Summary
В этом протоколе, мы приводим процедуры создания Миотоническая дистрофия 1 миобластов моделей, в том числе оптимизированного обслуживания С2С12 клеток, генной трансфекции / трансдукции и миоцитов дифференциации.
Abstract
Миотоническая дистрофия 1 (DM1) является распространенной формой мышечной дистрофии. Хотя некоторые модели на животных были установлены для DM1, миобластов модели клеток по-прежнему важны, поскольку они обеспечивают эффективную клеточную альтернативу для изучения клеточных и молекулярных событий. Хотя клетки миобластов С2С12 широко используется для изучения миогенез, устойчивость к трансфекции генов или вирусной трансдукции, затрудняет исследование в клетках С2С12. Здесь мы опишем оптимизированный протокол, который включает в себя ежедневное техническое обслуживание, Трансфекция и трансдукции процедуры для введения генов в С2С12 миобластов и индукции дифференцировки кардиомиоцитов. Итак, эти процедуры позволяют наилучшие эффективности трансфекции / трансдукции, а также последовательные результаты дифференциации. Протокол, описанный в создании моделей DM1 миобластов клеток пойдет на пользу изучение миотоническая дистрофии, а также других мышечных заболеваний.
Introduction
Миотоническая дистрофия (DM) является аутосомно - доминантным заболеванием , которое затрагивает несколько систем, наиболее особенно сердечной и скелетных мышц 1. Есть два подтипа этого заболевания, DM1 и DM2. DM1 является более распространенным и имеет более тяжелое проявление чем СД2 2. Генетическая мутация , лежащая в основе DM1 является расширением CUG триплетных повторов , расположенных в нетранслируемой области 3 '(УТР) ДМ гена протеинкиназы (ДМПК) 3. Число ЗГП повтора в непораженных особей колеблется от 5 до 37. В отличие от этого , она возрастает до более чем 50, а иногда и до тысяч у больных DM1 4. В результате РНК-связывающие белки, такие как muscleblind типа 1 (MBNL1), CUGBP и Elav типа семейство 1 (Celf1), являются misregulated. Из - за секвестрации на расширенном CUG повторами, MBNL1 теряет способность регулировать альтернативного сплайсинга 5. Celf1, с другой стороны, до регулируемой 6,7. Сверхэкспрессия Celf1 связано с потерей мышечнойи слабость, которые не отнесены к потере функции MBNL1. Животные модели, имитирующие DM1-связанных изменений, в том числе ДМПК 3'-UTR расширения СГГ, потеря MBNL1 и избыточная экспрессия Celf1, были установлены. Тем не менее, моделирование DM1 в миобластов предлагает эффективную альтернативу, особенно для рассечения DM1 связанных клеточных и молекулярных событий.
C2C12 миобластов линия клеток впервые был выделен из поврежденной мышцы С3Н мыши и широко используются для изучения миогенной дифференцировки 8,9. C2C12 клетки быстро размножаются в эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) -содержащий средства массовой информации и легко подвергаются дифференцировке, когда ФБС истощается. Тем не менее, с помощью этой миобластов дифференциации модель представляет две задачи: C2C12 клетки часто устойчивы к трансфекции генов / вирусной трансдукции; и небольшие изменения в обработке клеток и дифференцировки процедуры может привести к заметным изменениям в образовании myotube.
Наша лаборатория обычно использует С2С12 миобластов как асELL модель и разработала протоколы , которые эффективно обеспечивают гены от плазмиды трансфекции, ретровирусной трансдукции и лентивирусов трансдукции в клеточной линии С2С12 10. В видео мы покажем, оптимизированные процедуры для трансфекции / трансдукции С2С12 клеток и поддержание согласованности дифференциации в создании моделей DM1 миобластов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C2C12 Культура клеток
- Поддержание С2С12 миобластов мыши в 100 мм пластины в ростовой среде (среда Игла в модификации Игла (DMEM),), дополненной 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Разрешить C2C12 пассированные клетки становятся примерно 50 - 60% сплошности.
- Выбросите среду для роста и промыть клетки С2С12 с 3 мл при комнатной температуре фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Удалите PBS и добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА для открепления клеток. Поместите пластинку в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 3 - 5 мин.
- Нейтрализовать трипсина путем добавления питательной среды 3 мл. Пипетировать 6 - 8 раз, чтобы приостановить клетки. Добавить 1 мл подвешенной клетки к новым 100 мм пластины и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
2. C2C12 Cell Трансфекция / трансдукции и выбор
- C2C12 плазмиду трансфекция
- 24 ч до трансфекции рКонец 7,0 х 10 5 C2C12 клеток в одну лунку шесть-луночного планшета для каждой трансфекции.
Примечание: Это приводит к 50 - 60% монослоя ко времени трансфекции. - Разрешить реагент трансфекции до комнатной температуры перед использованием.
- Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (GFP-CUG5 или GFP-CUG200) в 200 мкл предварительно нагретом среде без сыворотки и вихревыми кратко. Добавить реагента для трансфекции 6 мкл в среду и сразу же перемешать в течение 30 сек с помощью вихря. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Замените носитель клеток С2С12 до 2,5 мл сыворотки среды роста. Добавьте Смесь для трансфекции в клетки после инкубации. Возвращение пластины в 5% СО 2, 37 ° С инкубатор.
- Держите клеток в трансфекции смеси / ростовой среде без сыворотки в течение 4 часов или до ночи. Изменение СМИ обратно в СМИ роста на следующий день или когда цитотоксичность очевидна.
Примечание: Цитотоксичность оценивали с помощью микроскопического обследования СЕLLS. Обратите внимание на изменения в морфологии клеток и открепления клеток. Пока нет явной цитотоксичность, инкубация в течение ночи в бессывороточной ростовой среде усиливает трансфекцию. - Выберите ячейки, через 48 часов после трансфекции путем добавления 1,2 - 1,6 мг / мл G418 для ~ 10 дней, пока культура управления (трансфицируют без плазмид) не не имеет живых клеток. Изменение среды каждые два дня с культуральной среде с добавлением G418.
- Поддерживать клетки , устойчивые к G418 в ростовой среде и 5% СО 2 при 37 ° С в течение последующих экспериментов.
- 24 ч до трансфекции рКонец 7,0 х 10 5 C2C12 клеток в одну лунку шесть-луночного планшета для каждой трансфекции.
- препарат ретровируса и C2C12 ретровирусной трансдукции
- Готовят НЕК 293 культуральной среды путем дополнения DMEM высокий уровень глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
- Примерно через 24 часа до трансфекции, плиты 4.0 х 10 6 экотропным упаковочных клеток НЕК 293 , основанных на 100 мм пластины (80% слияния в трансфекцией) Containing среда для культивирования клеток.
- Разрешить реагент трансфекции до комнатной температуры перед использованием.
- Смешайте 15 мкг плазмидной ДНК (pMSCV-Puro или pMSCV-Celf1Flag-Puro) в 1 мл ростовой среды без сыворотки. Vortex кратко. Добавьте 30 мкл реагента для трансфекции, полученного на стадии 2.2.2 в ДНК / сыворотки среде роста трубки, и хорошо перемешать с помощью вихря. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Добавл ют по капле смесь для трансфекции в упаковывающих клетках НЕК 293 экотропным основе. Аккуратно водоворот пластин и вернуть их обратно в 5% СО 2, 37 ° С инкубатор. Через 24 часа, изменения носителя 10 мл подогретого свежей средой роста.
- Урожай супернатант (содержащий ретровирус) через 48 часов после трансфекции с помощью пипетки и перенести надосадочную жидкость в центрифужную пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл новых теплых СМИ к пластине и вернуть его в инкубатор. Хранить надосадочную жидкость при температуре 4 ° С.
Примечание: Средства массовой информации осторожно добавляют к тон стороне колодца так, чтобы не нарушить клеточный монослой. - Заготавливают вторую партию надосадочную 60 ч после трансфекции и объединить его с супернатанта из 2.2.5. Центрифуга при 500 х г, 4 ° С в течение 7 минут, чтобы удалить остатки клеток.
- Передача супернатант в новую 50 мл центрифужную пробирку. С помощью ретровируса для трансдукции клеток С2С12 в этой точке переходит к шагу 2.2.9 или аликвоты и хранить супернатант при -20 ° С для последующего использования.
- Разморозить ретровируса из 2.2.7 при комнатной температуре, если замороженной используется здесь.
Примечание: Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания. - Пластина клеток С2С12 в тот же день трансдукции, направленных на 30 - 40% слияния.
- Выбросьте среду для роста и мыть клетки С2С12 с 3 мл PBS при комнатной температуре. Удалите PBS, добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА, и инкубируйте в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 3 - 5 мин.
- Нейтрализовать трипсина путем добавления 3 мл Медиана ростаНМУ. Пипетировать 6 - 8 раз, чтобы приостановить клетки. Граф клеток с использованием гемоцитометра и добавить 8,0 × 10 5 C2C12 клеток до 60 мм планшет.
- Добавить 0,5 мл ретровирус заражает один 60 мм пластины клеток в 3 мл питательной среды. Возвращение пластины в инкубатор.
- Заменить 3 мл свежей среды, дополненной выбора антибиотика (пуромицин 1 - 3 мкг / мл) 48 ч после заражения. Заменить 3 мл среды с антибиотиком каждый день в течение ~ 5 дней до untransduced культуры управления C2C12 не вымирает.
- Готовят НЕК 293 культуральной среды путем дополнения DMEM высокий уровень глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
- Лентивирус подготовка и C2C12 лентивирусов трансдукции
Примечание: Выполните все процедуры, связанные с Лентивирус в уровень биологической безопасности 2 кабинета и следовать биологические инструкции по технике безопасности. Жидкие отходы, содержащие вирус, должны быть продезинфицированы перед утилизацией.- Пластина 4.0 х 10 6 клеток 293T в 100 мм пластины (~ 80% сплошности в день трансфекции) с НЕК 293 культуральной среды клеток (DMEM высокий уровень глюкозы, дополненной 10% плоднойбычий сывороточный, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) 24 ч до трансфекции.
- Подогреть трансфекцию реагента до комнатной температуры. Смешайте лентивирусов упаковки векторов (4 мкг pMD2.G и 6 мкг psPAX2) вместе с 8 мкг лентивирусов переноса вектора (Celf1 shRNA или платные каналы управления shRNA) в 1 мл не содержащей сыворотки среды для культивирования клеток. Vortex кратко.
- Добавьте 36 мкл подогретого реагента для трансфекции в ДНК / DMEM трубки и хорошо перемешать с помощью вихря. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалите 293Т из инкубатора и добавить смесь для трансфекции к пластине. Аккуратно вихревой пластины и вернуть его обратно в 5% CO 2, 37 ° С инкубатор. Через 24 часа, замените трансфекция смесь с 10 мл свежей культуральной средой.
- Собирают супернатант, содержащий лентивирусов 48 ч после трансфекции и передачи ее в центрифужную пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл новые теплые СМИ к пластине и вернуть егов инкубатор. Хранить надосадочную жидкость при температуре 4 ° С.
- Соберите вторую партию надосадочную 60 ч после трансфекции и объединить его с супернатантом из 2.3.5. Центрифуга кратко при 500g, 4 ° С в течение 7 мин.
- Передача супернатант в свежую 50 мл центрифужную пробирку. При использовании свежего вируса, переходите к шагу 2.3.9. Для использования в будущем, хранить содержащую вирус надосадочную жидкость при температуре от -20 & deg; С в виде аликвот по 10 мл.
- Оттепель вирус из 2.3.7 при комнатной температуре перед использованием, если используется замороженный запас.
Примечание: Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания. - C2C12-CUG200 клетки пластины (полученные в разделе 2.1), как описано в 2.2.9 в тот же день трансдукции.
Примечание: Цель на 30 - 40% слияния. - Добавьте 0,5 мл вируса, чтобы заразить 60 мм пластины С2С12-CUG200 и вернуть пластины в инкубатор.
- Заменить культуральной среды свежей средой, дополненной антибиотика селекции (пуромицин 1 - 3 мкг / мл) 72 ч после трансдукции.Refresh медиакультуры ежедневно с антибиотиком выбора для ~ 5 дней, пока все untransduced культура управления C2C12-CUG200 не гаснет.
- С помощью Вестерн-блот для проверки Celf1 нокдаун в GFP-CUG200 трансфицированных клеток.
3. C2C12 дифференцировка клеток
- Пластина 2 х 10 6 клеток в одну лунку 6-луночного планшета в 2,5 мл среды для выращивания 24 ч до начала дифференцировки.
Примечание: Плотность покрытия может быть отрегулирована таким образом, что полное слияние достигается через 24 ч.- Промыть вырожденные клетки с PBS и добавляют 2,5 мл с низким сывороточным дифференциации среды (модифицированной среде Игла, дополненной 2% лошадиной сыворотки, 100 ед / мл пенициллина Дульбекко, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1 мкМ инсулина) , Замените среду каждые два дня.
Примечание: Держите запаса инсулина замороженные и добавить его в средствах массовой информации при каждой смены среды.
- Промыть вырожденные клетки с PBS и добавляют 2,5 мл с низким сывороточным дифференциации среды (модифицированной среде Игла, дополненной 2% лошадиной сыворотки, 100 ед / мл пенициллина Дульбекко, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1 мкМ инсулина) , Замените среду каждые два дня.
- Во время С2С12 дифференциации, собирать образцы для цюаньственном ОТ-ПЦР (см раздел 4) в следующих временных точках: Day0, 1, 2, 4 и 6. Процесс культура для иммунологического окрашивания на 6-й день - 8 (см раздел 5).
Выделение РНК и 4. Количественный ОТ-ПЦР
- Используйте протокол производителя для выделения РНК. После выделения ресуспендируют РНК гранул в 30 мкл РНКазы без воды и пипеткой вверх и вниз несколько раз.
Примечание: Образцы могут перейти к количественной ОТ-ПЦР или могут храниться при температуре -80 ° C. - Использование комплекта RT КПЦР для количественного RT-PCR 10 и следовать инструкциям производителя. Готовят реакционную смесь в соответствии с таблицей 1.
| Компонент | Объем (мкл) | Конечная концентрация |
| реакционный буфер 2x | 10 | 1x |
| Прямой праймер | 0,5 | 200 нМ |
| Обратный праймер | 0,5 | 200 нМ |
| зонд | 0,5 | 200 нМ |
| Ревертазам & РНКазы Ингибитор | 0,1 | 0,25 Ед / мл |
| шаблон | 1 | 100 нг общей РНК |
| РНКазы свободной воды | 7.4 | Не Доступно |
| Total Mix | 20 |
Таблица 1. Количественный ОТ-ПЦР Master Mix Приготовление
- Выполните 20 мкл RT-КПЦР реакции с использованием теплового профиля Таблица 2.
| Обратный шаг транскрипции | 30 мин, 48 ° С |
| полимер ДНКактивация аза / инактивация обратной транскриптазы | 10 мин, 95 ° C |
| 40 циклов | 15 сек, 95 ° С |
| 1 мин, 60 ° С |
Таблица 2. Количественный ОТ-ПЦР термический профиль
5. Иммунологическое
- Закрепить монослойной культуре в 2,5 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида / PBS при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Проницаемыми образцов в 2,5 мл 0,1% Тритона Х-100 / PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Передача образцов в увлажненной камере. Блок образцов в 2,5 мл блокирующего буфера (0,1% неионный ПАВ / PBS, 10% нормальной козьей сыворотки) в течение 30 мин при 37 ° С.
- Откажитесь блокирующий буфер и применять 800 мкл первичного антитела против тяжелой цепи миозина, разведенного в блокирующем буфере (1: 100). Инкубируйте в увлажненной камере в течение ночи при комнатной температуре.
- Промыть пластины 3 тимэс (10 мин каждый) с 2,5 мл буфера для промывки (0,1% полисорбат 20 / PBS) на 2-й день.
- Удалите промывочный буфер и применять 800 мкл вторичного антитела (козье антитело против мышиного IgG, 1: 500, разбавленный в PBS). Инкубируйте в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промыть два раза (10 мин каждая) с 2,5 мл буфера для промывки.
- Инкубируют 800 мкл DAPI (1 мкг / мл, разбавленного в дистиллированной деионизированной H 2 O) в течение 5 мин.
- Промыть с 2,5 мл буфера для промывки снова в течение 10 мин.
- Изменение промывочного буфера в 2,5 мл PBS и использовать флуоресцентный микроскоп для захвата изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки C2C12 трансфицировали GFP-CUG5 или GFP-CUG200. После выбора лекарственной устойчивости, были созданы стабильные бассейны, которые могут быть визуализированы с помощью экспрессии GFP (Фигура 1А). Формирование Myotube в дифференцированных миобластов была обнаружена тяжелой цепи миозина иммунным окрашиванием 10 (Фигура 1В). Количественное myotube формирования показали , что показатели слитые снизились с 35,4 ± 4,1% до 2,6 ± 1,1% и myotube площади снизились с 35,6 ± 2,2% до 2,7 ± 0,8% аномальным расширением СГГ в GFP-CUG200 (Рисунок 1С). Индекс расплавление и площадь myotube подсчитывали с помощью общего числа ядер в мышечных трубочек (≥ 2 ядер), деленное на общее число ядер и процент от общей площади изображения, охватываемой мышечные трубки, соответственно. В режиме реального времени ОТ-ПЦР 10 было проведено с целью анализа экспрессии для ряда мышц различнойтельная часть родственных генов, включая MyoD, MyoG, MEF2C и Celf1. По сравнению с CUG5 культур, CUG200 повышал экспрессию мРНК Celf1 в пролиферирующих миобластов в начале дифференцировки. Конгруэнтное с предыдущими сообщениями, Celf1 повышающей регуляцией был связан с СГГ-расширения в миогенного дистрофии 1 (рис 1D). Кроме того, Вестерн - блоттинга 10 последовательно показал уровень белка Celf1 был повышен (рис 1E), и CUG200 ингибирует экспрессию MyoD, MyoG и MEF2C во время дифференцировки (рис 1D). Эти результаты свидетельствуют о том, что ЗГП-расширение приводит к myotube дефектов и нарушенную дифференцировку миобластов.
Изучить роль Celf1 в миобластов дифференциации, ретровирусный вектор pMSCV- Celf1Flag был построен для трансдукции клеток С2С12. 10 Пуромицин-резистентные клоны были объединены для исследований дифференцировки. Вестерн-блот-результаты показали, что флаг-таgged Celf1 присутствовал только в pMSCV-Celf1Flag трансдуцированных культур и экспрессия белка Celf1 была повышающей регуляции (фиг.2А). Формирование мышечных трубочек в Celf1-гиперэкспрессией клетки редко когда по сравнению с контрольными культурами (рис 2В), что свидетельствует о том , что избыточная экспрессия Celf1 серьезно ухудшает миобластов дифференциации.
Для того, чтобы определить, является ли Celf1 нокдауна спасает дефицит дифференцировки в клетках ЗГП-расширения, Celf1 shRNA был доставлен в GFP-CUG200 клеток лентивирусов векторов. Двойные резистентные клоны (G418 и пуромицин) были отобраны и объединены для исследований дифференцировки. Уровень эндогенного белка Celf1 была заметно снижена в присутствии Celf1 shRNA (Фиг.3А). Через 6 дней дифференциации, эффект Celf1 shRNA на повышение myotube образование было очевидным (фигура 3В). Индексы Fusion и myotube являютсяравно как и 16,1 ± 3,0% и 15,2 ± 1,2%, соответственно, по сравнению с 4,6 ± 0,8% и 5,1 ± 1,3% в контрольных культурах (рис 3C). В то же время, результаты в режиме реального времени RT-PCR позволяют предположить , что экспрессия MyoD, MyoG и MEF2C была значительно увеличена в клетках Celf1 shRNA (Рисунок 3D) с поддержкой Celf1 нокдауна спасли миоцит дифференциации дефицита.
Рисунок 1. ЗГП-Расширительный Угнетает миоцитов Дифференциация в С2С12 клетках. (A) C2C12 клетки экспрессируют GFP-CUG5 или GFP-CUG200 Повсеместно после выбора. Шкала баров 100 мкм. Эта цифра была изменена с нашей предыдущей работе 10. (Б) мышечных трубках были сформированы в GFP-CUG5 клетках , но в меньшей степени в GFP-CUG200 клетках. Мышечные трубки визуализировали с помощью тяжелой цепи миозина (MF-20) иммунное окрашивание. Шкала баров 100 мкм. (C) (D) в режиме реального времени RT-PCR анализ Celf1, транскрипционные факторы MyoD, MyoG и выражение MEF2C во время миобластов дифференциации. уровни мРНК были нанесены после того, как GAPDH нормализуется. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. T-критерий Стьюдента проводили сравнение тестов с контрольной группой. п> 3, * Р <0,05. (E) GFP-CUG200 трансфекция увеличение экспрессии белка Celf1. ß-актина показана в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Сверхэкспрессия Celf1 ухудшающее миобластов дифференциацию. (A) Доказательство экзогенного Celf1Flag expression в клетках С2С12 с помощью Вестерн - блоттинга. формация (B) Myotube была нарушена в Celf1Flag сверхэкспрессией миобластов С2С12. Мышечные трубки визуализировали с помощью MF-20 иммунным окрашиванием. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Нокдаун Celf1 Частично Спасает ЗГП-Расширительный-индуцированный миобластов Дифференциация Дефицита. (A) Доказательство Celf1 нокдаун с помощью Вестерн - блоттинга. (Б) Celf1 shRNA индуцируется образование myotube в GFP-CUG200 миобластов. Мышечные трубки визуализировали с помощью MF-20 иммунным окрашиванием. Шкала баров 100 мкм. (C) Celf1 shRNA-Спасенные клетки , которые увеличили размер индекса слияния и myotube областей. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. (D) в режиме реального времени RT-PCR анализ Celf1, транскрипционные факторы MyoD, MyoG и выражение MEF2C во время дифференцировки. Уровень мРНК была построена после нормализации, чтобы у GAPDH. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. T-критерий Стьюдента проводили для сравнения тестов для контроля. п> 3, * Р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клеточная линия C2C12 была использована в качестве модели для изучения миогенез 11-14. Эти клетки сохраняют фибробластоподобных внешний вид, быстро пролиферируют в среде , содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки и легко дифференцировать в среде , содержащей 2% лошадиной сыворотки , 15 ед . Быстрый рост и дифференциация являются выгодные характеристики в модели миогенез клеток. Здесь мы демонстрируем использование плазмиды, ретровирусных и лентивирусов векторов для введения кДНК, 3'-UTR и shRNA в клетки С2С12. Критические точки для трансфекции / трансдукции и поддержание согласованности в дифференциации выдвинуты на первый план ниже.
Плотность клеток в ежедневном обслуживании клеток имеет решающее значение. Эти клетки должны быть культивированы ниже 50 - 70% слияния. Из-за короткого времени удвоения популяции, высокая Стечение (> 70%) C2C12 культура спонтанно дифференцирует, когда оставляют на ночь. В то время как фракция спонтанно дифференцированных клеток может быть небольшим, наличиедифференцированных клеток будет способствовать к несоответствиям в последующих опытах дифференцировки. Кроме того, недавно размороженные клетки С2С12, которые имеют малое число проходов, являются предпочтительными. Для дифференцировки, клетки высевают в заранее определенных чисел, так что они достигают полного слияния через 24 часа. Инсулин хранить в замороженном состоянии в виде небольших аликвот и добавляется каждый раз, когда изменяется дифференцировка среда. Эти меры улучшения результатов дифференциации.
Бессывороточной среде усиливает клеточную трансфекцию С2С12. Клетки можно инкубировать в трансфекции смеси / бессывороточной среды в течение ночи. В нашей лаборатории, мы достигаем до скорости трансфекции 20%, сопровождается небольшими признаками цитотоксичности. Концентрация лекарственного средства, используемого для выбора С2С12 ячейки выше, от 1,2 до 1,6 мг / мл G418 или от 1 до 3 мкг / мл пуромицин, а длительность отбора больше, чем большинство других клеточных линий. Из-за потенциальной токсичности при высокой концентрации лекарственного средства и расширенного инкубационного периода, партии к партииизменение потенциала дифференциации может возникнуть. Крайне важно, чтобы скорректировать схему выбора (концентрации и продолжительности) на основе внешнего вида клеток и для лечения контрольной и экспериментальной группы вместе.
Мы успешно внедрили GFP-CUG200 в клетки С2С12, воспроизводящих 3'-UTR расширение CUG в DM1. Представляя Celf1 в клетки С2С12 и Celf1 shRNA в клетки GFP-CUG200 С2С12 позволило оценку клеточных и молекулярных событий, вызванных Celf1 повышающую регуляцию и разведки ориентации Celf1, чтобы помочь DM1 миобластов дифференциации, соответственно. Таким образом, модель миобластов C2C12, представленные здесь преимущества исследование миотонической дистрофии, а также общей биологии мышечных клеток и миогенной дифференцировки. Ограничение этой модели заключается в том, что выводы, содержащиеся в клеточных линиях, не могут полностью распространяться на организмы. Полученные результаты в нынешних моделях часто выдвигается к выделению свежих миобластов от животных и изучения их отличительноеции. В конечном счете мы обосновать миобластов выводы, содержащиеся в организмах.
Уникальная сила данного исследования является многоуровневая манипуляции ген в С2С12 миобластов, что позволяет моделирования последовательные генетические / патологические события в DM1. Ранее эффект токсичности РНК расширения ДМПК СГГ было зафиксировано в миобластов 11-14, в то время как патологические роли Celf1 были отдельно изучены в моделях мышей 16,17. Моделирование этих последовательных генетических / патологических событий является технически сложным и трудоемким, если оно проводится на животных моделях времени. Как показано в этом исследовании, комбинированное применение флуоресцентных и лекарственной устойчивостью маркеров позволяет моделировать дополнительных молекулярных событий в миотонической дистрофии. Модели, созданные в данном исследовании, было бы полезно в рассечение детальные механизмы в патогенезе DM1. Они будут также ценным для скрининга лекарственных средств, которые нацелены на различные стадии DM1 патогенеза. Стратегии и процедуры этогоисследование может пролить свет на установление других мышечных модели заболеваний в миобластов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
