Abstract
冠状动脉结扎诱发心肌梗塞已在许多动物模型被用来作为一种工具来研究心脏修复和再生机制，并定义治疗的新目标。几十年来，完整的心脏再生的模型，两栖类和鱼类存在，但哺乳动物对口不可用。近期A产后窗口发现其间的小鼠具有再生能力，导致建立心肌再生的哺乳动物模型。哺乳动物心脏再生的新生小鼠的手术模型在本文中描述。简言之，将日龄1（P1）的小鼠通过异氟烷麻醉，并放置在冰垫以诱导体温过低。胸部被打开后，与左冠状动脉前降支（LAD）被可视化，缝线周围放置在LAD以造成心肌缺血左心室。手术过程需要10-15分钟。可视化的冠状动脉被准确缝合位置和重现性是至关重要的。心肌梗死和心功能不全是由三苯基氯化四氮唑（TTC）染色和超声心动图检查确诊分别。完全再生后21天心肌梗死是由组织学验证。该协议可以用于心肌梗塞后阐明哺乳动物心脏再生的机制的工具。
Introduction
心肌梗死（MI）是死亡的主要原因全世界，并且仍然负责大约三分之一的心脏衰竭病例1。而经皮介入和使用血栓溶解的不断优化的出现增加了再灌注MI后，心肌细胞死亡和收缩心肌的损失仍然发生。此外，还留了大量的“无选项”病人谁不是候选人或没有看到这些措施的好处。这些患者继续经历禁用缺血导致瘢痕形成和有害的心室重构的脑梗死愈合的机制。该方法最终导致心脏衰竭，为此，预后仍然尽管与血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂和β-阻断剂的最佳药物管理不善。遗憾的是，一年期死亡率为患者严重受损左心室功能仍然为高达26％2。心脏移植是治疗心脏衰竭的最终治疗方案。然而，对于心脏移植的有限施主池不使这对大多数患者一个可行的选择。因此，新的治疗剂的发现，以恢复受损心肌仍然是最重要解决心脏疾病的问题。因此，心脏损伤可靠的动物模型需要作为这一进程的一个重要组成部分。
传统的教条已经决定了成人的心肌细胞的有丝分裂后，终末分化细胞，不能分割或去区分，以取代受损心肌3。因此，成年哺乳动物心脏永远无法完全从伤病中恢复，失去了心肌细胞将与纤维组织所代替。因此，研究主要集中在治疗剂，以减少梗塞扩展和减少疤痕形成。然而最近，一个范式转变发生在心脏周围的愈合和许多研究工作思路已被重定向把重点放在心脏再生4的潜力。
直到最近， 在体内心脏再生的研究仅限于非脊椎动物模型，如那些在urodele两栖动物和硬骨鱼5-7。然而，在新生小鼠的能力用于心脏再生的发现已经导致的哺乳动物心脏再生的两种手术模型的开发：心尖和冠状动脉闭塞的切除以诱导心肌梗塞8,9。在2011年，一个鼠标顶点切除模型来证明完整心脏再生有可能在1日龄（P1）。然而，这种力量的初步新生儿期后迅速下降。哺乳动物的心脏在P7出生祖细胞数量下降后不久就失去了它的再生潜能，并成为心肌双核，输其增殖能力，并永久退出细胞周期10,11。了解新生和成年哺乳动物心脏之间的根本分歧可能会导致新的见解心脏再生。
而先端切除确实提供洞察收缩组织的再生长，该模型不模拟典型的人心脏损伤，因此不借给本身以及对治疗剂的开发。冠状动脉闭塞模型，然而，更直接地模拟MI病状的病理生理方面，并且因此可以提供更有用的见解可能适用于供人类使用的治疗进步的机制。
外科冠状动脉结扎已被用作在许多动物模型12-14的有用实验技术。在成人冠状动脉结扎模型中，将动物麻醉并插管以允许胸腔的开口，同时维持respirati上。该心脏继续定期击败，允许冠状血管的可视化，并允许精确缝合位置。此外，心脏仍然是粉红色的灌注继续，结扎后缺血心肌出现面色苍白，表示成功的冠状动脉结扎术。对新生小鼠中描述的协议，但是，是较不可靠的冠状动脉不可视和外科医生必须估计何处放置缝合线15。虽然冠状动脉脉管系统的一般解剖的方向是相同的，动物个体变异和在LAD的分支中存在16。因此，当“盲目去”的动脉很容易错过。然后如超声心动图的其它技术是必需的，以确认心肌梗塞的成功诱导，并确保所有的手术导致类似梗塞大小。这里描述的改善在最近发表的方法15，其中，在LAD的位置可以ESTABlished，因此LAD可连接可重复诱发心肌梗死。
这种技术不需要在新生小鼠在低温状态气管插管或机械通气，如开胸不会导致肺萎陷。然而，在前面描述的方法，严重低温必须被诱导到两个完整呼吸暂停和心律15停止的点。这种方法的主要限制是冠状动脉不再灌注和心脏甚至LAD结扎前出现面色苍白。在这里所描述的方法中，冠状动脉可视化是可能在深低温和心律停止，与手术后的新生小鼠的完全恢复之前的一个点麻木的。此方法提供100％的再现性的一大优势。
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Protocol
的C57BL / 6和CD-1 IG-S小鼠繁殖对从Charles River购得。在这项研究中使用的动物，根据加拿大议会关于动物保护的准则，处理，研究方案被动物利用小组委员会在西部大学，伦敦，加拿大的批准。
1.动物护理
- 分娩是完整的，幼仔已初步母乳喂养由他们的母亲了几个小时后，将它们放置在不同的笼子里带有CD-1养母。 CD-1母亲显示具有较强的本能培养一个平静的表型，并有较低的倾向蚕食受伤的幼崽15。
2.手术
- 通过将小狗在一个密封的腔异氟醚麻醉诱导（约500微升100％V / V异氟烷允许耗散超过1300 立方厘米室）。保持在腔室中的小鼠直到运动（约30秒）停止。
- 莫删除从异氟醚室使用，并通过将鼠标放在湿冰上诱发低温麻醉。为了避免冻伤，把冰无菌手术手套里面，手套包裹内的鼠标和覆盖冰手套或包裹鼠标在无菌湿纱布，将它放在冰上。
注：小鼠更快地冷却时用冰冷的接触是在一个较大的表面面积，并且因此熔融的冰可以缩短低温诱导时间。 - 缺乏运动反应到脚趾和尾巴捏麻醉确认。
注：挑起动作的停止发生在15℃和8℃之间的体温。 （冷却时间到该温度约1分钟）。完整的呼吸暂停和心脏停搏不需要 LAD结扎。 - 移动至冰床装有手术显微镜手术区。确保鼠标小狗在整个手术过程中保持在冰上。
注：手术区，纱布和手术器械应灭菌。 Mainta在整个手术过程中无菌区，和穿一次性使用无菌手术手套。小鼠出生与他们的眼睛闭17不需要眼膏。 - 放置在右侧卧位鼠标小狗。用聚维酮碘溶液，然后用乙醇棉签轻轻擦拭消毒的胸部。
- 通过切割皮肤xyphoid和左腋下之间的左前足下面几毫米的左胸部进行皮肤切口沿腋中线。还用剪刀通过底层胸肌层进行切割。
- 用钳分离肋骨，肋间肌请在第 4肋间左侧开胸。
注：新生儿肋是很脆弱的，并且可以容易破裂。要沿肋间肌开钳（而不是抓筋）避免这种情况，轻轻分开肋骨。 - 可视化的左冠状动脉前降支（LAD）从左边出现AURICLE肺静脉后面和降超出心大静脉。
注意：在这个早期新生儿窗口，胸腺常常可视化并可以覆盖心脏基部的一部分。在LAD可以看出出现的胸腺的位置的旁边，这取决于胸椎切口的角度。 - 通过使动脉下方11-0尼龙缝线（0.007毫米直径针）穿过中间心室左外耳（ 图1C）下面结扎LAD。缺血被确认与缝合部位（ 图1G）下方的心肌的热烫。
- 关闭使用8-0尼龙缝合线（0.15毫米直径的针）胸切口。用两个缝合关闭肋骨。结扎，以确保针头穿过体腔时，不会刺破肺之前放置两个肋缝线。
- 关闭肋骨后，从冰床鼠标。保持手术区域内的鼠标和直接将其放置在无菌手术以逢过一个温暖的加热垫在37℃开始升温。
- 一旦在无菌受热面积，关闭使用8-0尼龙缝合线（0.15毫米直径的针），肌肉和皮肤层。使用一个缝合肌肉层和使用两个缝合的皮肤切口。
注：肌肉和皮肤层可以在加热垫以减少低温曝光时间关闭。鼠标温度开始上升，一旦放置在加热垫，但肌肉和皮肤缝合过程中保持足够维持麻醉足够低。
3.手术恢复
- 继续在一个温暖的加热垫迅速升温，直到自发运动的回报。无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。用乙醇棉签轻轻擦拭损伤部位取下聚维酮碘和血。
- 从麻醉中足够的恢复后，从无菌手术区域中删除，从培育被褥把它涂抹妈妈的笼子里，和返回的小狗养母。这有助于防止产妇拒绝或拆。
注意：不要幼仔返回与其他动物的笼子，直到完全康复。如果整个垃圾没有被使用，并同窝留在养母，将恢复幼仔垃圾的中间。如果执行一个以上的手术，完整的老鼠返回自己的养母之前单个垃圾所需的所有手术。 - 观察养母的行为向小狗每10 - 15分钟2 - 3小时，以确保接受小狗。如果母亲显示侵略朝受伤小狗，取出小狗和异氟烷过量安乐死（> 5％;直到呼吸停止），随后断头。不需要围手术期镇痛药物的集中疼痛反射没有完全在这个15岁早期开发：注意。
4.心肌的测量梗死面积4 -6小时后心肌梗死
- 让幼崽在护理CD-1养母的恢复期限4 - 6小时。从笼中取出母亲的小狗和异氟醚过量，然后用剪子斩首安乐死吧。
- 切除心脏解剖显微镜下，注意不要撕心肌。
- 切断从xyphoid过程皮肤对胸部的顶部。打开腹壁胸腔下方。抓住较低的肋骨，并通过肋骨和肌肉切断沿纵向从隔膜到腋下左侧中线，腋。
- 拿在横向平面剪刀，并通过隔膜精心切割从左右侧。请务必将低于心脏水平剪刀，以免到顶点的任何损害。
- 把握胸廓和切割肋右侧和肌肉沿右腋中线。用剪刀删除对心脏血管的所有连接。抓住卸下胸腔的心脏的基础。
- 部分使用手术碳钢刀片的心脏成三块。使沿心脏的短轴首次下调的缝合和心尖之间的中点。使在缝合（ 图3A）的电平的第二切口。
注：此留下一个顶点部分约为0.75毫米厚的重0.0018克;中间基座部分约为1毫米厚，重0.0065克;和心脏的基地。 - 放置在1％2,3,5-氯化三苯基四唑（TTC）的心脏切片在室温下进行10 - 15分钟。仔细观察标本，以避免过度染色。
- 为了增加对比度，用4％多聚甲醛的染色心脏切片在4℃过夜。要计算％梗死面积，心脏照片节和测量成像软件梗死面积。而梗死区域划定为白色的18存活心肌污渍红色。
5.测量心功能的超声心动图后MI
- 让幼崽在护理CD-1养母的恢复，为期24 - 48小时。通过将小狗在密封腔异氟醚（5％异氟醚）诱导麻醉。保持在腔室中的小鼠直到运动（约30秒）停止。
- 固定小狗中在加热的基座（温度37℃），其在一锥形鼻部仰卧位以提供0.5 - 1％异氟烷（麻醉维护）。放置预温热回波凝胶左侧胸部区域。
- 获取左心室（LV）的胸骨旁长轴观。确保图像被获得下面在LV缝合线的水平。获取位置后，转动超声探头（40 MHz）的90°，以获得胸骨旁短轴观，并记录M型超声心动图图像。
- 测量端舒张压和结束从短轴线M模式图像收缩期左室内部直径。计算射血分数和fractio最终缩短。
6.心肌的测量梗死面积24小时后MI
- 让幼崽在护理CD-1养母的恢复，为期24小时。从笼中取出母亲的小狗和异氟醚过量，然后用剪子斩首安乐死吧。
- 打开胸腔，如步骤4.2。切除心脏前，请认真把握只是用细镊子膜片上方的胸主动脉。持在冠状面细剪刀，平贴胸壁，并切断胸主动脉关闭后胸壁在颅方向移动剪刀。
- 切断从胸壁和任何其他连接游离的主动脉，直到它到达心脏。通过抓住上腔静脉和切割到身体的所有其它血管连接切除心脏。
- 冲洗心脏（附主动脉）在盐水中。仔细导管插入用30号针头胸主动脉和扎奥尔塔用8-0尼龙缝合线套管。
- 以1毫升/分钟的速率灌注通过经由30号针头的主动脉内皮素-1 5ml盐水的心脏。以1毫升/分钟的速率灌注用150微升的2％伊文思蓝溶液的心脏。从套管中取出心脏，部分为三个部分和第4节与TTC留下污点。
- 要计算梗死面积，心脏照片节和测量成像软件梗死面积。存活心肌渍蓝，在危险中的污渍面积红色，梗死面积划定为白色。
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Representative Results
在P1的心肌梗死程序可以在10内完成 - 15分钟并拥有死亡率为7.8％（5出64个幼崽）。手术后，老鼠从低温麻醉未来5内恢复 - 20分钟（恢复时间取决于体温外科医生的麻醉和速度期间达成）。当使用P7幼仔（用于与非再生心肌比较），需要冷却的一个较长时期达到麻木。 P7幼仔大得多，并有更多的困难来自心脏损伤和低温回收，导致死亡率的26.9％（14选自52幼仔）的高得多。
从先前的研究结果在本文中证实，在接近10℃的指示19（8℃，15℃之间）低温麻醉的诱导。在这个温度窗口，心脏率不慢，但节奏继续以24 BPM和11 BPM之间的比率。低心脏率在这个水平冷却显著减少术中出血。在LAD可以容易地可视化，并在这些温度下（ 图1）连接。直到体温9.6℃，4.9℃之间到达，造成心脏率降低到2 BPM或心跳停止的LAD仍然可见。
在P1 LAD结扎后，幼仔完全康复，并成长为一个车身尺寸相若的同窝控制。一旦与自己的养母放回，幼仔恢复堪比同窝在约10分钟的认识和饲养能力。在组织学检查后3天，心肌梗死，有梗塞的证据，与炎症细胞浸润，一个典型的梗塞后反应（ 图2）。在第7天心肌梗死后，左室组织显示正常。通过21天心肌梗死后，完整的C发生ardiac再生。
2,3,5-氯化三苯基四唑（TTC）染色4 - 6小时MI后用作MI一致诱导的确认。红色区域代表存活心肌，而白色区域表示缺血性坏死的组织。在总共13 LAD结扎手术，心中的100％的心肌梗死，有36％（ 图3）的平均梗塞面积。 TTC染色伊文思蓝灌注也在24小时后进行MI展示梗死组织的持久性和测量基于区域的风险（ 图4）梗塞面积。在这些心，存活心肌渍蓝色，在风险污渍红色的区域，并且梗塞区域划分为白色。梗死大小计算为危险区域的百分比。在4 LAD结扎手术，心中的100％的梗死，与危险的面积的49％的平均梗死面积（ 图4）。
<p系列=“jove_content”FO：保together.within页=“1”>确认梗死的感应，在24和48小时后的MI进行超声心动图检查。在24小时后，MI，射血分数（EF）被显著从84％降低到74％，以及缩短分数（FS）从50％显著减少至40％（ 图5）。通过48小时MI后，EF进一步降低至46％，相比于80％的对照和FS也显著降低到25％，比对照组的50％。此外，没有在48小时（ 图6）在收缩期左室内径一个显著减少。左心室前壁厚度不显著在24或48小时MI后下降（ 图5和6）。
图1.冠状动脉可见在新生儿LAD程序。P1新生小鼠自动对焦之三低温麻醉，切开皮肤，肌肉的切口和外侧开胸冠状动脉左前降支（LAD第四肋间。A））是可见的。BD）11-0尼龙缝合线通过中期心室。E）通过LAD结扎和热烫分别观察到的缝合部位。F）和G）的是A的放大倍率）和E）的下方。 OCC。 LAD，闭塞左前降支。 LA，左心房。 LV，左心室。 GCV，巨大的冠状静脉。白色箭头，LAD。黑色的箭头，从强光照明。比例尺是1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.完成卡迪的证据AC再生LAD结扎后的新生小鼠。在P1小鼠LAD结扎后马松染色。整个心和放大倍率在梗死区域显示在LAD结扎后第3天，第7和第21。注意心肌细胞损失和炎症细胞在一天3 MI后（白色箭头）潜入梗死区。完全梗死区在再生后第7天开始MI。纤维化没有证据指出在第21天心梗后。比例尺是200，100和50微米为40X，200X，630X和放大倍率，分别为。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.新生儿LAD结扎术是100％可重复的。 A）整个心脏的切片创建0.75毫米顶点一块线和1毫米中期基础件为TTC染色。B）TTC染色假手术组和LAD结扎心中的代表图像。比例尺是1毫米。在P1新生小鼠13 LAD结扎C）梗死面积。心收集4 - 6小时后心肌梗死和TTC染色后测得的梗死面积。红色表示存活心肌;白色代表坏死。数据为均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.新生儿LAD结扎结果可靠的梗死。 A）心肌梗死面积为缺血区在％P1新生小鼠LAD结扎后（N = 4）。心收集后24小时MI和伊文思蓝和TTC染色后测定梗塞大小。蓝色表示存活心肌;红色表示处于危险区;白表示不适用ecrosis。数据为均值±SEM。B）LAD结扎后伊文思蓝和TTC染色LAD结扎心中的代表图像。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.新生儿LAD结扎结果心功能不全在24小时后心肌梗死。心功能超声心动图A）代表M型图像为假手术和LAD结扎小鼠的评估。舒张末期和结束收缩由箭头指示。B）的缩短分数，射血分数，并在两个舒张和收缩左室内径的测量。数据为均值±SEM。 N = 8和7深水分别冠状动脉结扎（CAL）。 * P <0。 05. 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.新生儿LAD结扎结果心功能不全在48小时后心肌梗死。心功能超声心动图A）评估代表M型图像显示为假舒张末期（长箭头）和收缩末期（短箭头）操作和LAD结扎老鼠。B）心功能测量，超声心动图，包括缩短分数，射血分数，并在两个舒张和收缩左室内径。数据为均值±SEM。 N = 4和6分别为假和冠状动脉结扎（CAL）。 * P <0.05，** P <0.01。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里展示了外科LAD结扎是产生的MI在新生小鼠的可靠方法。这个模型提供了一个可重复的模型来研究哺乳动物心脏再生的研究人员。冠状血管的可视化是此方法的一个关键组成部分，以确保正确的缝线放置，从而保证重复性。而成年小鼠不具有变温功能，体温和新生小鼠的代谢率是密切随环境温度相关联。此外，新生小鼠的小尺寸使其非常适用于低温诱导表面冷却。手术和鼠标体温的定时是在复制此过程准确性至关重要，因此必须小心地监测。结扎尽快到达麻木之后提供了机会显现热烫心肌结扎后，确认手术成功。
有万亩可用于确认的MI诱导ltiple方法。这些措施包括TTC染色，超声心动图和组织学分析。 TTC染色是成本低，可重复性和可靠，并具有高吞吐量容易地进行。由于这些原因，TTC染色已被广泛使用。超声心动图可以被用来在一段时间内的心脏功能MI后非侵入性地监控变化。 MI的确切证据可通过组织学分析证明。在本研究中，所有三个上述技术被用来验证的MI的成功诱导。
法援署的可视化是成功的MI诱导是关键。如果研究者遇到困难可视化在LAD（可能是由于深低温诱导），左耳廓可以稍微用钳子抬起，如在LAD的主根比更远端段更大，可以更容易地看到。如果童子不能进行可视化，研究者不应该假定动脉LO阳离子。这个小狗不应被用于实验结扎并作为假手术控制可能相当被使用。
正确的进入胸腔在第 4肋间隙重要的是要获得对LAD结扎最佳的可视化和空间。这可以通过肋间空间的仔细数量来实现。另外，如果在手术过程中发生出血的少量，也可以用无菌纱布除去。如果出血是显著，然而，外科医生可能没有冷却鼠标充分开始的步骤之前，并且需要进一步的冷却。请注意，冷却程度应仔细控制以确保心脏速率在约20 BPM为了形象化冠状动脉。
由于新生小鼠的小尺寸，高分辨率的超声心动图是需要获得清晰的M型图像，心功能分析。为达到最佳效果，确保心脏率约400 BPM与浅麻醉（0.5 - 1％异氟醚），并维持正常体温（加热基座和温暖回声凝胶）。如果身体朝向右肩稍微倾斜图像被最好获 得（〜5°颅和5°向右）。确保有足够的回声凝胶使用，以尽量减少噪音。
尽管这种方法确实提供了100％的再现性，梗塞的尺寸可以依赖于冠状动脉分支的各个新生儿的解剖（ 图3）有些变量。作为结果，可能需要更高的n个数确定不同的处理或对心脏再生遗传操作的影响，以达到统计学意义。然而，这种方法拥有超过两个新生儿顶点切除和冷冻损伤如外伤的这些机制的病理生理学主要优点可以是来自MI完全不同，因此可能无法准确重新目前人类MI 8,20。这种方法更直接模仿典型的人的伤害，并且可被用来研究在哺乳动物心肌梗塞的设定心肌再生。
这种模式是独一无二的，因为它允许在从非再生（成人）的心脏损伤的恢复机制的差异研究和再生（新生）哺乳动物的心肌。例如，在永久疤痕形成的成年小鼠的MI模型的结果。心室破裂经常发生如梗塞膨胀的结果。在我们这个模型（> 100次手术;未公布的数据）的经验，完全再生是显而易见的21天梗死后和心室破裂没有被观察到。从使用这种模式累积的信息可以提供新的见解，可能会促进成人心脏再生的机制。
最近的证据表明心肌细胞增殖是一个主要贡献者心脏再生9 4,21的临界调节剂。使用这里介绍的协议进一步的研究可能指向治疗靶点心脏再生心肌梗死后的诱导。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
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