Abstract
وقد استخدم احتشاء عضلة القلب الناجم عن ربط الشريان التاجي في العديد من النماذج الحيوانية كأداة لدراسة آليات إصلاح القلب وتجديد، وتحديد أهداف جديدة للعلاجات. على مدى عقود، وجدت نماذج من تجديد القلب الكامل في البرمائيات والأسماك، ولكن كان نظيره الثدييات غير متوفر. وقد أدى هذا الاكتشاف الأخير من نافذة ما بعد الولادة خلالها الفئران تمتلك قدرات التجدد لإنشاء نموذج الثدييات تجديد القلب. ويرد نموذج الجراحي لاعادة التجديد القلبي الثدييات في الماوس حديثي الولادة في هذه الوثيقة. لفترة وجيزة، يتم تخدير بعد الولادة اليوم 1 (P1) الفئران عن طريق الأيزوفلورين وضعها على وسادة الجليد للحث على انخفاض حرارة الجسم. بعد فتح الصدر، وتصور الأمامي الأيسر الشريان التاجي النازل (LAD)، يتم وضع خياطة حول الفتى لإلحاق نقص تروية عضلة القلب في البطين الأيسر. العملية الجراحية يستغرق 10-15 دقيقة. تصور الشريان التاجي هوحاسمة لوضع دقيق خياطة والتكاثر. وأكد احتشاء عضلة القلب وضعف القلب عن طريق ثلاثي فينيل-نتروبلو كلوريد (TTC) تلطيخ وتخطيط صدى القلب، على التوالي. يتم التحقق من تجديد كامل 21 يوما احتشاء عضلة القلب آخر من الأنسجة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لكأداة لتوضيح آليات تجديد القلب الثدييات بعد احتشاء عضلة القلب.
Introduction
احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، ويبقى مسؤولا عن حوالي ثلث حالات قصور القلب 1. في حين قدوم تدخل عن طريق الجلد والتحسين المستمر لاستخدام thrombolytics زاد ضخه التالية MI، الموت cardiomyocyte وفقدان عضلة القلب مقلص ذلك يحدث. تبقى هناك أيضا أعداد كبيرة من المرضى "لا خيار" الذين ليسوا مرشحين لأو لا نرى فائدة من هذه التدخلات. يستمر هؤلاء المرضى لتجربة نقص التروية تعطيل يؤدي إلى ندبة تشكيل وضار إعادة البطين كآلية للشفاء احتشاء. هذه العملية يؤدي في نهاية المطاف إلى فشل القلب، والتي لا يزال سوء التشخيص على الرغم من إدارة الدوائية المثلى مع الإنزيم (ACE) مثبطات المحول للأنجيوتنسين وحاصرات بيتا. وللأسف، فإن معدل وفيات سنة واحدة للمرضى الذين يعانون من ضعف شديد في وظائف البطين الأيسر لا يزال كمايصل الى 26٪ 2. زرع القلب هو خيار العلاج النهائي للمرضى المصابين بقصور في القلب. ومع ذلك، فإن تجمع المانحين محدود لزرع القلب لا يجعل هذا خيارا قابلا للتطبيق بالنسبة لمعظم المرضى. وهكذا، فإن اكتشاف العوامل العلاجية رواية لاستعادة عضلة القلب التالفة لا يزال بالغ الأهمية في حل مشكلة مرض القلب. وبالتالي هناك حاجة النماذج الحيوانية موثوقة للإصابة القلب باعتباره عنصرا حاسما في هذه العملية.
قد أملى العقيدة التقليدية التي العضلية الكبار هي مرحلة ما بعد الإنقسامية، لا شفاء خلايا متمايزة، قادرة على تقسيم أو إلغاء التمييز لاستبدال عضلة القلب التالفة 3. على هذا النحو، يمكن أن الكبار قلب الثدييات أبدا على التعافي تماما من الاصابة، وسيتم استبدال العضلية فقدت مع النسيج الليفي. وهكذا، ركزت الأبحاث في المقام الأول على العوامل العلاجية للحد من التوسع احتشاء وتقليل تشكيل ندبة. لكن في الآونة الأخيرة، حدث تحول جذريفي التفكير المحيطة شفاء القلب والعديد من الجهود البحثية تم توجيهها إلى التركيز على إمكانية تجديد القلب 4.
حتى وقت قريب، كان مقتصرا في الجسم الحي دراسة تجديد القلب إلى نماذج غير الفقارية، مثل تلك الموجودة في البرمائيات والأسماك مكتملة العظام urodele 5-7. ومع ذلك، فقد أدى اكتشاف القدرة على تجديد القلب في الماوس حديثي الولادة في تطوير نموذجين الجراحي لاعادة التجديد القلبي الثدييات: استئصال انسداد الشريان التاجي مهيمنة والقلب للحث على احتشاء عضلة القلب 8،9. في عام 2011، تم استخدام الماوس نموذج تقاطع رئيسية لإثبات أن تجديد القلب الكامل هو ممكن في يوم ما بعد الولادة 1 (P1). ومع ذلك، تنخفض هذه القدرة بسرعة بعد فترة ما بعد الولادة الأولى. قلب الثدييات يفقد قدرته على التجدد بعد الولادة في P7 كأرقام خلية سلفية انخفاض فترة وجيزة، والعضلية تصبح binucleated، وتفقدالكفاءة التكاثري، ووبشكل دائم الخروج من 10،11 دورة الخلية. فهم الاختلافات الجوهرية بين حديثي الولادة والقلب الثدييات الكبار قد تؤدي إلى رؤى جديدة في تجديد القلب.
في حين استئصال مهيمنة يقدم في الواقع نظرة ثاقبة إعادة نمو الأنسجة مقلص، نموذج لا محاكاة إصابة القلب الإنسان نموذجية، وبالتالي لا تصلح كذلك لتطوير علاجات. نموذج انسداد الشريان التاجي، ومع ذلك، يحاكي بشكل مباشر الجوانب الفسيولوجية المرضية من MI علم الأمراض، وبالتالي قد توفر معلومات أكثر فائدة في الآليات التي يمكن أن تنطبق على التقدم العلاجي للاستخدام البشري.
وقد استخدم ربط الشريان التاجي الجراحية كأسلوب التجريبية مفيدة في العديد من النماذج الحيوانية 12-14. في الشريان التاجي نموذج ربط الكبار، يتم تخدير الحيوانات ومدخل أنبوب للسماح فتح تجويف الصدر مع الحفاظ على respiratiعلى. لا يزال القلب ينبض بانتظام، والسماح التصور من الأوعية الدموية التاجية، والسماح للدقيق وضع خياطة. وعلاوة على ذلك، لا يزال قلب وردي مع استمرار التروية، وبعد ربط يظهر عضلة القلب الإقفاري شاحب، مشيرا إلى نجاح عملية ربط الشريان التاجي. بروتوكول صفها للفئران حديثي الولادة، ومع ذلك، هو أقل موثوقية لا يتم تصوير الشريان التاجي والجراح يجب أن يقدر فيها لوضع الخيط 15. على الرغم من أن التشريح العام من الأوعية الدموية التاجية هو نفسه، وتقلب الحيوان الفردي في اتجاه والمتفرعة من LAD موجود 16. وهكذا، عندما "تسير في الأعمى،" الشريان يمكن أن تضيع بسهولة. ثم يطلب من التقنيات الأخرى مثل تخطيط صدى القلب لتأكيد الحث الناجح لMI، وضمان جميع العمليات الجراحية تؤدي إلى حجم احتشاء مماثل. ووصف هنا تحسنا على طريقة نشر مؤخرا 15، حيث موقف LAD يمكن إنشقد يكون ligated أسسنا وبالتالي LAD للحث على بتكاثر MI.
لا يتطلب هذا الأسلوب التنبيب الرغامي أو التهوية الميكانيكية، وبضع الصدر في حالة تخفيض درجات الحراره في الماوس حديثي الولادة لا يؤدي إلى انهيار الرئة. ومع ذلك، في الطريقة الموصوفة سابقا، يجب أن يتسبب انخفاض درجة الحرارة الشديد لدرجة كل من توقف التنفس أثناء كاملة ووقف إيقاع القلب 15. الحد الرئيسي لهذا النهج هو أن الشريان التاجي لم يعد perfused ويظهر القلب شاحب حتى قبل LAD ربط. في نهج الموصوفة هنا، والتصور الشريان التاجي هو ممكن في لحظة من سبات قبل انخفاض حرارة الجسم عميق والقلب وقف الإيقاع، مع الشفاء التام من الماوس حديثي الولادة بعد الجراحة. هذا الأسلوب يوفر ميزة كبيرة من 100٪ التكاثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء أزواج تربية C57BL / 6 و CD-1 الفئران IG-S من نهر تشارلز. تم التعامل مع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان، وتمت الموافقة على بروتوكولات الدراسة من قبل اللجنة الفرعية استخدام الحيوان في جامعة ويسترن، لندن، كندا.
1. رعاية الحيوان
- بعد الولادة كاملة وكانت الجراء في البداية الثدي التي تغذيها والدتهم لبضع ساعة، ووضعها في قفص مختلفة مع الحاضنة الأم CD-1. أمهات CD-1 عرض النمط الظاهري أكثر هدوءا مع غريزة تعزيز قوية، ولديهم ميل أقل لتفكيك الجراء جرح 15 آخرين.
2. جراحة
- حمل التخدير عن طريق وضع الجرو في غرفة الأيزوفلورين مختومة (حوالي 500 ميكرولتر من 100٪ ت / ت الأيزوفلورين سمحت لتبديد أكثر من 1300 سم 3 غرفة). الحفاظ على الماوس في الغرفة حتى وقف حركة (حوالي 30 ثانية).
- إزالة مواستخدام من غرفة الأيزوفلورين وإحداث التخدير منخفض الحرارة عن طريق وضع الماوس على الجليد الرطب. لتجنب قضمة الصقيع، ضع الثلج داخل القفازات الجراحية المعقمة، والتفاف الماوس داخل القفازات وتغطية قفاز مع الثلج أو التفاف الماوس في الشاش الرطب معقم ووضعه على الجليد.
ملاحظة: الفئران بارد بشكل أسرع عند الاتصال مع الجليد على مساحة أكبر، وعلى هذا النحو الجليد ذاب يمكن تقصير انخفاض حرارة الجسم مرة الاستقراء. - تأكيد التخدير بسبب عدم استجابة الحركة حتى القدمين، وذيل قرصة.
ملاحظة: وقف حركة أثار يحدث في درجة حرارة الجسم بين 15 درجة مئوية و 8 درجات مئوية. (التبريد الوقت لهذه الدرجة حوالي 1 دقيقة). ليس مطلوبا توقف التنفس أثناء كاملة وتوقف الانقباض لLAD ربط. - نقل السرير الثلج على منطقة العمليات الجراحية مجهزة مجهر التشغيل. تأكد من أن الجرو الماوس يبقى على الجليد أثناء إجراء العمليات الجراحية كله.
ملاحظة: منطقة العمليات الجراحية والشاش والأدوات الجراحية ويجب تعقيم. Maintaفي المجال المعقم في جميع أنحاء الداخلي، وارتداء استخدام مرة واحدة، والقفازات الجراحية المعقمة. ليس مطلوبا مرهم للعين كما ولدت الفئران مع عيونهم مغلقة 17 عاما. - وضع الجرو الماوس في حق وموقف استلقاء الجانبي. تطهير الصدر عن طريق المسح برفق مع حل بوفيدون اليود تليها مسحة الإيثانول.
- أداء شق الجلد على صدره الأيسر على طول خط منتصف الإبط عن طريق قطع الجلد بين سيفي الشكل والإبط الأيسر بضعة ملليمترات أسفل الرجل الاماميه اليسرى. أيضا استخدام المقص لقطع طريق طبقة العضلات الصدرية الأساسية.
- أداء بضع الصدر الأيسر في الفضاء وربي ال 4 عن طريق فصل الأضلاع والعضلات الوربية بالملقط.
ملاحظة: الأضلاع حديثي الولادة هشة جدا ويمكن كسرها بسهولة. لتجنب هذا، بلطف الأضلاع منفصلة عن طريق فتح ملقط على طول العضلات الوربية (بدلا من استيعاب الأضلاع). - تصور الأمامي الأيسر النازل الشريان التاجي (LAD) الناشئة من أور اليسارICLE وراء الوريد الرئوي وتنازلي خارج الوريد القلبي الكبير.
ملاحظة: في هذا الإطار حديثي الولادة في وقت مبكر، وغالبا ما تصور الغدة الصعترية، ويمكن تغطية جزء من قاعدة القلب. يمكن أن ينظر إلى الفتى الناشئة بجوار موقف الغدة الصعترية، اعتمادا على زاوية من شق الصدر. - Ligate الفتى عن طريق تمرير الخيط 11-0 النايلون (0.007 مم إبرة) تحت الشريان خلال منتصف البطين تحت الأذن اليسرى (الشكل 1C). ويؤكد نقص التروية مع ابيضاض من عضلة القلب أقل من الموقع خياطة (الشكل 1G).
- إغلاق شق الصدر باستخدام 8-0 خيوط النايلون (0.15 مم إبرة). استخدام اثنين من الغرز لإغلاق الأضلاع. وضع كل من الغرز ضلع قبل ligating لضمان الإبرة لا ثقب الرئتين عندما يمر من خلال تجويف الجسم.
- بعد إغلاق الأضلاع، وإزالة الماوس من السرير الجليد. الحفاظ على الماوس داخل منطقة العمليات الجراحية ووضعه مباشرة على جراحية معقمة لأهلا وسهلا على وسادة التدفئة الحارة عند 37 درجة مئوية لبدء ارتفاع درجات الحرارة.
- مرة واحدة على منطقة معقمة ساخنة، أغلق العضلات وطبقات الجلد باستخدام 8-0 خيوط النايلون (0.15 مم إبرة). استخدام خياطة واحدة للطبقة العضلات واستخدام اثنين من الغرز لشق الجلد.
قد تكون مغلقة العضلات وطبقات الجلد على وسادة التدفئة للحد من انخفاض حرارة الجسم وقت التعرض: ملاحظة. تبدأ درجة حرارة الماوس ليرتفع مرة واحدة وضعها على وسادة التدفئة، ولكن لا تزال منخفضة بما فيه الكفاية بما فيه الكفاية لصيانة التخدير خلال العضلات والجلد الإغلاق.
3. استعادة الجراحي
- يستمر الاحترار السريع على وسادة التدفئة الحارة حتى عودة حركة عفوية. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. إزالة بوفيدون اليود والدم عن طريق المسح برفق موقع الإصابة مع مسحة من الإيثانول.
- بعد الشفاء كافية من التخدير، وإزالته من منطقة العمليات الجراحية المعقمة، وتشويه صورتها مع الفراش من الحضانةقفص الأم، والجرو عودة إلى تعزيز الأم. هذا يساعد على منع رفض الأم أو الإبدال.
ملاحظة: لا عودة الجراء إلى قفص مع غيرها من الحيوانات حتى تعافى تماما. إذا لم تستخدم والقمامة بأكملها، وتبقى تتزاحم مع الحاضنة الأم، ووضع الجراء تعافى في وسط القمامة. إذا إجراء العمليات الجراحية أكثر من واحد، واستكمال جميع العمليات الجراحية المطلوبة لالقمامة الفردية قبل أن تعود الفئران إلى الحاضنة الأم. - مراقبة سلوك الحاضنة الأم نحو الجرو كل 10-15 دقيقة لل2-3 ساعة لضمان قبول الجرو. إذا تعرض الأم العدوان نحو الجرو المصاب، وإزالة الجرو والموت ببطء عن طريق جرعة زائدة الأيزوفلورين (> 5٪، حتى وقف التنفس)، تليها قطع الرأس. ليس مطلوبا من قبل العمليات الجراحية أدوية تسكين الألم كما لا يتم تطوير ردود الفعل ألم مركزية تماما في هذه السن المبكرة 15: ملاحظة.
4. قياس عضلة القلب عائق الحجم 4 -6 ساعات بعد MI
- سماح الجراء للتعافي في رعاية الحاضنة الأم CD-1 لمدة 4-6 ساعة. إزالة الجرو من القفص مع والدته والموت ببطء من قبل جرعة زائدة الأيزوفلورين تليها قطع الرأس مع مقص كبير.
- استئصال القلب تحت المجهر تشريح، الحرص على عدم تمزق عضلة القلب.
- قطع الجلد من عملية سيفي الشكل إلى الجزء العلوي من الصدر. فتح جدار البطن تحت القفص الصدري. فهم أقل القفص الصدري وقطع طريق الضلوع وعضلات طوليا على طول خط منتصف الإبط الأيسر من الحجاب الحاجز إلى الإبط.
- عقد مقص في الطائرة عرضية وقطع بعناية من خلال الحجاب الحاجز من اليسار إلى اليمين. تأكد من وضع المقص تحت مستوى القلب وذلك لتجنب أي ضرر للقمة.
- فهم القفص الصدري وقطع الجانب الأيمن من الضلوع وعضلات على طول خط منتصف الإبط الأيمن. إزالة كافة الاتصالات الأوعية الدموية للقلب مع مقص. إزالة القلب من تجويف الصدر عن طريق الامساكالقاعدة.
- قسم القلب في ثلاث قطع باستخدام الجراحية الكربون الصلب شفرة حلاقة. يقطع المرحلة الأولى على طول محور قصيرة من القلب في منتصف الفترة الفاصلة بين خياطة وقمة القلب. جعل خفض الثاني على مستوى خياطة (الشكل 3A).
ملاحظة: هذا يترك قسم مهيمنة حوالي 0.75 مم وزنها 0.0018 غرام؛ قسم منتصف قاعدة حوالي 1 مم، ويزن 0.0065 غرام؛ وقاعدة للقلب. - ضع أقسام القلب في 1٪ 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة. بعناية مشاهدة عينة لتجنب الإفراط في تلطيخ.
- لزيادة التباين، وتحديد شرائح القلب الملون مع بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لحساب المنطقة احتشاء٪، صورة أقسام القلب وقياس المجال احتشاء في برامج التصوير. عضلة القلب قابلة للحياة بقع حمراء في حين يتم ترسيم منطقة احتشاء كما أبيض 18.
5. قياسوظيفة القلب عن طريق ضربات القلب بعد MI
- سماح الجراء للتعافي في رعاية الحاضنة الأم CD-1 لمدة 24 - 48 ساعة. حمل التخدير عن طريق وضع الجرو في غرفة الأيزوفلورين مختومة (5٪ الأيزوفلورين). الحفاظ على الماوس في الغرفة حتى وقف حركة (حوالي 30 ثانية).
- تأمين الجرو في موقف ضعيف في قفص الاتهام ساخنة (درجة الحرارة 37 درجة مئوية) مع أنفها في مخروط لتقديم 0،5-1٪ الأيزوفلورين (للصيانة التخدير). وضع ما قبل تحسنت جل صدى على منطقة الصدر اليسرى.
- الحصول على رأي محور طويل القص من البطين الأيسر (LV). ويتم الحصول على ضمان الصور دون مستوى خياطة في الوقف. بعد الحصول على موقف، وتحويل مسبار الموجات فوق الصوتية (40 ميغاهيرتز) 90 درجة للحصول على عرض المحور قصيرة القص، وسجل M-وضع الصور تخطيط صدى القلب.
- قياس ضغط الدم الانبساطي نهاية ووضع حد أقطار الداخلية الانقباضي البطين الأيسر من المحور القصير الصور M واسطة. حساب نسبة طرد وfractioتقصير نال.
6. قياس عضلة القلب عائق الحجم 24 ساعة بعد MI
- سماح الجراء للتعافي في رعاية الحاضنة الأم CD-1 لمدة 24 ساعة. إزالة الجرو من القفص مع والدته والموت ببطء من قبل جرعة زائدة الأيزوفلورين تليها قطع الرأس مع مقص كبير.
- فتح تجويف الصدر كما في الخطوة 4.2. قبل استئصال القلب، فهم بعناية الشريان الأورطي الصدري فقط فوق الحجاب الحاجز مع ملقط غرامة. عقد مقص غرامة في الطائرة الاكليلية، مسطحة ضد جدار الصدر، وقطع الشريان الأورطي الصدري قبالة جدار الصدر الخلفي المتحرك مقص في اتجاه الجمجمة.
- قطع الشريان الأورطي مجانية من جدار الصدر وأية اتصالات أخرى حتى تصل إلى القلب. استئصال القلب عن طريق استيعاب الوريد الأجوف العلوي وقطع كافة الاتصالات الأوعية الدموية الأخرى في الجسم.
- شطف القلب (الشريان الأورطي مع المرفقة) في المياه المالحة. بعناية يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي الصدري مع إبرة قياس 30 و ربطة عنقأورتا إلى قنية مع 8-0 النايلون خيوط الجروح.
- يروي القلب مع 1 مل من المياه المالحة من خلال الشريان الأورطي عن طريق إبرة قياس 30 بمعدل 1 مل / دقيقة. يروي القلب مع 150 ميكرولتر من 2٪ ايفانز حل الأزرق بمعدل 1 مل / دقيقة. إزالة القلب من قنية، قسم إلى ثلاثة أجزاء وصمة عار مع عقاري كما هو موضح في قسم 4.
- لحساب حجم احتشاء، صورة أقسام القلب وقياس المجال احتشاء في برامج التصوير. عضلة القلب قابلة للحياة بقع زرقاء، ومنطقة في البقع خطر أحمر، وترسيم منطقة احتشاء بيضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن الانتهاء من إجراء احتشاء عضلة القلب في P1 في 10-15 دقيقة ولديها معدل الوفيات من 7.8٪ (5 من أصل 64 الجراء). بعد الجراحة، والفئران على التعافي من التخدير منخفض الحرارة داخل المقبل 5-20 دقائق (الوقت الانتعاش يعتمد على درجة حرارة الجسم التي تم التوصل إليها أثناء التخدير وسرعة الجراح). عند استخدام الجراء P7 (للمقارنة مع عضلة القلب غير التجديدي)، مطلوب فترة أطول من التبريد للوصول إلى سبات. الجراء P7 هي أكبر من ذلك بكثير والحصول على مزيد من صعوبة شفاء من كل من إصابات القلب وانخفاض حرارة الجسم، مما يؤدي إلى معدل وفيات أعلى بكثير من 26.9٪ (14 من أصل 52 الجراء).
وأكدت نتائج الدراسات السابقة في هذه الوثيقة، مشيرا إلى التخدير منخفض الحرارة في ما يقرب من 10 درجة مئوية (بين 8 درجة مئوية و 15 درجة مئوية) 19. ضمن هذا الإطار درجة الحرارة ومعدل ضربات القلب يفعل بطيئة،ولكن إيقاع يستمر بمعدلات تتراوح بين 24 نبضة في الدقيقة و 11 نبضة في الدقيقة. معدل ضربات القلب وانخفاض في هذا المستوى من التبريد يقلل بشكل ملحوظ أثناء العملية النزيف. اللاعب يمكن تصور بسهولة وligated في درجات الحرارة هذه (الشكل 1). يبقى الفتى مرئية حتى تصل درجة حرارة الجسم بين 9.6 درجة مئوية و 4.9 درجة مئوية، مما تسبب في خفض معدل ضربات القلب إلى 2 نبضة في الدقيقة أو توقف الانقباض.
بعد ربط LAD في P1، الجراء على التعافي بشكل كامل وتنمو إلى حجم الجسم مماثلة لتلك الضوابط littermate. وبمجرد وضعها مرة أخرى مع الحاضنة الأم، الجراء استعادة قدرات الوعي والتغذية مماثلة لتتزاحم في حوالي 10 دقيقة. عند الفحص النسيجي 3 أيام بعد MI، هناك أدلة على احتشاء، مع تسلل خلايا التهابية، استجابة بعد احتشاء نموذجي (الشكل 2). في يوم 7 وظيفة-MI، تظهر الأنسجة البطين الأيسر طبيعية. بعد يوم 21 وظيفة-MI، ج كاملةحدث تجديد ardiac.
تم استخدام 6 ساعات بعد MI بمثابة تأكيد على الاستقراء ثابت من MI - 2،3،5-Triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) تلطيخ 4. وتمثل المنطقة الحمراء عضلة القلب قابلة للحياة وتمثل المنطقة البيضاء الأنسجة الميتة الدماغية. في ما مجموعه 13 عملية جراحية ربط LAD، وكانت 100٪ من قلوب محتشية، حيث يبلغ متوسط حجم احتشاء من 36٪ (الشكل 3). تم إجراء TTC تلطيخ مع ايفانز نضح الأزرق أيضا في 24 ساعة بعد MI لإثبات استمرار الأنسجة محتشية وقياس حجم احتشاء على أساس المنطقة في خطر (الشكل 4). في هذه القلوب، عضلة القلب قابلة للحياة بقع زرقاء، ومنطقة في البقع الحمراء خطر، وترسيم منطقة احتشاء بيضاء. تم حساب حجم احتشاء كنسبة مئوية من المنطقة للخطر. في 4 جراحات ربط LAD، وكانت 100٪ من قلوب محتشية، حيث يبلغ متوسط حجم احتشاء من 49٪ من المساحة المعرضة للخطر (الشكل 4).
<الطبقة ص = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> لتأكيد احتشاء تحريض، تم إجراء تخطيط صدى القلب في 24 و 48 ساعة بعد MI. في 24 ساعة بعد MI، الكسر القذفي (EF) تم تخفيض ملحوظ من 84٪ إلى 74٪، وتقصير كسور (FS) خفضت بشكل كبير من 50٪ إلى 40٪ (الشكل 5). قبل 48 ساعة بعد MI، تم تخفيض EF أبعد إلى 46٪، بالمقارنة مع 80٪ في الضوابط وتم تخفيض FS أيضا بشكل كبير إلى 25٪، بالمقارنة مع 50٪ في الضوابط. وعلاوة على ذلك، كان هناك انخفاض كبير في القطر الداخلي البطين الأيسر الانقباضي في 48 ساعة (الشكل 6). كان LV سمك الجدار الأمامي لم ينخفض في أي 24 أو 48 ساعة بعد MI بشكل ملحوظ (الشكلان 5 و 6).
الشكل 1. الشريان التاجي هو مرئي وخلال حديثي الولادة LAD الداخلي. P1 حديثي الولادة بالعربية الماوسثالثا تخدير تبريدي، شق الجلد، شق العضلات وبضع الصدر الجانبي في الفضاء وربي الرابع. أ) من اليسار الأمامي الشريان التاجي النازل (LAD) مرئيا. BD) يتم تمرير 11-0 النايلون خياطة من خلال منتصف البطين. E) LAD هو ligated وابيضاض لاحظ أدناه الموقع خياطة. F) وG) هي تكبير لأ) و E) على التوالي. بالخام. LAD، الأمامي الأيسر المغطي تنازلي الشريان. LA، الأذين الأيسر. LV، غادر البطين. GCV، كبير الوريد التاجي. السهم الأبيض، LAD. أسود رأس السهم، على مرأى ومسمع من الإضاءة. الحانات هي مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. دليل على اكتمال كارديميلان التجديد بعد LAD من ربط في الفئران حديثي الولادة. تلطيخ ثلاثي الألوان ماسون بعد ربط LAD في الفئران P1. وترد كلها قلوب وتكبير في المناطق احتشاء في اليوم 3 و 7 و 21 بعد ربط الفتى. ملاحظة فقدان العضلية والخلايا الالتهابية التسلل في المنطقة احتشاء في يوم 3 بعد MI (السهم الأبيض). كامل تجديد منطقة احتشاء ابتداء من يوم 7 وظيفة-MI. القليل من الأدلة من التليف وأشار في يوم 21 بعد MI. الحانات هي مقياس 200 و 100 و 50 ميكرون ل40X، تكبير 200X، و630X، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. حديثي الولادة LAD من ربط 100٪ استنساخه. أ) خطوط باجتزاء من القلب كله لإنشاء 0.75 ملم قطعة مهيمنة وقطعة 1 ملم منتصف قاعدة لTTCتلطيخ. B) صور الممثل عقاري الملون مراقبة صورية وLAD ligated القلوب. الحانات هي مقياس 1 مم. حجم C) عائق في 13 عملية ربط LAD في P1 الفئران حديثي الولادة. قلوب جمعت 4-6 ساعة بعد MI وحجم احتشاء يقاس بعد TTC تلطيخ. يشير الأحمر عضلة القلب قابلة للحياة. الأبيض يشير إلى نخر. البيانات يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. حديثي الولادة LAD من ربط النتائج في احتشاء موثوق. أ) حجم عائق كنسبة مئوية من المنطقة الدماغية بعد ربط LAD في P1 الفئران حديثي الولادة (ن = 4). تم جمع قلوب 24 ساعة بعد MI وقياس حجم احتشاء بعد ايفانز تلطيخ الأزرق وعقاري. الأزرق يدل على عضلة القلب قابلة للحياة. أحمر يشير إلى المنطقة في خطر. الأبيض يشير نecrosis. البيانات يعني ± SEM. B) صور الممثل ايفانز الأزرق وTTC LAD ملطخة قلوب ligated بعد ربط الفتى. مقياس بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. نتائج حديثي الولادة LAD من ربط في القلب الجنسي لدى الرجال في 24 ساعة بعد MI. تم تقييم وظيفة القلب عن طريق السونار. أ) الممثل M-وضع الصور على حد سواء صورية تشغيلها وLAD ligated الفئران. يشار إلى نهاية انبساط وانقباض نهاية السهام. ب) القياسات من تقصير كسور، جزء قذف، والقطر الداخلي البطين الأيسر في كل انبساط وانقباض. البيانات يعني ± SEM. N = 8 و 7 صورية وربط الشريان التاجي (كال) على التوالي. * P <0. 05. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. نتائج حديثي الولادة LAD من ربط في القلب الجنسي لدى الرجال في 48 ساعة بعد MI. تم تقييم وظيفة القلب عن طريق السونار. أ) الممثل M-وضع صور تظهر نهاية انبساط (الأسهم طويلة) ونهاية الانقباض (الأسهم قصيرة) لكل صورية تعمل وLAD ligated الفئران. ب) القياسات الوظيفية للقلب عن طريق السونار بما في ذلك تقصير كسور، جزء قذف، والقطر الداخلي البطين الأيسر في كل انبساط وانقباض. البيانات يعني ± SEM. N = 4 و 6 صورية وربط الشريان التاجي (كال)، على التوالي. * P <0.05، ** P <0.01.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وربط LAD الجراحية أثبتت هنا هو طريقة يمكن الاعتماد عليها لإنتاج MI في الفئران حديثي الولادة. يوفر هذا النموذج باحثين نماذج قابلة للتكرار مع الذي لدراسة تجديد قلب الثدييات. تصور من الأوعية الدموية التاجية هو مكون رئيسي لهذا الأسلوب، وضمان الصحيح وضع خياطة وبالتالي ضمان التكاثر. في حين فئران بالغة لا تمتلك قدرات متغير الحرارة، ويرتبط درجة حرارة الجسم ومعدل الأيض من الفئران حديثي الولادة بشكل وثيق مع درجة حرارة الغرفة. وعلاوة على ذلك، فإن صغر حجم الفئران حديثي الولادة يجعلها مثالية لتحريض تبريدي التي كتبها تبريد السطح. توقيت الجراحة ودرجة حرارة جسم الفأر حاسمة للتأكد من دقتها في تكرار هذا الإجراء، وبالتالي يجب أن تراقب بعناية. ربط في أقرب وقت ممكن بعد التوصل سبات يوفر فرصة لتصور ابيضاض من عضلة القلب بعد ربط، مما يؤكد نجاح العمليات الجراحية.
هناك موطرق ltiple التي يمكن استخدامها لتأكيد MI الاستقراء. وتشمل هذه تلطيخ TTC، وضربات القلب والتحليل النسيجي. تلطيخ TTC منخفضة التكلفة، يمكن استنساخه وموثوق بها، وأداء بسهولة مع إنتاجية عالية. لهذه الأسباب، وقد استخدم تلطيخ TTC على نطاق واسع. تخطيط صدى القلب يمكن استخدام التغيرات مراقبة غير جراحية في وظيفة القلب بعد MI على مر الزمن. يمكن البرهنة دليلا قاطعا من MI من خلال تحليل النسيجي. في هذه الدراسة، تم توظيف كل ثلاثة من التقنيات المذكورة أعلاه للتحقق من تحريض الناجح لMI.
تصور LAD أمر بالغ الأهمية لنجاح تحريض MI. إذا كان محقق لصعوبة تصور LAD (يرجع على الأرجح إلى تحريض انخفاض حرارة الجسم عميق)، يمكن رفع الأذن اليسرى قليلا مع ملقط، كجذر الرئيسي للLAD أكبر من القطاعات الأكثر القاصي وقد يكون أكثر وضوحا بسهولة. إذا لا يمكن تصور وLAD، ينبغي للمحقق لا يفترض لو الشريانالأيونات الموجبة. لا ينبغي أن تستخدم هذا الجرو لربط تجريبي، ويمكن أن يكون بدلا من استخدامها كما تعمل صورية السيطرة.
الإدخال الصحيح في تجويف الصدر في الفضاء وربي ال 4 مهم للحصول على التصور الأمثل والفضاء لربط الفتى. ويمكن تحقيق ذلك من خلال فرز دقيق للمسافات بين الضلوع. بالإضافة إلى ذلك، في حالة حدوث كمية بسيطة من النزيف أثناء العملية، ويمكن إزالته مع شاش معقم. إذا نزيف كبير، ومع ذلك، فإن الجراح قد المحتمل أن لا يبرد الماوس بشكل كاف قبل البدء في الإجراء، وهناك حاجة إلى مزيد التبريد. يرجى ملاحظة أن درجة التبريد يجب أن تسيطر عليها بعناية لضمان معدل ضربات القلب في حوالي 20 نبضة في الدقيقة وذلك لتصور الشريان التاجي.
نظرا لصغر حجم الفئران حديثي الولادة، مطلوب عالية الدقة ضربات القلب للحصول على مسح الصور M-وضع لتحليل وظيفة القلب. للحصول على أفضل النتائج، تأكد من معدل ضربات القلب فيحوالي 400 نبضة في الدقيقة مع تخدير خفيف (0،5-1٪ الأيزوفلورين استنشاق) والحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية (قفص الاتهام والتدفئة وتحسنت جل الصدى). من الأفضل الحصول على الصور إذا كان يميل الجسم قليلا نحو الكتف الأيمن (5 ~ ° cranially و 5 ° اليمين). ضمان هلام صدى كافيا يتم تطبيقها للحد من الضوضاء.
على الرغم من أن هذا النهج لا نقدم 100٪ استنساخ، حجم احتشاء قد يكون متغير نوعا ما اعتمادا على الشريان التاجي المتفرعة تشريح الوليد الفردية (الشكل 3). ونتيجة لذلك، قد تكون هناك حاجة أرقام ن أعلى للوصول إلى دلالة إحصائية في تحديد آثار العلاجات المختلفة أو التلاعب الجيني على تجديد القلب. ومع ذلك، فإن هذا النهج يحمل مزايا كبيرة على كل من استئصال مهيمنة حديثي الولادة وcryoinjury كما الفيزيولوجيا المرضية لهذه الآليات من إصابة قد تكون مختلفة تماما عن MI، وبالتالي قد لا إعادة بدقةالحالي MI 8،20 البشرية. هذا النهج يقلد بشكل مباشر إصابة الإنسان نموذجية، ويمكن استخدامه لدراسة تجديد القلب في وضع الثدييات MI.
هذا نموذج فريد من نوعه لأنه يسمح لدراسة الاختلافات في آليات التعافي من الإصابة القلبية بين غير التجديدي (الكبار)، والتجدد (حديثي الولادة) عضلة القلب الثدييات. على سبيل المثال، الماوس الكبار نتائج النموذج MI في تشكيل ندبة دائمة. غالبا ما يحدث تمزق البطين نتيجة للتوسع احتشاء. في تجربتنا مع هذا النموذج (> 100 عملية جراحية، بيانات غير منشورة)، وتجديد كامل هو واضح لم يحترم 21 يوما بعد احتشاء وتمزق البطين. المعلومات المتراكمة عن استخدام هذا النموذج قد تقدم رؤى جديدة في آليات التي قد تشجع على تجديد القلب في البالغين.
أدلة حديثة تشير إلى انتشار cardiomyocyte هو المساهم الرئيسي في تجديد القلب 9 4،21 تجديد. مزيد من البحث باستخدام بروتوكول المقدمة هنا قد يشير إلى الأهداف العلاجية لتحريض تجديد القلب بعد MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
