à 1,6 mg / ml de G418 pendant environ 10 jours jusqu'à ce que la culture témoin (sans transfecté les plasmides) n'a pas de cellules vivantes. Changer les médias tous les deux jours avec un milieu de croissance supplémenté en G418.
- Maintenir les cellules résistantes au G418 dans un milieu de croissance et de 5% de CO2 à 37 ° C pour les expériences ultérieures.
- 24 h avant la transfection, pfin 7,0 x 10 5 cellules C2C12 dans un puits d'une plaque à six puits pour chaque transfection.
- Préparation de retrovirus et la transduction rétrovirale C2C12
- Préparer HEK 293 du milieu de culture en la complétant DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine.
- Environ 24 heures avant la transfection, la plaque 4,0 x 10 cellules d'emballage à base de 293 HEK 6 écotropes dans une plaque de 100 mm (80% de confluence à la transfection) contenant milieu de culture cellulaire.
- Laisser le réactif de transfection à venir à la température ambiante avant utilisation.
- Mélanger 15 pg d'ADN de plasmide (ou pMSCV-Puro-pMSCV Celf1Flag-Puro) dans 1 ml de milieu de croissance sans sérum. brièvement Vortex. Ajouter 30 ul de réactif de transfection de l'étape 2.2.2 dans le / milieu de croissance tubes sans sérum d'ADN, et bien mélanger à l'aide vortex. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter goutte à goutte le mélange de transfection aux cellules d'emballage à base de écotrope 293 HEK. Agiter doucement les plaques et les retourner à la 5% de CO 2, 37 ° C incubateur. Après 24 heures, changer les médias à moyen 10 ml préchauffée croissance frais.
- Récolter le surnageant (contenant les retrovirus) 48 heures après transfection en utilisant une pipette et transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Ajouter 10 ml de nouveaux médias chauds à la plaque et le retourner à l'incubateur. Gardez le surnageant à 4 ° C.
Note: Le support est ajouté doucement à til côté du puits de manière à ne pas perturber la monocouche cellulaire. - Récolter le deuxième lot de surnageant 60 h après la transfection et la piscine avec le surnageant de 2.2.5. Centrifuger à 500 x g, 4 ° C pendant 7 min pour éliminer les débris cellulaires.
- Transférer le surnageant dans un nouveau 50 ml tube de centrifugeuse. Utilisez retrovirus pour transduire des cellules C2C12 à ce point en procédant à l'étape 2.2.9 ou aliquote et stocker le surnageant à -20 ° C pour une utilisation future.
- Décongeler le retrovirus de 2.2.7 à la température ambiante, si un stock congelé est utilisé ici.
Remarque: évitez de multiples cycles de gel-dégel. - Plaquer les cellules C2C12 le même jour de la transduction visant à 30-40% de confluence.
- Jeter le milieu de croissance et laver les cellules C2C12 avec 3 ml température ambiante PBS. Retirez le PBS, ajouter 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA, et incuber la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 3 - 5 min.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant 3 ml med de croissanceium. Pipeter 6 - 8 fois de suspendre les cellules. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et ajoutez 8,0 x 10 5 C2C12 cellules à une plaque de 60 mm.
- Ajouter 0,5 ml retrovirus pour infecter une plaque de 60 mm de cellules dans 3 ml de milieu de croissance. Remettre la plaque dans l'incubateur.
- Remplacez-le par 3 ml de milieu frais additionné de sélection antibiotique (puromycine 1-3 pg / ml) 48 heures après l'infection. Remplacer 3 ml de milieu avec des antibiotiques tous les jours pour ~ 5 jours jusqu'à ce que la culture de contrôle de C2C12 non transduites meurt.
- Préparer HEK 293 du milieu de culture en la complétant DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine.
- préparation lentivirus et C2C12 lentiviral transduction
Remarque: Effectuez toutes les procédures liées à lentivirus en niveau de biosécurité 2 cabinet et suivre les directives de sécurité biologique. Les déchets liquides contenant le virus doit être désinfecté avant leur élimination.- Plaque 4,0 x 10 6 cellules 293T dans une plaque de 100 mm (~ 80% de confluence au jour de la transfection) avec HEK 293 du milieu de culture cellulaire (DMEM riche en glucose, supplémenté avec 10% du foetussérum bovin, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine) 24 h avant la transfection.
- Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante. Mélanger les vecteurs d'emballage lentiviral (4 pg pMD2.G et 6 pg psPAX2) avec vecteur de transfert lentiviral 8 pg (Celf1 shRNA ou brouillés contrôle shRNA) dans 1 ml de sérum milieu de culture cellulaire libre. brièvement Vortex.
- Ajouter 36 ul préchauffée réactif de transfection à l'ADN / tube de DMEM et bien mélanger par vortex. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min.
- Éliminer les cellules 293T de l'incubateur et ajouter le mélange de transfection à la plaque. Agiter doucement la plaque et le retourner à 5% de CO 2, 37 ° C incubateur. Après 24 heures, remplacer le mélange de transfection avec 10 ml de milieu de culture frais.
- Recueillir le surnageant contenant lentivirus 48 h après la transfection et le transférer dans un tube de 50 ml de centrifugeuse. Ajouter 10 ml nouveaux médias chauds à la plaque et le retournerdans l'incubateur. Stocker le surnageant à 4 ° C.
- Recueillir le deuxième lot de surnageant 60 h après la transfection et les combiner avec le surnageant de 2.3.5. brièvement Centrifuger à 500 xg, 4 ° C pendant 7 min.
- Transférer le surnageant dans un 50 ml tube frais de centrifugeuse. Si vous utilisez le virus frais, passez à l'étape 2.3.9. Pour une utilisation ultérieure, magasin contenant le virus surnageant à -20 ° C en aliquotes de 10 ml.
- Décongeler le virus de 2.3.7 à la température ambiante avant de l'utiliser, si un stock congelé est utilisé.
Remarque: évitez de multiples cycles de gel-dégel. - cellules C2C12 Plate-CUG200 (obtenus dans la section 2.1), comme décrit dans 2.2.9 le jour même de la transduction.
Note: But pour 30 - 40% de confluence. - Ajouter 0,5 ml virus pour infecter une plaque de 60 mm de C2C12-CUG200 et retourner la plaque dans l'incubateur.
- Remplacer le milieu de culture avec du milieu frais supplémenté avec l'antibiotique de sélection (puromycine: 1 - 3 pg / ml) 72 h après transduction.Actualiser les milieux de culture tous les jours avec l'antibiotique de sélection pour ~ 5 jours jusqu'à ce que toute la culture de contrôle C2C12-CUG200 non transduites meurt.
- Utilisez Western blot pour vérifier knockdown Celf1 dans les cellules transfectées GFP-CUG200.
3. C2C12 Différenciation Cellulaire
- Plate 2 x 10 6 cellules dans un puits d'une plaque à 6 puits dans 2,5 ml de milieu de croissance 24 heures avant l' initiation de la différenciation.
Note: La densité de placage peut être ajustée de telle sorte que toute la confluence est atteinte en 24 h.- Rincer les cellules confluentes avec du PBS et on ajoute 2,5 ml de milieu de différenciation à faible sérum (milieu modifié d'Eagle supplémenté avec 2% de sérum équin, 100 U / ml de pénicilline de Dulbecco, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1 pM d'insuline) . Remplacer le milieu tous les deux jours.
Remarque: Conservez l'insuline stocks congelés et l'ajouter aux médias à chaque changement de milieu.
- Rincer les cellules confluentes avec du PBS et on ajoute 2,5 ml de milieu de différenciation à faible sérum (milieu modifié d'Eagle supplémenté avec 2% de sérum équin, 100 U / ml de pénicilline de Dulbecco, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1 pM d'insuline) . Remplacer le milieu tous les deux jours.
- Au cours de la différenciation C2C12, prélever des échantillons pour quantitatif RT-PCR (voir la section 4) aux points de temps suivants: Day0, 1, 2, 4 et 6. Procédé pour la culture immunocoloration au jour 6 - 8 (voir la section 5).
4. Isolement de l'ARN et RT-PCR quantitative
- Utiliser le protocole du fabricant pour isoler l'ARN. Après isolement, resuspendre le culot d'ARN dans 30 l'eau libre de RNase-ul et pipeter monter et descendre plusieurs fois.
Note: Les échantillons peuvent procéder à RT-PCR quantitative ou peuvent être conservés à -80 ° C. - Utilisez un kit RT qPCR pour RT-PCR quantitative 10 et suivre les instructions du fabricant. Préparer le mélange réactionnel selon le Tableau 1.
| Composant | Volume (ul) | La concentration finale |
| 2 x tampon de réaction | dix | 1 fois |
| amorce sens | 0,5 | 200 nm |
| amorce antisens | 0,5 | 200 nm |
| Sonde | 0,5 | 200 nm |
| Transcriptase inverse et RNase Inhibitor | 0,1 | 0,25 U / ml |
| Modèle | 1 | 100 ng d'ARN total |
| RNase eau libre | 7.4 | N / A |
| Mix total | 20 |
Tableau 1. RT-PCR quantitative Master Mix Préparation
- Exécuter un 20 pi réaction de RT-qPCR utilisant le profil thermique Tableau 2.
| étape de transcription inverse | 30 mn, 48 ° C |
| polymère d'ADNactivation ase / transcriptase inverse inactivation | 10 mn, 95 ° C |
| 40 cycles | 15 s, 95 ° C |
| 1 min, 60 ° C, |
Tableau 2. RT-PCR quantitative profil thermique
5. immunocoloration
- Fixer la culture monocouche dans 2,5 ml fraîchement préparé paraformaldehyde à 4% / PBS à température ambiante pendant 10 min.
- Perméabiliser les échantillons dans 2,5 ml de 0,1% de Triton X-100 / PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Transférer les échantillons à une chambre humidifiée. Bloquer les échantillons dans 2,5 ml de tampon de blocage (tensioactif non ionique 0,1% / PBS, 10% de sérum de chèvre normal) pendant 30 min à 37 ° C.
- Jeter un tampon de blocage et d'appliquer 800 anticorps primaire ul contre Chain myosine lourd dilué dans un tampon de blocage (1: 100). Incuber pendant une nuit dans une chambre humidifiée à température ambiante.
- Laver la plaque 3 times (10 min chacun) avec 2,5 ml de tampon de lavage (0,1% de polysorbate 20 / PBS) le jour 2.
- Retirer le tampon de lavage et appliquer 800 pi d'anticorps secondaire (chèvre anti-IgG de souris, 1: 500 dilué dans du PBS). Incuber dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 1 h.
- Laver deux fois (10 min chacun) avec un tampon de 2,5 ml de lavage.
- Laisser incuber avec 800 ul de DAPI (1 pg / ml, diluée dans distillée H 2 O déminéralisée) pendant 5 min.
- Laver avec 2,5 ml de tampon de lavage à nouveau pendant 10 minutes.
- Changer le tampon de lavage dans 2,5 ml de PBS et en utilisant un microscope à fluorescence pour capturer des images.
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Representative Results
les cellules C2C12 ont été transfectées avec GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Après la sélection de résistance aux médicaments, les pools stables ont été établies, qui peut être visualisée par l' expression de GFP (figure 1A). La formation de myotubes dans les myoblastes différenciés a été détectée par la myosine chaîne lourde immunocoloration 10 (figure 1B). La quantification de la formation de myotubes ont démontré que les indices de fusion ont été réduites de 35,4 ± 4,1% à 2,6 ± 1,1% , et les zones de myotubes ont été réduites de 35,6 ± 2,2% à 2,7 ± 0,8% par dilatation CUG anormale dans GFP CUG200 (figure 1C). L'indice de fusion et la zone de myotubes ont été comptées par le nombre total de noyaux dans les myotubes (≥ 2 noyaux) divisé par le nombre total de noyaux et le pourcentage de la surface totale de l'image couverte par les myotubes, respectivement. En temps réel RT-PCR a été réalisée 10 pour analyser l' expression d'un certain nombre de muscles différentsles gènes liés à la iation y compris MyoD, MyoG, MEF2C et Celf1. CUG5 par rapport à des cultures, CUG200 a augmenté l'expression de l'ARNm dans la prolifération Celf1 myoblastes au début de la différenciation. Congruente avec les rapports précédents, Celf1 surexpression est associée à CUG-expansion myogénique dystrophie 1 (figure 1D). En outre, Western blot 10 constamment montré le niveau de protéine Celf1 a été élevé (figure 1E), et CUG200 inhibe l'expression de MyoD, MyoG et MEF2C lors de la différenciation (figure 1D). Ces résultats suggèrent que le CUG expansion conduit à myotubes défauts et la différenciation des myoblastes avec facultés affaiblies.
Pour étudier le rôle de Celf1 dans la différenciation des myoblastes, vecteur rétroviral pMSCV- Celf1Flag a été construit pour la transduction de cellules C2C12. Clones 10 Puromycin-résistants ont été regroupées pour des études de différenciation. résultats de Western blot ont montré que le drapeau-tagged Celf1 était présent dans les cultures pMSCV-Celf1Flag transduites et à l'expression de la protéine a été régulée à la hausse Celf1 (figure 2A). La formation de myotubes dans les cellules surexprimant Celf1 est rare, par rapport aux cultures témoins (figure 2B), ce qui suggère que la surexpression de Celf1 altère sérieusement la différenciation des myoblastes.
Pour déterminer si Celf1 knockdown sauve le déficit de la différenciation dans les cellules CUG-extension, Celf1 shRNA a été livré à des cellules GFP-CUG200 par des vecteurs lentiviraux. clones résistants double (G418 et puromycine) ont été sélectionnés et mis en commun pour les études de différenciation. Le niveau de la protéine endogène Celf1 a été considérablement réduite en présence d'Celf1 shRNA (figure 3A). Au bout de 6 jours de différenciation, l'effet sur l' augmentation de shRNA Celf1 formation myotubes était évidente (figure 3B). Les indices de fusion et myotubes sontcomme étaient de 16,1 ± 3,0% et 15,2 ± 1,2%, respectivement, comparativement à 4,6 ± 0,8% et 5,1 ± 1,3% dans les cultures de contrôle (figure 3C). Pendant ce temps, les résultats en temps réel RT-PCR suggèrent que l'expression de MyoD, et MyoG MEF2C était significativement augmentée dans les cellules Celf1 shRNA (figure 3D) supportant Celf1 knock - down secourue carence de différenciation des myocytes.
Figure 1. CUG-Expansion Empêche myocytes Différenciation dans les cellules C2C12. Cellules (A) C2C12 exprimé GFP-CUG5 ou GFP-CUG200 ubiquitaire après la sélection. Les barres d'échelle sont 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis notre précédent article 10. (B) myotubes ont été formés dans les cellules GFP-CUG5 mais moins dans les cellules GFP-CUG200. Myotubes ont été visualisées par la myosine chaîne lourde (MF-20) immunocoloration. Les barres d'échelle sont 100 um. (C) (D) en temps réel une analyse par RT-PCR de Celf1, les facteurs de transcription MyoD, MyoG et l' expression MEF2C lors de la différenciation des myoblastes. les taux d'ARNm ont été tracées d'après la GAPDH normalisée. Les barres d'erreur représentent les écarts types. Le test t de Student a été réalisé pour comparer les essais témoins. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-transfection accrue CUG200 Celf1 expression de la protéine. ß-actine est montré comme le contrôle de chargement. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La surexpression de Celf1 Impairs myoblastes Différenciation. (A) Preuve de exogène Celf1Flag expression dans les cellules C2C12 par Western blot. formation (B) myotubes a été altérée dans Celf1Flag-surexprimant myoblastes C2C12. Myotubes ont été visualisées par MF-20 immunocoloration. Les barres d'échelle sont 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Knockdown de Celf1 partiellement Sauvetages CUG-Expansion-Induced myoblastes Différenciation carence. (A) Preuve de Celf1 knockdown par Western blot. (B) Celf1 shRNA induite par la formation de myotubes dans les myoblastes GFP-CUG200. Myotubes ont été visualisées par MF-20 immunocoloration. Les barres d'échelle sont 100 um cellules. (C) Celf1 shRNA-secouru qui avaient augmenté les zones d'indice de fusion et de myotubes. Les barres d'erreur représentent les écarts types. (D) en temps réel une analyse par RT-PCR de Celf1, facteurs de transcription MyoD, MyoG, et l' expression MEF2C lors de la différenciation. niveau de l'ARNm a été tracée après normalisation à celle de GAPDH. Les barres d'erreur représentent les écarts types. Le test t de Student a été réalisé pour comparer les essais de contrôle. n> 3, * P <0,05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Lignée cellulaire C2C12 a été utilisé comme modèle pour étudier la myogenèse 11-14. Ces cellules conservent un aspect fibroblaste, prolifèrent rapidement dans les milieux contenant 20% de sérum fœtal bovin et facilement différencier dans un milieu contenant 2% de sérum équin 15. La croissance rapide et la différenciation sont des caractéristiques avantageuses dans un modèle cellulaire de la myogenèse. Ici, nous démontrons l'utilisation du plasmide, rétroviral et vecteurs lentiviraux pour introduire l'ADNc, 3'-UTR et shRNA dans des cellules C2C12. Les points critiques pour la transfection / transduction et le maintien de la cohérence dans la différenciation sont mis en évidence ci-dessous.
La densité cellulaire dans un entretien quotidien de la cellule est essentielle. Ces cellules doivent être cultivées en dessous de 50 - 70% de confluence. En raison de la population doublant peu de temps, de haute confluence (> 70%) de la culture C2C12 différencie spontanément lorsqu'il est laissé pendant une nuit. Tandis que la fraction de cellules différenciées spontanément peut être faible, la présencedes cellules différenciées contribueront à des incohérences dans les expériences de différenciation ultérieures. cellules C2C12 En outre, fraîchement décongelés qui ont une faible nombre de passages sont préférés. Pour la différenciation, les cellules sont étalées à des nombres prédéterminés afin qu'ils atteignent leur pleine confluence après 24 h. L'insuline est conservé congelé en petites aliquotes et on ajoute à chaque fois que le milieu de différenciation est modifié. Ces mesures améliorent les résultats de différenciation.
milieu sans sérum améliore C2C12 cellule transfection. Les cellules peuvent être incubées dans un mélange de transfection / milieu exempt de sérum pendant une nuit. Dans notre laboratoire, nous réalisons jusqu'à taux de transfection de 20%, accompagné de légers signes de cytotoxicité. La concentration de médicament utilisé pour sélectionner les cellules C2C12 est supérieure de 1,2 à 1,6 mg / ml de G418 ou 1 à 3, ug / ml de puromycine et la durée de la sélection est plus longue que la plupart des autres lignées cellulaires. En raison de la toxicité potentielle sous forte concentration de drogue et la période d'incubation prolongée, beaucoup à beaucoupvariation du potentiel de différenciation peut se poser. Il est crucial d'ajuster le schéma de sélection (concentration et durée) basée sur l'apparence des cellules et de traiter les groupes expérimentaux et de contrôle ensemble.
Nous avons introduit avec succès GFP-CUG200 dans les cellules C2C12 qui reproduisent 3'-UTR expansion CUG dans la DM1. Introduire dans des cellules C2C12 Celf1 et Celf1 shRNA dans des cellules GFP-CUG200 C2C12 a permis l'évaluation des événements moléculaires et cellulaires déclenchées par une régulation positive Celf1 et l'exploration de ciblage Celf1 pour aider à la différenciation des myoblastes DM1, respectivement. En résumé, le modèle de myoblastes C2C12 présenté ici profite de l'enquête de la dystrophie myotonique, ainsi que la biologie générale des cellules musculaires et la différenciation myogénique. La limitation de ce modèle est que les résultats dans les lignées cellulaires ne peuvent pas complètement étendre aux organismes. Les résultats dans les modèles actuels sont souvent avancés pour isoler les myoblastes fraîches provenant d'animaux et d'étudier leurs differentiation. En fin de compte, nous étayerons conclusions myoblastes dans les organismes.
La force unique de cette étude est la manipulation génétique multi-niveaux dans les myoblastes C2C12, qui permet de modéliser les événements séquentiels génétiques / pathologiques dans DM1. Auparavant, l'effet toxique de l' ARN de l' expansion DMPK CUG a été documentée dans des myoblastes 11-14, tandis que le rôle pathologique de Celf1 ont été étudiés séparément dans des modèles de souris 16,17. Modélisation de ces événements pathologiques / génétiques séquentielles est techniquement difficile et prend du temps si elle est effectuée dans des modèles animaux. Comme l'a démontré dans cette étude, l'utilisation combinée des marqueurs fluorescents résistants et de médicaments permet la modélisation d'événements moléculaires supplémentaires dans la dystrophie myotonique. Les modèles établis dans cette étude seraient utiles pour disséquer les mécanismes détaillés dans la pathogenèse DM1. Ils seraient également précieux dans le dépistage de médicaments qui ciblent différentes étapes de DM1 pathogenèse. Les stratégies et procédures du présentétude peut faire la lumière sur l'établissement d'autres modèles de maladies musculaires dans les myoblastes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
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