Summary
In dit protocol presenteren we de procedures vaststelling myotone dystrofie 1 myoblast modellen, waaronder geoptimaliseerde C2C12 celonderhoud, gen transfectie / transductie en myocyt differentiatie.
Abstract
Myotone dystrofie 1 (DM1) is een veel voorkomende vorm van spierdystrofie. Hoewel verschillende diermodellen vastgesteld voor DM1, myoblast cell modellen blijven belangrijk omdat ze een efficiënte cellulaire alternatief voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen. Hoewel C2C12 myoblast cellen zijn op grote schaal gebruikt myogenesis, resistentie te bestuderen gen transfectie of virale transductie, belemmert onderzoek C2C12 cellen. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol dat dagelijks onderhoud, transfectie en transductie procedures omvat om genen in C2C12-myoblasten en de inductie van differentiatie myocyten. Tezamen zijn deze procedures inschakelen beste transfectie / transductie efficiëntie en samenhangende differentiatie resultaten. Het protocol bij de vaststelling DM1 myoblasten celmodellen zou de studie van myotone dystrofie, evenals andere spierziekten profiteren beschreven.
Introduction
Myotone dystrofie (DM) is een autosomaal dominante ziekte die meerdere systemen, met name hart- en skeletspieren 1 beïnvloedt. Er zijn twee subtypen van deze ziekte, DM1 en DM2. DM1 is gebruikelijker en een ernstiger uiting dan DM2 2. De genetische mutatie onderliggende DM1 is een uitbreiding van CUG triplet repeats in het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van DM proteïne kinase gen (DMPK) 3. De CUG aantal repeats in aangetaste individuen varieert van 5 tot 37. Daarentegen verhoogt tot meer dan 50 en soms wel duizenden in DM1 patiënten 4. Hierdoor RNA-bindende eiwitten, zoals muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP en Elav-achtige familie 1 (Celf1), zijn misregulated. Door de opslag van de geëxpandeerde CUG herhalingen, verliest MBNL1 zijn vermogen om alternatieve splicing 5 reguleren. Celf1, anderzijds, wordt opwaarts gereguleerd 6,7. Overexpressie van Celf1 gaat gepaard met het verlies van spiermassaen zwakheid, die niet worden toegeschreven aan verlies van MBNL1 functie. Diermodellen simuleren DM1-gerelateerde veranderingen, waaronder DMPK 3'-UTR CUG expansie, verlies van MBNL1 en overexpressie van Celf1, zijn vastgesteld. Echter, modelleren DM1 in myoblasten biedt een efficiënt alternatief, vooral voor ontleden DM1-gerelateerde cellulaire en moleculaire gebeurtenissen.
C2C12 myoblasten-cellijn werd voor het eerst geïsoleerd uit gewond C3H muis spier en op grote schaal gebruikt om myogene differentiatie 8,9 bestuderen. C2C12 cellen sneller prolifereren in foetaal bovine serum (FBS) bevattende media en gemakkelijk differentiatie ondergaan wanneer FBS leeg. Maar met deze myoblast differentiatie model presenteert twee problemen: C2C12 cellen zijn vaak resistent tegen gentransfectie / virale transductie; en lichte variaties in cel handling en differentiatie procedure kan leiden tot duidelijke veranderingen in myotube formatie.
Ons laboratorium maakt gebruik van routinematig C2C12 myoblasten als acell model en heeft protocollen die effectief genen door plasmide transfectie, retrovirale transductie, en lentivirale transductie geven in C2C12 cellijn 10 ontwikkeld. In de video, tonen we de geoptimaliseerde procedures voor het transfecteren / transduceren C2C12 cellen en het behoud van differentiatie consistentie bij de vaststelling van DM1 myoblast modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C2C12 Cell Culture
- Onderhouden C2C12 muis myoblasten in 100 mm platen in kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)) aangevuld met 20% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine. Sta C2C12 cellen gepasseerd tot ongeveer 50 worden - 60% confluent.
- Gooi het groeimedium en was C2C12 cellen met 3 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 500 ul 0,25% trypsine-EDTA op de cellen los. Plaats de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min.
- Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 3 ml groeimedium. Pipet 6-8 keer om de cellen te schorten. Voeg 1 ml gesuspendeerd cel in nieuw 100 mm plaat en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2.
2. C2C12 celtransfectie / transductie en selectie
- C2C12 plasmide transfectie
- 24 uur voorafgaand aan transfectie, plate 7,0 x 10 5 C2C12 cellen in één putje van een zes-well plaat voor elke transfectie.
Opmerking: Dit leidt tot 50-60% confluentie op het moment van transfectie. - Laat het transfectiereagens tot kamertemperatuur vóór gebruik te komen.
- Voeg 2 ug plasmide DNA (GFP-CUG5 of GFP-CUG200) in 200 ul voorverwarmde serum vrij medium en vortex kort. Voeg 6 ul transfectiereagens aan het medium toe en meng onmiddellijk voor 30 sec met een vortex. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verander het medium van C2C12 cellen aan 2,5 ml serumvrije groeimedia. Voeg het transfectiemengsel aan de cellen na incubatie. Zet de platen een 5% CO2, 37 ° C incubator.
- Houd de cellen in transfectiemengsel / serumvrije groeimedia voor 4 uur of tot overnacht. Verander media terug naar de groei media de volgende dag of wanneer cytotoxiciteit is duidelijk.
Opmerking: Cytotoxiciteit wordt beoordeeld door microscopische inspectie van het ceLLS. Let op de veranderingen in de cel morfologie en cel onthechting. Zolang er geen openlijke cytotoxiciteit, overnacht incubatie in serumvrije groeimedia verhoogt transfectie. - Selecteer de cellen 48 uur na transfectie door toevoeging van 1,2-1,6 mg / ml G418 voor ~ 10 dagen tot de controlecultuur (getransfecteerd zonder de plasmiden) geen levende cellen hebben. Verander het medium elke twee dagen met groeimedium aangevuld met G418.
- Handhaaf de G418 resistente cellen in groeimedium en 5% CO2 bij 37 ° C voor daaropvolgende experimenten.
- 24 uur voorafgaand aan transfectie, plate 7,0 x 10 5 C2C12 cellen in één putje van een zes-well plaat voor elke transfectie.
- Retrovirus voorbereiding en C2C12 retrovirale transductie
- Bereid HEK 293 kweekmedium door toevoeging DMEM hoge glucose met 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine.
- Ongeveer 24 uur voorafgaand aan transfectie, plaat 4,0 x 10 6 ecotropische HEK 293-cellen gebaseerde verpakking in een 100 mm plaat (80% confluentie op transfectie) containing celkweekmedium.
- Laat het transfectiereagens tot kamertemperatuur vóór gebruik te komen.
- Meng 15 ug plasmide DNA (pMSCV-Puro of pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml serumvrij groeimedium. Vortex kort. Voeg 30 ul transfectiereagens uit stap 2.2.2 in het DNA / serumvrije groeimedium buis en meng goed met behulp van vortex. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Voeg transfectiemengsel druppelsgewijs aan het ecotrope HEK 293-cellen gebaseerde verpakking. Zwenk de platen en terug te keren ze terug naar de 5% CO 2, 37 ° C incubator. Na 24 uur, veranderen de media om 10 ml voorverwarmde vers groeimedium.
- Oogst de supernatant (bevattende retrovirus) 48 uur na transfectie met een pipet breng de supernatant in een 50 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml warm nieuwe media op de plaat en terug naar de incubator. Houd de supernatant bij 4 ° C.
Opmerking: De media wordt voorzichtig toegevoegd aan tHij kant van de put zodat niet de cel monolaag verstoren. - Oogst de tweede partij van de supernatant 60 uur na transfectie en het zwembad met de bovenstaande vloeistof uit 2.2.5. Centrifugeer bij 500 xg, 4 ° C gedurende 7 min om celafval te verwijderen.
- Breng het supernatant in een nieuwe 50 ml centrifugebuis. Gebruik retrovirus C2C12 transduceren op dit punt, door een stap 2.2.9 of aliquot en bewaar de bovenstaande vloeistof bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
- Ontdooi de retrovirus uit 2.2.7 bij kamertemperatuur in een bevroren voorraad hier wordt gebruikt.
Opmerking: Vermijd meerdere vries-dooi cycli. - Plaat C2C12 cellen op dezelfde dag van transductie streven naar 30-40% confluentie.
- Gooi het groeimedium en was C2C12 cellen met 3 ml PBS kamertemperatuur. Verwijder de PBS, voeg 500 ul 0,25% trypsine-EDTA en incubeer de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min.
- Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 3 ml groei medium. Pipet 6-8 keer om de cellen te schorten. Aantal cellen met een hemocytometer en voeg 8,0 x 10 5 cellen C2C12 een 60 mm plaat.
- Voeg 0,5 ml retrovirus een 60 mm plaat van cellen te infecteren in 3 ml groeimedia. Zet de plaat naar de incubator.
- Vervangen door 3 ml vers medium aangevuld met antibiotische selectie (puromycine 1-3 ug / ml) 48 uur na infectie. Vervang 3 ml medium met antibiotica elke dag voor ~ 5 dagen tot de getransduceerde C2C12 controle cultuur sterft uit.
- Bereid HEK 293 kweekmedium door toevoeging DMEM hoge glucose met 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine.
- Lentivirus voorbereiding en C2C12 lentivirale transductie
Opmerking: Voer alle-lentivirus gerelateerde procedures in Biosafety Level 2 kast en volg biologische veiligheidsrichtlijnen. Vloeibaar afval dat het virus moeten vóór verwijdering worden gedesinfecteerd.- Plaat 4,0 x 10 6 293T cellen in een 100 mm plaat (-80% confluentie op de dag van transfectie) met HEK 293 celkweekmedium (DMEM hoog glucose, aangevuld met 10% foetaalrunderserum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine) 24 uur voor transfectie.
- Verwarm het transfectiereagens tot kamertemperatuur. Meng de lentivirale verpakkingsvectoren (4 ug pMD2.G en 6 ug psPAX2) met 8 ug lentivirale transfervector (Celf1 shRNA of scrambled controle shRNA) in 1 ml serumvrij celkweekmedium. Vortex kort.
- Voeg 36 ul voorverwarmde transfectiereagens aan het DNA / DMEM buis en meng goed door vortex. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Verwijder de 293T cellen uit de incubator en voeg het transfectie mengsel aan de plaat. Zwenk de plaat en vervolgens terug naar 5% CO 2, 37 ° C incubator. Na 24 uur werd vervangen transfectie mengsel met 10 ml vers kweekmedium.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof bevattende lentivirus 48 uur na transfectie en overzetten in een 50 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml warm nieuwe media op de plaat en retournerenincubator. Bewaar het supernatant bij 4 ° C.
- Verzamel de tweede partij van de supernatant 60 uur na transfectie en deze combineren met de bovenstaande vloeistof uit 2.3.5. Centrifugeer kort bij 500 xg, 4 ° C gedurende 7 min.
- Breng het supernatans in een verse 50 ml centrifugebuis. Als het gebruiken van verse virus, ga dan naar stap 2.3.9. Voor toekomstig gebruik, opslag virus-bevattende supernatans bij -20 ° C in porties van 10 ml.
- Ontdooi het virus 2.3.7 bij kamertemperatuur voor gebruik als een ingevroren voorraad wordt gebruikt.
Opmerking: Vermijd meerdere vries-dooi cycli. - Plate C2C12-CUG200 cellen (verkregen in paragraaf 2.1) zoals beschreven in 2.2.9 op dezelfde dag van transductie.
Opmerking: Streef naar 30 - 40% van de samenvloeiing. - Voeg 0,5 ml virus op een 60 mm plaat van C2C12-CUG200 infecteren en de terugkeer van de plaat naar de incubator.
- Vervang het kweekmedium door vers medium aangevuld met de selectie antibioticum (puromycine 1-3 ug / ml) 72 uur na transductie.Vernieuwen cultuur media elke dag met de selectie antibioticum voor ~ 5 dagen tot alle niet getransduceerde C2C12-CUG200 controlecultuur sterft uit.
- Gebruik Western blot om Celf1 knock-down te controleren in GFP-CUG200 getransfecteerde cellen.
3. C2C12 Celdifferentiatie
- Plate 2 x 10 6 cellen in een putje van een 6-wells plaat in 2,5 ml groeimedium 24 uur voor aanvang van differentiatie.
Opmerking: De uitplaatdichtheid kan worden afgesteld dat volledige confluentie bereikt in 24 uur.- Spoel confluente cellen met PBS en voeg 2,5 ml van laag serum differentiatie medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium gesupplementeerd met 2% paarden serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, en 1 uM insuline) . Vervang het medium elke twee dagen.
Let op: Houd voorraad insuline bevroren en voeg deze toe aan de media op elk medium verandering.
- Spoel confluente cellen met PBS en voeg 2,5 ml van laag serum differentiatie medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium gesupplementeerd met 2% paarden serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, en 1 uM insuline) . Vervang het medium elke twee dagen.
- Tijdens C2C12 differentiatie, het verzamelen van monsters voor quantieve RT-PCR (zie hoofdstuk 4) op de volgende tijdstippen: Day0, 1, 2, 4 en 6. Werkwijze van de cultuur voor immunokleuring op dag 6-8 (zie paragraaf 5).
4. RNA isolatie en kwantitatieve RT-PCR
- Gebruik protocol van de fabrikant voor RNA-isolatie. Na isolatie, resuspendeer de RNA pellet in 30 pi RNase-vrij water en pipet op en neer meerdere malen.
Opmerking: De monsters overgaan tot kwantitatieve RT-PCR en kan bij -80 ° C opgeslagen. - Gebruik een RT-qPCR kit voor Kwantitatieve RT-PCR 10 en volg de instructies van de fabrikant. Bereid het reactiemengsel volgens tabel 1.
| bestanddeel | Volume (pl) | eindconcentratie |
| 2x reactiebuffer | 10 | 1x |
| voorwaartse primer | 0.5 | 200 nM |
| Reverse primer | 0.5 | 200 nM |
| Sonde | 0.5 | 200 nM |
| Reverse transcriptase en RNase Inhibitor | 0.1 | 0,25 U / ml |
| Sjabloon | 1 | 100 ng totale RNA |
| RNase vrij water | 7.4 | NA |
| Total Mix | 20 |
Tabel 1. Kwantitatieve RT-PCR Master Mix Bereiding
- Voer een 20 pl RT-qPCR reactie middels thermisch profiel Tabel 2.
| Reverse transcriptie stap | 30 min, 48 ° C |
| DNA-polymeerase activering / reverse transcriptase inactivatie | 10 min, 95 ° C |
| 40 Cycles | 15 sec, 95 ° C |
| 1 min, 60 ° C |
Tabel 2. De kwantitatieve RT-PCR thermisch profiel
5. Immunokleuring
- Bevestig de monolaag kweek in 2,5 ml vers bereide 4% paraformaldehyde / PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Permeabilize de monsters in 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de monsters naar een vochtige kamer. Blokkeer de monsters in 2,5 ml blokkerende buffer (0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof / PBS, 10% normaal geit serum) gedurende 30 min bij 37 ° C.
- Gooi blokkeerbuffer en breng 800 ul primaire antilichaam tegen de zware keten van myosine verdund in het blokkeren van buffer (1: 100). Incuberen in een bevochtigde kamer overnacht bij kamertemperatuur.
- Was de plaat 3 times (10 min elk) met 2,5 ml wasbuffer (0,1% polysorbaat 20 / PBS) op dag 2.
- Verwijder de wasbuffer en breng 800 ul secundair antilichaam (geit anti-muis IgG, 1: 500 verdund in PBS). Incuberen in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was twee keer (10 min elk) met 2,5 ml wasbuffer.
- Incuberen met 800 ui DAPI (1 ug / ml, verdund in gedestilleerd gedeïoniseerd H2O) gedurende 5 min.
- Wassen met 2,5 ml wasbuffer opnieuw gedurende 10 min.
- Verander de wasbuffer tot 2,5 ml PBS en het gebruik van een fluorescentiemicroscoop om beelden vast te leggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C2C12-cellen werden getransfecteerd met GFP-CUG5 of GFP-CUG200. Na resistentie selectie werden stabiele pools opgericht, die worden gevisualiseerd kan door GFP expressie (Figuur 1A). Myotube formatie in het gedifferentieerde myoblasten werd gedetecteerd door immunokleuring myosine zware keten 10 (figuur 1B). De kwantificering van myotube formatie aangetoond dat fusie indices werden afgenomen van 35,4 ± 4,1% tot 2,6 ± 1,1% en myotube gebieden werden afgenomen van 35,6 ± 2,2% tot 2,7 ± 0,8% door abnormale CUG expansie in GFP-CUG200 (figuur 1C). De fusie index en het myotube gebied geteld via het totale aantal kernen in myotubes (≥ 2 kernen) gedeeld door het totale aantal kernen en het percentage van het totale beeldgebied onder myotuben respectievelijk. Real-time RT-PCR 10 werd uitgevoerd om expressie te analyseren voor een aantal verschillende spieriation gerelateerde genen waaronder MyoD, MyoG, MEF2C en Celf1. Vergeleken met CUG5 culturen CUG200 verhoogde de expressie van mRNA in Celf1 prolifererende myoblasten begin differentiatie. Congruent met eerdere verslagen, werd Celf1 opregulatie geassocieerd met CUG-expansie in myogene dystrofie 1 (figuur 1D). Verder, Western blotting 10 consequent toonde Celf1 eiwit niveau werd verhoogd (figuur 1E), en CUG200 remde de expressie van MyoD, MyoG en MEF2C tijdens differentiatie (figuur 1D). Deze resultaten suggereren dat de CUG-expansie leidt tot gebreken en verminderde myoblast differentiatie myotube.
Om de rol van Celf1 in myoblast differentiatie te bestuderen, werd pMSCV- Celf1Flag retrovirale vector geconstrueerd om C2C12 transduceren. 10 Puromycine-resistente klonen werden samengevoegd voor differentiatie studies. Western blot resultaten toonden dat de Flag-tagged Celf1 was alleen aanwezig in de pMSCV Celf1Flag-getransduceerde kweken en de expressie van Celf1 eiwit werd opgereguleerd (figuur 2A). De vorming van myotubes in Celf1-overexpressie cellen is zeldzaam in vergelijking met de controlekweken (Figuur 2B), hetgeen suggereert dat overexpressie van Celf1 extreem beperkt myoblast differentiatie.
Om te bepalen of Celf1 knockdown redt de differentiatie tekort aan CUG-expansie cellen, werd Celf1 shRNA om GFP-CUG200 cellen geleverd door lentivirale vectoren. Dubbele resistente klonen (G418 en puromycine) werden geselecteerd en samengevoegd voor differentiatie studies. Het niveau van endogene Celf1 eiwit werd sterk gereduceerd in de aanwezigheid van Celf1 shRNA (Figuur 3A). Na 6 dagen van differentiatie, het effect van Celf1 shRNA tot versterking myotube formatie duidelijk (Figuur 3B). Fusion indices en myotube zijnevenals 16,1 ± 3,0% en 15,2 ± 1,2%, respectievelijk, vergeleken met 4,6 ± 0,8% en 5,1 ± 1,3% in controlekweken (Figuur 3C). Ondertussen, real-time RT-PCR resultaten suggereren dat de expressie van MyoD, MyoG en MEF2C aanzienlijk Celf1 shRNA-cellen (Figuur 3D) ondersteunen Celf1 knock-down gered myocyten differentiatie tekort werd verhoogd.
Figuur 1. CUG-Expansion Remt Myocyte Differentiatie in C2C12 cellen. (A) C2C12 cellen tot expressie GFP-CUG5 of GFP-CUG200 alomtegenwoordig na selectie. Schaal bars zijn 100 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige papier 10. (B) myotubes werden GFP-CUG5 cellen gevormd, maar minder in GFP-CUG200 cellen. Myotubes werden zichtbaar gemaakt door myosine zware keten (MF-20) immunokleuring. Schaalbalken zijn 100 urn. (C) (D) Real-time RT-PCR analyse van Celf1, transcriptiefactoren MyoD, MyoG en MEF2C expressie tijdens myoblast differentiatie. mRNA niveaus werden uitgezet nadat de GAPDH genormaliseerd. De fout balken geven standaarddeviaties. Student's t test werd uitgevoerd om de proeven te vergelijken met controles. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-CUG200 transfectie verhoogde Celf1 eiwitexpressie. ß-actine wordt getoond als de laad controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Overexpressie van Celf1 schaadt myoblast Differentiatie. (A) Het bewijs van exogeen Celf1Flag Expression in C2C12 cellen door Western blot. (B) myotube formatie werd verstoord in Celf1Flag-overexpressie C2C12 myoblasten. Myotubes werden zichtbaar gemaakt door MF-20 immunokleuring. Schaal bars zijn 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Knockdown van Celf1 Gedeeltelijk Rescues CUG-Expansion-Induced myoblast Differentiatie Deficiency. (A) Bewijs van Celf1 knockdown door Western blot. (B) Celf1 shRNA geïnduceerde vorming myotube in GFP-CUG200 myoblasten. Myotubes werden zichtbaar gemaakt door MF-20 immunokleuring. Schaal bars zijn 100 micrometer. (C) Celf1 shRNA-gered cellen die fusie-index en myotube gebieden was toegenomen. De fout balken geven standaarddeviaties. (D) Real-time RT-PCR analyse van Celf1, transcriptiefactoren MyoD, MyoG en MEF2C expressie tijdens differentiatie. mRNA werd uitgezet na normaliseren die van GAPDH. De fout balken geven standaarddeviaties. Student's t test werd uitgevoerd om de proeven te vergelijken met de controle. n> 3, * P <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C2C12 cellijn is gebruikt als een model om myogenesis 11-14 bestuderen. Deze cellen behouden een fibroblast-achtige look, prolifereren snel in media die 20% foetaal runderserum en gemakkelijk differentiëren in media die 2% paarden serum 15. De snelle groei en differentiatie zijn voordelige eigenschappen in een myogenesis cel model. Hier tonen we het gebruik van plasmide, retrovirale en lentivirale vectoren om cDNA, 3'-UTR en shRNA introduceren in C2C12-cellen. De kritische punten voor transfectie / transductie en het onderhoud van de consistentie in de differentiatie worden hieronder aangegeven.
De celdichtheid in het dagelijkse celonderhoud kritisch. Deze cellen dienen beneden 50 worden gekweekt - 70% confluentie. Door de korte populatieverdubbelingstijd, hoge samenloop (> 70%) C2C12 cultuur onderscheidt spontaan toen 's nachts vertrokken. Terwijl de fractie van spontaan gedifferentieerde cellen klein zijn, de aanwezigheidvan gedifferentieerde cellen zal bijdragen tot inconsistenties in de daaropvolgende differentiatie experimenten. Bovendien vers ontdooid C2C12 cellen die lage passage nummer hebben de voorkeur. Voor differentiatie, worden de cellen uitgeplaat bij vooraf bepaalde nummers, zodat ze vol samenvloeiing bereiken na 24 uur. Insuline wordt ingevroren bewaard in kleine hoeveelheden en wordt elke keer dat de differentiatie medium wordt veranderd toegevoegd. Deze maatregelen verbeteren differentiatie resultaten.
Serumvrij medium verbetert C2C12 celtransfectie. De cellen kunnen 's nachts worden geïncubeerd in transfectie mengsel / serum vrije media. In ons laboratorium, bereiken we tot 20% transfectie, vergezeld van lichte tekenen van cytotoxiciteit. De concentratie geneesmiddel gebruikt C2C12 cellen selecteren hoger, 1,2-1,6 mg / ml G418 of 1-3 ug / ml puromycine en de duur van de selectie is langer dan de meeste andere cellijnen. Vanwege mogelijke toxiciteit bij hoge geneesmiddelconcentratie en de verlengde incubatieperiode van batch tot batchvariatie in differentiatiepotentieel kunnen ontstaan. Het is cruciaal om de selectieschema (concentratie en) gebaseerd op Celweergave passen en de experimenten en controlegroepen samen behandelen.
We hebben met succes geïntroduceerd GFP-CUG200 in C2C12 cellen die 3'-UTR CUG expansie in DM1 reproduceren. Introductie van Celf1 in C2C12 cellen en Celf1 shRNA in GFP-CUG200 C2C12 cellen is de evaluatie van de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen veroorzaakt door Celf1 opregulatie en verkenning van targeting Celf1 te helpen DM1 myoblast differentiatie, dat is toegestaan. Samengevat, de C2C12 myoblast hier gepresenteerde model profiteert het onderzoek naar myotone dystrofie alsmede algemene spiercel biologie en myogene differentiatie. De beperking van dit model is dat de bevindingen in cellijnen kunnen niet volledig uit te breiden tot organismen. De bevindingen in de huidige modellen zijn vaak gevorderd tot het isoleren van verse myoblasten van dieren en het bestuderen van hun differentiatie. Uiteindelijk onderbouwen we myoblast bevindingen in organismen.
De unieke kracht van deze studie is de multi-tier genmanipulatie in C2C12 myoblasten, waarmee het modelleren van de sequentiële genetische / pathologische gebeurtenissen in DM1. Eerder, de RNA toxiciteit effect van DMPK CUG expansie werd gedocumenteerd in myoblasten 11-14, terwijl de pathologische rol van Celf1 afzonderlijk werden bestudeerd in muismodellen 16,17. Het modelleren van deze sequentiële genetische / pathologische gebeurtenissen is technisch uitdagend en tijdrovend indien uitgevoerd in diermodellen. Zoals aangetoond in deze studie, het gecombineerde gebruik van fluorescente en resistente markers maakt de modellering van bijkomende moleculaire gebeurtenissen bij myotone dystrofie. De in dit onderzoek vastgestelde modellen zou nuttig zijn bij het ontleden van de gedetailleerde mechanismen in DM1 pathogenese zijn. Zij zouden ook waardevol bij het screenen op geneesmiddelen die verschillende stappen van DM1 pathogenese doelwit. De strategieën en procedures van dezeonderzoek kan licht werpen op tot vaststelling van andere spierziekte modellen in myoblasten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
