Abstract
Myokardieinfarkt induceret af koronararterie ligering er blevet anvendt i mange dyremodeller som et værktøj til at undersøge mekanismerne af hjertefunktionen opheling og regeneration, og for at definere nye mål for terapeutika. I årtier, modeller af komplette hjerte regenerering eksisterede i padder og fisk, men en pattedyr modstykke var ikke tilgængelig. Den nylige opdagelse af en postnatal vindue hvorunder mus besidder regenerative evner har ført til etableringen af et pattedyrs model af hjerte regenerering. Et kirurgisk model af pattedyr cardiac regeneration i den neonatale mus præsenteres heri. Kort fortalt postnatal dag 1 (P1) mus bedøvet ved isofluran og anbragt på en is pad at inducere hypotermi. Efter brystet er åbnet, og den venstre forreste nedadgående koronararterie (LAD) visualiseres, er en sutur anbragt omkring LAD at påføre myocardial iskæmi i den venstre ventrikel. Den kirurgiske procedure tager 10-15 min. Visualisering kranspulsåren erafgørende for nøjagtig sutur placering og reproducerbarhed. Myokardieinfarkt og hjertedysfunktion bekræftes af triphenyl-tetrazoliumchlorid (TTC) farvning og ekkokardiografi, hhv. Fuldstændig regenerering 21 dage efter myokardieinfarkt verificeres ved histologi. Denne protokol kan bruges som et redskab til at belyse mekanismer pattedyr cardiac regeneration efter myokardieinfarkt.
Introduction
Myokardieinfarkt (MI) er en førende dødsårsag på verdensplan, og er fortsat ansvarlig for omkring en tredjedel af hjertesvigt sager 1. Mens fremkomsten af perkutan intervention og løbende optimering af anvendelsen af thrombolytiske har øget reperfusion efter MI, cardiomyocyte død og tab af kontraktile myocardium alligevel forekommer. Der er også fortsat et stort antal "no-option" patienter, der ikke er kandidater til eller ikke ser gavn af disse interventioner. Disse patienter fortsætter med at opleve invaliderende iskæmi fører til ardannelse og skadelig ventrikulær remodellering som en mekanisme af infarkt healing. Denne proces i sidste ende resulterer i hjertesvigt, som prognosen fortsat er dårlig trods optimal farmakologisk forvaltning med angiotensin-konverterende enzym (ACE) hæmmere og betablokkere. Desværre, den etårige dødeligheden for patienter med svært nedsat venstre ventrikelfunktion stadig somhøjt som 26% 2. Hjertetransplantation er den endelige behandlingsmulighed for patienter med hjertesvigt. Men den begrænsede donorbase for hjertetransplantation ikke gøre dette til en farbar vej for de fleste patienter. Således opdagelsen af hidtil ukendte terapeutiske midler til at genoprette den beskadigede myokardium fortsat afgørende til løsningen af hjertesygdom problem. Pålidelige dyremodeller for kardiel skade kræves derfor som et afgørende element i denne proces.
Traditionel dogme har dikteret, at voksne cardiomyocytter er post-mitotiske, terminalt differentierede celler, ude af stand til at opdele eller de-differentierende at udskifte den beskadigede myocardium 3. Som sådan kunne en voksen pattedyr hjerte aldrig helt komme fra skade, og tabte kardiomyocytter ville blive erstattet med fibrøst væv. Således har forskning fokuseret primært på terapeutiske midler til at minimere infarkt ekspansion og reducere ardannelse. På det seneste har dog et paradigmeskifte opståeti tænkning omkring hjerte-healing og mange forskningsindsats er blevet omdirigeret til at fokusere på potentialet for hjerte-regenerering 4.
Indtil for nylig var in vivo-undersøgelse af hjertets regenerering begrænset til ikke-hvirveldyr modeller, såsom de i halepadder padder og benfisk 5-7. Imidlertid har opdagelsen af kapaciteten for cardiac regeneration i neonatale mus førte til udviklingen af to kirurgiske modeller af pattedyr cardiac regeneration: resektion af hjertets toppunkt og koronar okklusion for at inducere myokardieinfarkt 8,9. I 2011 blev en mus apex resektion model, der anvendes til at vise, at komplet hjerteundersøgelse regenerering findes postnatal dag 1 (P1). Men denne kapacitet falder hurtigt efter den indledende neonatale periode. Den pattedyr hjerte mister sin regenerative potentiale kort efter fødslen på P7 som stamceller numre tilbagegang, og cardiomyocytter bliver binucleated, misterderes proliferative kompetence, og permanent afslutte cellecyklus 10,11. Forståelse af grundlæggende forskelle mellem den neonatale og voksne pattedyr hjerte kan føre til nye indsigter i hjerte-regenerering.
Mens apex resektion faktisk giver indblik i re-vækst af kontraktile væv, er modellen ikke simulere typiske menneskelige hjerte-skade, og derfor egner sig ikke så godt til udviklingen af lægemidler. Den kranspulsåren okklusion model, men simulerer mere direkte de patofysiologiske aspekter af MI patologi, og dermed kan give mere nyttig indsigt i mekanismer, der kan være gældende for terapeutisk avancement til human brug.
Kirurgisk koronar ligering er blevet anvendt som en nyttig eksperimentel teknik i mange dyremodeller 12-14. I den voksne kranspulsåreombinding model, er dyrene bedøvet og intuberet for at tillade åbning af brysthulen og samtidig opretholde respiratipå. Hjertet fortsætter med at slå regelmæssigt, hvilket tillader visualisering af den koronare vaskulatur og giver mulighed for nøjagtig sutur placering. Endvidere hjertet forbliver lyserød som perfusion fortsætter, og efter ligering det iskæmiske myocardium forekommer bleg, hvilket indikerer vellykket kranspulsåreombinding. Beskrevet for neonatale mus protokol, imidlertid mindre pålidelig som koronararterien ikke visualiseres og kirurgen skal vurdere, hvor at placere suturen 15. Selv om den generelle anatomi koronar vaskulatur er den samme, enkelte dyr variabilitet i retning og forgrening af LAD eksisterer 16. Således når "går i blinde," arterien kunne let savnet. Andre teknikker såsom ekkokardiografi er det dernæst nødvendigt at bekræfte vellykket induktion af MI, og for at sikre alle operationer resultere i en lignende infarktstørrelse. Beskrevet her er en forbedring på en nyligt offentliggjort metode 15, hvor positionen af LAD kan etableret og således LAD ligeres til reproducerbart inducere MI.
Denne teknik kræver ikke endotracheal intubation eller mekanisk ventilation, som thoracotomi i en underafkølet tilstand i den neonatale mus ikke resulterer i lunge sammenbrud. Men på den tidligere beskrevne fremgangsmåde, alvorlig hypotermi skal induceres til punktet af både komplette apnø og ophør af hjerterytmen 15. Den største begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at den koronararterie ikke længere er perfunderet og hjertet forekommer bleg selv før LAD underbinding. I tilgangen beskrevet heri, koronar visualisering er mulig på et punkt af sløvhed før dyb hypotermi og hjerterytme ophør, med fuld tilbagebetaling af den neonatale mus efter operationen. Denne metode giver en væsentlig fordel ved 100% reproducerbarhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ynglende C57BL / 6 og CD-1 IG-S-mus blev indkøbt fra Charles River. Dyr anvendt i denne undersøgelse blev håndteret i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske Rådet om Animal Care, og studere protokoller blev godkendt af Animal Brug underudvalget ved Western University, London, Canada.
1. Animal Care
- Efter fødslen er komplet og hvalpe har været oprindeligt ammet af deres mor til et par timer, placere dem i en anden bur med en CD-1 plejemor. CD-1 mødre vise en roligere fænotype med en stærk fremme instinkt, og har en lavere tendens til at kannibalisere sårede hvalpe 15.
2. Kirurgi
- Narkosen ved at placere hvalpen i en forseglet isofluran kammer (ca. 500 pi 100% v / v isofluran lov til at sprede over 1.300 cm3 kammer). Holde musen i kammeret, indtil ophør af bevægelse (ca. 30 sek).
- Fjern mobruge fra isofluran kammer og inducere hypotermiske anæstesi ved at placere musen på våd is. For at undgå forfrysninger, placere is inde i en steril kirurgisk handske, wrap musen i handske og dække handsken med is eller wrap musen i steril våd gaze og placere den på is.
BEMÆRK: Mus afkøles hurtigere, når kontakt med is er over et større areal, og som sådan smeltet is kan forkorte hypotermi induktion tid. - Bekræft anæstesi ved manglende bevægelse respons til tå og hale knivspids.
BEMÆRK: Ophør af provokeret bevægelse forekommer ved en legemstemperatur på mellem 15 ° C og 8 ° C. (Afkøling tid til denne temperatur ca. 1 min). Komplet apnø og asystoli er ikke påkrævet for LAD ligation. - Flyt isen sengen til kirurgiske område udstyret med et operativsystem mikroskop. Sørg for, at musen hvalpen forbliver på is under hele kirurgiske procedure.
BEMÆRK: kirurgiske område, gaze og kirurgiske instrumenter skal steriliseres. maintai sterilt felt under hele proceduren, og slid engangsbrug, sterile kirurgiske handsker. Oftalmologiske salve er ikke nødvendig, da mus er født med lukkede øjne 17. - Placer musen hvalp i den rigtige laterale decubitus position. Desinficer brystet ved forsigtigt aftørring med povidon-jodopløsning efterfulgt af en ethanol vatpind.
- Udfør hud snit på venstre bryst langs midten af aksillær linje ved at skære huden mellem Xyphoid og venstre armhule et par millimeter under venstre forben. Også bruge en saks til at skære gennem det underliggende brystmusklen lag.
- Udfør en venstre torakotomi i 4. interkostale plads ved at adskille ribben og mellemsiddende muskler med en pincet.
BEMÆRK: Nyfødte ribben er meget skrøbelig og kan let brydes. For at undgå dette, forsigtigt separate ribber ved at åbne pincet langs intercostal muskel (snarere end at gribe ribber). - Visualiser venstre forreste nedadgående kranspulsåre (LAD) på vej fra venstre aurkel bag lungevenen og faldende ud over den store hjertevene.
BEMÆRK: I denne tidlige neonatal vindue, er thymus ofte visualiseres og kan dække en del af hjertets base. LAD kan ses spirende ved siden af positionen af thymus, afhængig af vinklen af thorax indsnit. - Ligere LAD ved at bestå 11-0 nylon sutur (0.007 mm i diameter nål) under arterien gennem midten ventrikel under venstre forkammer (figur 1C). Iskæmi er bekræftet med blanchering af myocardiet under suturen (figur 1G).
- Luk thorax indsnit hjælp 8-0 nylonsuturer (needle diameter 0,15 mm). Brug to suturer til at lukke ribbenene. Placer begge rib suturer før ligering for at sikre, at nålen ikke punktere lungerne når de passerer gennem kropskaviteten.
- Efter lukning ribbenene, fjerne musen fra isen sengen. Hold musen inden for det kirurgiske område og placere det direkte på sterile kirurgiske tilwell over en varm varmepude ved 37 ° C for at starte opvarmningen.
- Når du er på sterile opvarmede område, lukke muskel og hudlag ved hjælp 8-0 nylon suturer (nål diameter 0,15 mm). Brug en sutur for musklen lag og bruge to suturer for huden indsnit.
BEMÆRK: Muskel og hudlag kan være lukket på en varmepude til at reducere hypotermi eksponeringstid. Mus temperaturen begynder at stige, når placeret på varmepude, men er stadig tilstrækkeligt lav nok til anæstesi vedligeholdelse under muskel og hud lukning.
3. Kirurgisk Recovery
- Fortsæt hurtig opvarmning på en varm varmepude indtil tilbagelevering af spontan bevægelse. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Fjern povidon-iod og blod ved forsigtigt at tørre skadestedet med ethanol vatpind.
- Efter tilstrækkelig restitution fra anæstesi, fjerne det fra sterilt kirurgiske område, smøre det med strøelse fra familieplejemors bur, og tilbagevenden hvalp at fremme mor. Dette hjælper med at forhindre maternal afvisning eller kannibalisering.
BEMÆRK: Du må ikke vende tilbage unger til et bur med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. Hvis der ikke er anvendt en hel kuld, og søskende forbliver hos plejemor, placere inddrives hvalpe i midten af kuldet. Hvis der udføres mere end én operation, komplet alle operationer, der er nødvendige for en individuel kuld før han vendte tilbage mus til deres plejemor. - Overhold adfærd plejemor mod hvalpen hver 10 - 15 minutter til 2 - 3 timer for at sikre accept af hvalp. Hvis moderen viser aggression mod den skadede hvalp, fjerne hvalpen og aflive ved isofluran overdosis (> 5%, indtil ophør af vejrtrækning), efterfulgt af halshugning. BEMÆRK: Perioperativ analgesi medicin er ikke påkrævet, da de centraliserede smerte reflekser ikke er fuldt udviklede på dette tidlige alder 15.
4. Måling af hjerteinfarkt Størrelse 4 -6 timer efter MI
- Tillad unger til at inddrive i pleje af en CD-1 plejemor for en periode af 4 - 6 timer. Fjern hvalpen fra bur med mor og aflive den ved at isofluran overdosis efterfulgt af halshugning med store saks.
- Forbrugsafgifter hjertet under dissektionsmikroskop, passe på ikke at rippe myokardiet.
- Skær skindet fra xyphoid proces til toppen af brystkassen. Open bugvæggen under brystkassen. Forstå den nedre brystkassen og skære gennem ribbenene og muskulatur i længderetningen langs den venstre mid-axillær linje fra membranen til armhulen.
- Hold saks i tværgående plan og omhyggeligt skære igennem mellemgulvet fra venstre til højre side. Sørg for at placere saks under niveauet af hjertet for at undgå beskadigelse af spidsen.
- Fatte brystkassen og skæres højre af ribben og muskulatur langs højre mid-axillær linje. Fjern alle vaskulære til hjertet med en saks. Fjern hjertet fra brysthulen ved at gribebasen.
- Afsnittet hjertet i tre stykker ved anvendelse af en kirurgisk kulstofstål barberblad. Gør det første snit langs den korte akse af hjertet ved midtpunktet mellem suturen og den kardiale apex. Gør det andet snit på niveauet af suturen (figur 3A).
BEMÆRK: Dette efterlader en spids sektion ca. 0,75 mm tyk vejer 0,0018 g; en mid-base-sektion ca. 1 mm tyk, vejer 0,0065 g; og bunden af hjertet. - Placer heart sektioner i 1% 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) ved stuetemperatur i 10 - 15 min. se omhyggeligt prøven for at undgå over-farvning.
- For at øge kontrasten, fix farvede hjerte skiver med 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C. For at beregne% infarkt område, fotografi hjerte sektioner og måle infarkt område på imaging software. Den levedygtig myocardium pletter rødt, mens infarkt området er afgrænset som hvidt 18.
5. Måling afHjertefunktionen med ekkokardiografi Post-MI
- Tillad unger til at inddrive i pleje af en CD-1 plejemor for en periode på 24 til 48 timer. Narkosen ved at placere hvalpen i en forseglet isofluran kammer (5% isofluran). Holde musen i kammeret, indtil ophør af bevægelse (ca. 30 sek).
- Fastgør hvalpen i liggende stilling på en opvarmet dock (temperatur 37 ° C) med næsen i en kegle til at levere 0,5-1% isofluran (til anæstesi vedligeholdelse). Placer forvarmet ekko gel på venstre thorax område.
- Opnå en parasternal lang akse afbildning af den venstre ventrikel (LV). Sørg billederne opnås under niveauet af sutur i LV. Efter at erhverve positionen, drej ultralyd sonde (40 MHz) 90 ° for at opnå en parasternal kort akse visning, og optage M-mode ekkokardiografiske billeder.
- Mål ende diastoliske og ender systolisk venstre ventrikel indvendige diametre fra billeder de korte akse M-mode. Beregn uddrivningsfraktion og fractional afkortning.
6. Måling af myokardial infarktstørrelse 24 timer efter MI
- Tillad unger til at inddrive i pleje af en CD-1 plejemor for en periode på 24 timer. Fjern hvalpen fra bur med mor og aflive den ved at isofluran overdosis efterfulgt af halshugning med store saks.
- Åbn brysthulen som i trin 4.2. Før udtagelse af hjerte, forsigtigt gribe fat i thorakalaorta lige over membranen med fine tænger. Hold fine sakse i koronale plan, flad mod thorax væggen, og skær den torakale aorta fra den bageste thorax væg bevæger saks i kranie retning.
- Skær aorta fri fra bryst- væg og andre forbindelser, indtil den når hjertet. Udskære hjertet ved at gribe den øvre hulvene og skære alle andre vaskulære forbindelser til kroppen.
- Skyl hjertet (med aorta knyttet) i saltvand. kanyle forsigtigt thorax aorta med en 30 gauge nål og binde enOrta til kanyle med 8-0 nylon sutur tråd.
- Perfundere hjertet med 1 ml saltvand gennem aorta via en 30 gauge nål med en hastighed på 1 ml / min. Perfundere hjertet med 150 pi 2% Evans blue-opløsning med en hastighed på 1 ml / min. Tag hjertet fra kanylen, sektion det i tre stykker og plette det med TTC som beskrevet i afsnit 4.
- For at beregne infarkt størrelse, fotografi hjerte sektioner og måle infarkt område på imaging software. Den levedygtig myocardium pletter blå, området udsatte pletter rød, og infarkt området er afgrænset som hvidt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den myokardieinfarkt procedure P1 kan være afsluttet i 10 - 15 minutter og har en dødelighed på 7,8% (5 ud af 64 hvalpe). Efter operationen, mus komme sig hypotermiske anæstesi inden af 5 - 20 min (tid for helbredelse afhænger af kropstemperatur nået under anæstesi og hastighed kirurg). Ved brug af P7 unger (til sammenligning med en ikke-regenerativ myokardiet), er en længere periode med køling kræves for at nå sløvhed. P7 pups er meget større og har sværere genoprettelse fra både hjerte- skade og hypotermi, hvilket resulterer i en meget højere dødelighed på 26,9% (14 ud af 52 unger).
Resultater fra tidligere undersøgelser bekræftes heri, hvilket indikerer hypotermiske anæstesi på tæt på 10 ° C (mellem 8 ° C og 15 ° C) 19. Inden for denne temperatur vindue, puls gør langsom,men rytme fortsætter på hastigheder på mellem 24 bpm og 11 bpm. Den lave hjertefrekvens på dette niveau af køling reducerer intraoperativ blødning væsentligt. LAD let kan visualiseres og ligeret ved disse temperaturer (figur 1). Den LAD forbliver synligt, indtil kropstemperatur nå op på mellem 9,6 ° C og 4,9 ° C, hvilket sænkning af hjertefrekvensen til 2 bpm eller asystoli.
Efter LAD ligation på P1, hvalpe komme sig helt og vokse til en kropsstørrelse sammenlignes med kuld kontrol. Når den er placeret tilbage med deres plejemor, hvalpe genvinde bevidsthed og fodring kapaciteter kan sammenlignes med kuldsøskende i omkring 10 min. Ved histologisk undersøgelse 3 dage efter MI, der er tegn på infarkt, med infiltrerende inflammatoriske celler, en typisk post-infarkt respons (figur 2). På dag 7 efter MI, vises venstre ventrikel væv normal. Ved dag 21 efter MI, komplet cardiac regenerering er opstået.
2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) -farvning 4 - 6 timer efter MI blev anvendt som en bekræftelse af konsekvent induktion af MI. Det røde område repræsenterer levedygtig myocardium og det hvide område repræsenterer iskæmisk dødt væv. I alt 13 LAD ligeringsprodukter operationer, 100% af hjerter var infarkt, med en gennemsnitlig infarktstørrelse på 36% (figur 3). TTC-farvning med Evans blue perfusion blev også udført ved 24 timer efter MI at demonstrere vedvarende infarkt væv og måle infarktstørrelse baseret på risikoområdet (figur 4). I disse hjerter, levedygtig myokardiet pletter blå, området udsatte pletter røde, og infarkt området er afgrænset som hvidt. Infarktstørrelse blev beregnet som en procent af risikoområdet. I 4 LAD ligeringsprodukter operationer, 100% af hjerter var infarkt, med en gennemsnitlig infarktstørrelse på 49% af risikoområdet (figur 4).
<p class = "jove_content" fo: holde-together.within-side = "1"> For at bekræfte infarkt induktion, ekkokardiografi blev udført ved 24 og 48 timer efter MI. Ved 24 timer efter MI blev uddrivningsfraktion (EF) signifikant reduceret fra 84% til 74%, og fraktioneret afkortning (FS) signifikant reduceret fra 50% til 40% (figur 5). Ved 48 timer post-MI, blev EF yderligere reduceret til 46%, sammenlignet med 80% i kontrol og FS blev også reduceret betydeligt til 25%, sammenlignet med 50% i kontrol. Endvidere var der en signifikant reduktion i systolisk venstre ventrikel indvendig diameter på 48 timer (figur 6). LV anterior vægtykkelse ikke var signifikant nedsat ved enten 24 eller 48 timer efter MI (figur 5 og 6).
Figur 1. koronararterie er synlig under Neonatal LAD Procedure. P1 neonatal mus AFter hypotermisk anæstesi, incision i huden, muskel incision og lateral torakotomi i fjerde interkostale mellemrum. A) venstre forreste nedadgående kranspulsåre (LAD) er synlig. BD) 11-0 nylon sutur føres gennem midten ventrikel. E) LAD ligeres og blanchering observeret under suturstedet. F) og G) er forstørrelser af A) og E) henholdsvis. Occ. LAD, okkluderede venstre forreste nedadgående arterie. LA, venstre atrium. LV, venstre ventrikel. GCV, store koronar vene. Hvid pil, LAD. Sort pil hoved, blænding fra belysning. Scale barer er 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Dokumentation for Complete Cardiac Regeneration Efter LAD Ligation i neonatale mus. Massons trichromfarvning efter LAD ligering i P1-mus. Hele hjerter og forstørrelser ved de infarkt områder er vist på dag 3, 7 og 21 efter LAD ligering. Bemærk myocyt tab og inflammatorisk celle infiltrere i infarkt region på dag 3 post-MI (hvid pil). Komplet infarktzonen regenerering begyndende på dag 7 efter MI. Lille tegn på fibrose noteret på dag 21 efter MI. Scale barer er 200, 100 og 50 um til 40X, 200X, og 630x forstørrelser henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Neonatal LAD Ligation er 100% reproducerbar. A) Linjer af sektionering af hele hjerte for at skabe en 0,75 mm spids stykke og 1 mm midt-basen stykke for TTCfarvning. B) Repræsentative billeder af TTC farves fingeret kontrol og LAD ligeret hjerter. Scale barer er 1 mm. C) infarkt størrelse i 13 LAD ligationer i P1 neonatale mus. Hearts indsamlet 4 - 6 timer efter MI og infarktstørrelse målt efter TTC-farvning. Rød indikerer levedygtig myokardium; hvidt angiver nekrose. Dataene er gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Neonatal LAD Ligation Resultater i Pålidelig infarkt. A) Infarktstørrelse i% af iskæmiske område efter LAD ligering i P1 neonatale mus (n = 4). Hjerter blev opsamlet 24 timer efter MI og infarktstørrelse blev målt efter Evans blue og TTC-farvning. Blå angiver levedygtig myokardiet; rød indikerer område i fare; hvid indikerer necrosis. Dataene er gennemsnit ± SEM. B) Repræsentative billeder af Evans blå og TTC farvede LAD ligeret hjerter efter LAD ligation. Skala Bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Neonatal LAD Ligeringsbetingelser Resultater i Cardiac dysfunktion ved 24 timer efter MI. Hjertefunktionen blev vurderet ved ekkokardiografi. A) billeder Repræsentant M-mode for både fingeret drives og LAD ligeret mus. End-diastole og ultimo systole er angivet med pile. B) Målinger af fraktioneret afkortning, uddrivningsfraktion, og venstre ventrikel indvendig diameter på både diastole og systole. Data er gennemsnit ± SEM. N = 8 og 7 for fingeret og koronar ligatur (CAL) hhv. * P <0. 05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Neonatal LAD Ligeringsbetingelser Resultater i Cardiac dysfunktion ved 48 timer post-MI. Hjertefunktionen blev vurderet ved ekkokardiografi. A) Repræsentant M-mode billeder, der viser ende-diastole (lange pile) og end-systole (korte pile) for både sham drives og LAD ligeret mus. B) Hjertesygdomme funktionelle målinger ved ekkokardiografi herunder fraktioneret afkortning, uddrivningsfraktion, og venstre ventrikel indvendig diameter på både diastole og systole. Data er gennemsnit ± SEM. N = 4 og 6 for sham og kranspulsåreombinding (CAL), hhv. * P <0,05, ** P <0,01.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiske LAD underbinding demonstreret heri er en pålidelig metode til at producere MI i neonatale mus. Denne model giver forskere med en reproducerbar model med at studere pattedyr hjerte regenerering. Visualisering af koronar vaskulatur er et centralt element i denne metode, som sikrer korrekt sutur placering og således sikre reproducerbarhed. Mens voksne mus ikke besidder poikilothermic kapaciteter, er kropstemperaturen og stofskifte af neonatale mus tæt forbundet med den omgivende temperatur. Desuden den lille størrelse af neonatale mus gør dem ideelle til hypotermisk induktion af overflade køling. Timingen af kirurgi og mus kropstemperatur er afgørende for nøjagtighed i replikere denne procedure, og derfor skal overvåges nøje. Ligering snarest muligt efter sløvhed nås giver mulighed for at visualisere blanchering af myokardiet efter ligering, hvilket bekræfter kirurgisk succes.
Der er multiple metoder, der kan anvendes til at bekræfte MI induktion. Disse omfatter TTC-farvning, ekkokardiografi og histologisk analyse. TTC farvningen er lave omkostninger, reproducerbar og pålidelig, og let udføres med stor kapacitet. Af disse grunde har TTC-farvning været meget anvendt. Ekkokardiografi kan anvendes til ikke-invasivt at overvåge ændringer i hjertefunktion post-MI over tid. Endelig bevis på MI kan påvises ved histologisk analyse. I den foreliggende undersøgelse blev alle tre af de ovennævnte teknikker anvendes til at verificere en vellykket induktion af MI.
Visualisering af LAD er kritisk for vellykket MI induktion. Hvis investigator har besvær visualisere LAD (sandsynligvis på grund af dyb hypotermi induktion), kan den venstre forkammer løftes lidt med pincet, som den vigtigste roden af LAD er større end de mere distale segmenter og kan være mere let synlige. Hvis LAD ikke kan visualiseres, bør investigator ikke antage arterie lokation. Denne pup bør ikke anvendes til eksperimentel ligering og kunne snarere anvendes som en fingeret opererede kontrol.
Korrekt indrejse i brysthulen på 4. interkostale rum er vigtigt at få optimal visualisering og plads til LAD ligation. Dette kan opnås ved omhyggelig tælling af interkostale rum. Desuden, hvis der opstår en mindre mængde af blødning under proceduren, kan den fjernes med steril gaze. Hvis blødningen er betydelig, men kirurgen har sandsynligvis ikke afkølet musen tilstrækkeligt, før du indleder, og yderligere er behov for køling. Bemærk venligst, at graden af afkøling bør kontrolleres omhyggeligt for at sikre puls på omkring 20 bpm for at visualisere kranspulsåren.
På grund af den lille størrelse af neonatale mus, er høj opløsning ekkokardiografi kræves for at opnå tydelige billeder M-mode til analyse af hjertefunktionen. For de bedste resultater, sikre pulsomkring 400 bpm med let anæstesi (0,5 - 1% isofluran inhalation) og opretholde normal kropstemperatur (opvarmet dock og varmes ekko gel). Billeder er bedst erhverves hvis kroppen hælder lidt mod højre skulder (~ 5 ° kranialt og 5 ° mod højre). Sikre tilstrækkelig ekko gel påføres minimere støj.
Selv om denne fremgangsmåde giver dog 100% reproducerbarhed, kan størrelsen af infarktet være noget variabel afhængig af kranspulsåren forgrening anatomi af den individuelle nyfødte (figur 3). Som et resultat, kan højere n tal være påkrævet for at nå statistisk signifikans i bestemmelse af virkningerne af forskellige behandlinger eller genetiske manipulationer på hjertets regenerering. Men denne tilgang rummer store fordele i forhold både neonatal apex resektion og kryobeskadigelse som patofysiologien af disse mekanismer for skade kan være helt forskellig fra MI og kan således ikke præcist renuværende menneske MI 8,20. Denne tilgang mere direkte efterligner typisk menneskelig skade, og kan bruges til at studere hjerte-regenerering i fastsættelsen af pattedyr MI.
Denne model er enestående, da det giver mulighed for studiet af forskellene i mekanismerne i nyttiggørelse fra hjerte-skade mellem den ikke-regenerativ (voksen) og regenerativ (neonatal) pattedyr myokardiet. For eksempel er de voksne mus MI model resulterer i permanent ardannelse. Ventrikulær brud ofte forekommer som et resultat af infarkt ekspansion. Det er vores erfaring med denne model (> 100 operationer, upublicerede data), fuldstændig regenerering er tydelig 21 dage efter infarkt og ventrikulær brud er ikke observeret. De oplysninger påløbne af brug af denne model kan give hidtil ukendte indsigt i mekanismer, der kan fremme hjerte-regeneration i den voksne.
Nyere beviser indikerer cardiomyocyte spredning er en stor bidragyder til hjerte-regenerering 9 4,21. Yderligere forskning ved hjælp af protokollen præsenteres her kan pege på terapeutiske mål for induktion af hjerte-regenerering post-MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
