Abstract
L'infarto miocardico indotta da legatura coronarica è stato utilizzato in molti modelli animali come strumento per studiare i meccanismi di riparazione e rigenerazione cardiaca, e di definire nuovi bersagli per terapie. Per decenni, i modelli di rigenerazione cardiaco completo esistevano in anfibi e pesci, ma una controparte di mammifero non era disponibile. La recente scoperta di una finestra postnatale durante la quale i topi possiedono capacità rigenerative ha portato alla creazione di un modello di mammiferi di rigenerazione cardiaca. Un modello chirurgica di rigenerazione cardiaca mammiferi nel topo neonatale è presentato qui. In breve, postnatale giorno 1 (P1) i topi sono anestetizzati con isoflurano e collocato su un tampone di ghiaccio per indurre ipotermia. Dopo il torace è aperto, e discendente anteriore dell'arteria coronaria (LAD) è visualizzata, una sutura è disposta intorno alla LAD infliggere ischemia miocardica nel ventricolo sinistro. La procedura chirurgica richiede 10-15 minuti. Visualizzare l'arteria coronaria ècruciale per sutura accurate e riproducibilità. Infarto del miocardio e disfunzione cardiaca sono confermati da cloruro di trifenil-tetrazolio (TTC) di colorazione e l'ecocardiografia, rispettivamente. completa rigenerazione 21 giorni dopo l'infarto miocardico è verificato da istologico. Questo protocollo può essere utilizzato come strumento per chiarire i meccanismi di rigenerazione cardiaca mammiferi dopo infarto miocardico.
Introduction
Infarto del miocardio (MI) è una delle principali cause di morte nel mondo, e rimane responsabile di circa un terzo dei casi di insufficienza cardiaca 1. Mentre l'avvento di intervento percutaneo e continua ottimizzazione dell'uso di trombolitici è aumentato riperfusione seguente MI, cardiomiociti morte e la perdita di contractile miocardio si verifica comunque. Restano anche un gran numero di pazienti "no-opzione" che non sono candidati o non vedono beneficiare di questi interventi. Questi pazienti continuano a subire ischemia invalidanti che portano alla formazione di cicatrice e rimodellamento ventricolare deleteria come un meccanismo di infarto guarigione. Questo processo in ultima analisi, insufficienza cardiaca, per cui la prognosi rimane scarsa, nonostante la gestione farmacologica ottimale con enzimi inibitori (ACE) dell'enzima di conversione dell'angiotensina e beta-bloccanti. Purtroppo, il tasso di mortalità a un anno per i pazienti con funzione ventricolare sinistra gravemente compromessa ancora rimane comealto come il 26% 2. trapianto di cuore è l'opzione di trattamento finale per i pazienti con insufficienza cardiaca. Tuttavia, il pool di donatori limitato per il trapianto di cuore non fanno di questo una valida opzione per maggior parte dei pazienti. Così, la scoperta di nuovi agenti terapeutici per ripristinare il miocardio danneggiato resta fondamentale per risolvere il problema della malattia cardiaca. modelli animali affidabili di danno cardiaco sono quindi richiesti una componente fondamentale di questo processo.
Dogma tradizionale ha dettato che cardiomiociti adulti sono post-mitotico, terminally cellule differenziate, in grado di dividere o de-differenziazione per sostituire il miocardio danneggiato 3. In quanto tale, un cuore dei mammiferi adulti non avrebbe mai potuto recuperare completamente da un infortunio, e cardiomiociti perso sarebbe stato sostituito con tessuto fibroso. Così, la ricerca si è concentrata principalmente sugli agenti terapeutici per ridurre al minimo l'espansione dell'infarto e ridurre la formazione di cicatrici. Più di recente, tuttavia, si è verificato un cambiamento di paradigmanel pensiero circostante guarigione cardiaco e molti sforzi di ricerca sono stati reindirizzati a concentrarsi sul potenziale di rigenerazione cardiaca 4.
Fino a poco tempo, lo studio in vivo della rigenerazione cardiaca è stato limitato ai modelli non vertebrati, come quelli anfibi Urodeli e pesci teleostei 5-7. Tuttavia, la scoperta della capacità di rigenerazione cardiaca nel topo neonatale ha portato allo sviluppo di due modelli chirurgici di rigenerazione cardiaca mammiferi: resezione del cardiaca occlusione dell'arteria coronaria vertice e di indurre infarto miocardico 8,9. Nel 2011, un modello di resezione dell'apice del mouse è stato utilizzato per dimostrare che la rigenerazione cardiaca completa disponibile in giorno postnatale 1 (P1). Tuttavia, questa capacità diminuisce rapidamente dopo il periodo neonatale iniziale. Il cuore dei mammiferi perde il suo potenziale rigenerativo poco dopo la nascita a P7 come il numero di cellule progenitrici declino, e cardiomiociti diventare binucleate, perderela loro competenza proliferativa, e in modo permanente uscire al 10,11 ciclo cellulare. Capire le differenze fondamentali tra il neonatale e adulta cuore dei mammiferi può portare a nuovi approfondimenti di rigenerazione cardiaca.
Mentre la resezione dell'apice offre infatti spaccato ricrescita del tessuto contrattile, il modello non simula danno cardiaco umano tipico, e pertanto non si presta anche per lo sviluppo di terapie. Il modello di arteria occlusione coronarica, tuttavia, simula più direttamente gli aspetti fisiopatologici della MI patologia, e quindi può fornire spunti più utili in meccanismi che possono essere applicabili al progresso terapeutico per uso umano.
Legatura coronarica chirurgica è stato usato come un utile tecnica sperimentale in molti modelli animali 12-14. In coronaria modello di legatura adulti, gli animali sono anestetizzati e intubati per consentire l'apertura della cavità toracica mantenendo respiratisopra. Il cuore continua a battere regolarmente, permettendo la visualizzazione del sistema vascolare coronarica e consentendo il posizionamento della sutura accurata. Inoltre, il cuore rimane rosa come perfusione continua, e dopo la legatura miocardio ischemico appare pallido, indicando successo legatura dell'arteria coronaria. Il protocollo descritto per topi neonati, tuttavia, è meno affidabile come l'arteria coronaria non viene visualizzato e il chirurgo deve valutare dove posizionare la sutura 15. Sebbene l'anatomia generale del sistema vascolare coronarico è la stessa, la variabilità singolo animale nella direzione e ramificazione della LAD esiste 16. Così, quando "andare in cieco", l'arteria potrebbe essere facilmente perso. Altre tecniche, come l'ecocardiografia sono poi tenuti a confermare l'induzione di successo di MI, e per assicurare tutti gli interventi chirurgici comportano una dimensione dell'infarto simile. Qui descritto è un miglioramento su un metodo di recente pubblicato il 15, in cui la posizione del LAD può essere allacpubbli- e quindi LAD può essere legata per indurre riproducibile MI.
Questa tecnica non richiede intubazione endotracheale o la ventilazione meccanica, come toracotomia in uno stato ipotermico nel topo neonatale non provocare il collasso del polmone. Tuttavia, nel metodo precedentemente descritto, ipotermia grave deve essere indotto a punto sia apnea completa e cessazione del ritmo cardiaco 15. Il principale limite di questo approccio è che l'arteria coronaria non è perfuso e cuore appare chiaro anche prima LAD legatura. Nell'approccio qui descritto, visualizzazione coronarica è possibile in una fase di torpore prima profonda ipotermia e cardiaco cessazione ritmo, con recupero completo del mouse neonatale dopo l'intervento chirurgico. Questo metodo offre il grande vantaggio di 100% riproducibilità.
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Protocol
coppie nidificanti di topi CD-1 IG-S C57BL / 6 e sono stati acquistati da Charles River. Gli animali utilizzati in questo studio sono stati trattati in conformità con le linee guida del Consiglio canadese sulla cura degli animali, e protocolli di studio sono stati approvati dal Animal Usa sottocommissione alla Western University, London, Canada.
1. Animal Care
- Dopo il parto è completa e cuccioli sono stati inizialmente allattati al seno dalla madre per pochi ore, metterli in una gabbia diversa con un CD-1 madre adottiva. Madri CD-1 visualizzare un fenotipo più tranquillo con un forte istinto promozione, e hanno una minore tendenza a cannibalizzare cuccioli feriti 15.
2. Chirurgia
- Indurre l'anestesia ponendo il cucciolo in una camera sigillata isoflurano (circa 500 ml di 100% v / v isoflurano permesso di dissipare 1.300 cm 3 camera). Tenere il mouse nella camera fino a cessazione del movimento (circa 30 sec).
- rimuovere moutilizzare dalla camera isoflurano e indurre l'anestesia ipotermico posizionando il mouse sul ghiaccio bagnato. Per evitare il congelamento, mettere ghiaccio all'interno di un guanto chirurgico sterile, avvolgere il mouse all'interno del guanto e coprire il guanto con ghiaccio o avvolgere il mouse in garza umida sterile e posizionarlo sul ghiaccio.
NOTA: I topi raffreddano più velocemente quando il contatto con il ghiaccio è su una superficie più ampia, e come tale ghiaccio fuso possono abbreviare i tempi di induzione ipotermia. - Confermare l'anestesia per mancanza di risposta movimento punta e la coda pizzico.
NOTA: cessazione del movimento provocato avviene ad una temperatura del corpo tra 15 ° C e 8 ° C. (Tempo di raffreddamento a questa temperatura di circa 1 min). Apnea completa e asistolia non è richiesto per LAD legatura. - Spostare il letto ghiaccio sulla zona chirurgica dotata di un microscopio operatorio. Assicurarsi che il cucciolo del mouse rimane sul ghiaccio durante tutta la procedura chirurgica.
NOTA: l'area chirurgica, garza e strumenti chirurgici devono essere sterilizzati. maintain campo sterile durante tutta la procedura, e l'usura monouso, guanti chirurgici sterili. Pomata oftalmica non è necessaria in quanto i topi sono nati con i loro occhi chiusi 17. - Posizionare il cucciolo del mouse in decubito laterale destro. Disinfettare petto strofinando delicatamente con una soluzione di iodio-povidone seguito da un tampone imbevuto di etanolo.
- Eseguire incisione cutanea sul petto a sinistra lungo la linea medio-ascellare, tagliando la pelle tra il xifoidea e dell'ascella sinistra pochi millimetri sotto la zampa anteriore sinistra. Anche utilizzare le forbici per tagliare attraverso lo strato di muscolo pettorale sottostante.
- Eseguire una toracotomia sinistra nel 4 ° spazio intercostale separando costole e muscoli intercostali con una pinza.
NOTA: costole neonatali sono molto fragili e possono essere facilmente rotto. Per evitare questo, delicatamente costole separati aprendo una pinza lungo il muscolo intercostale (invece di afferrare costole). - Visualizza la discendente anteriore dell'arteria coronaria (LAD) che emerge da AUR sinistraicolo dietro la vena polmonare e scendendo al di là della grande vena cardiaca.
NOTA: In questa prima finestra neonatale, il timo è spesso visualizzato e può coprire parte della base cardiaca. Il LAD può essere visto emergente accanto alla posizione del timo, a seconda dell'angolo di incisione toracica. - Legare il LAD passando una sutura 11-0 nylon (0,007 millimetri di diametro ago) sotto l'arteria attraverso la metà del ventricolo al di sotto del padiglione auricolare sinistro (Figura 1C). L'ischemia è confermata con pallore del miocardio di sotto del sito di sutura (Figura 1G).
- Chiudere l'incisione toracica con 8-0 punti di sutura in nylon (ago di diametro 0,15 millimetri). Utilizzare due punti di sutura per chiudere le costole. Posizionare entrambi suture nervatura prima legatura per garantire l'ago non forare i polmoni quando passa attraverso la cavità del corpo.
- Dopo aver chiuso le costole, togliere il mouse dal letto di ghiaccio. Mantenere il mouse all'interno dell'area chirurgica e posizionarlo direttamente sulla sterile chirurgico perWEL sopra una piastra elettrica calda a 37 ° C per iniziare il riscaldamento.
- Una volta sulla zona sterile riscaldata, chiudere gli strati muscolari e cutanee utilizzando 8-0 punti di sutura in nylon (ago di diametro 0,15 millimetri). Utilizzare uno di sutura per lo strato muscolare e utilizzare due punti di sutura per l'incisione cutanea.
NOTA: Muscle e strati della pelle possono essere chiuse su una piastra elettrica per ridurre il tempo di esposizione ipotermia. Temperatura di mouse comincia a salire, una volta immessi sul rilievo di riscaldamento, ma rimane sufficientemente basso per l'anestesia di mantenimento durante la chiusura dei muscoli e della pelle.
3. recupero chirurgico
- Continuare rapido riscaldamento su una piastra elettrica caldo fino al ritorno del movimento spontaneo. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Rimuovere iodopovidone e sangue strofinando delicatamente sito della lesione con etanolo tampone.
- Dopo il recupero sufficiente dall'anestesia, rimuoverlo dalla zona chirurgici sterili, striscio con biancheria da Fostergabbia della madre, e pup ritorno alla madre adottiva. Questo aiuta a prevenire il rigetto materna o cannibalizzazione.
NOTA: Non restituire cuccioli a una gabbia con altri animali fino alla completa guarigione. Se un'intera cucciolata non è stato utilizzato, e fratellini rimanere con la madre adottiva, posizionare cuccioli recuperati nel mezzo della cucciolata. Se l'esecuzione di più di un intervento chirurgico, completa tutti gli interventi chirurgici necessari per una cucciolata individuo prima di tornare topi per la loro madre adottiva. - Osservare il comportamento della madre adottiva verso il cucciolo ogni 10 - 15 minuti per 2 - 3 ore per garantire l'accettazione del cucciolo. Se la madre mostra aggressività verso il cucciolo ferito, rimuovere il cucciolo e l'eutanasia per overdose isoflurano (> 5%; fino alla sua cessazione della respirazione), seguita dalla decapitazione. NOTA: perioperatoria farmaci analgesia non sono richiesti i riflessi di dolore centralizzati non sono completamente sviluppati in questa prima di 15 anni.
4. Misura del Myocardial Infarto Size 4 -6 ore post-MI
- Consentire cuccioli di recuperare nella cura di un CD-1 madre adottiva per un periodo di 4 - 6 ore. Rimuovere il cucciolo dalla gabbia con la madre e l'eutanasia è per overdose isoflurano seguita da decapitazione con grandi forbici.
- Accise L'cuore sotto microscopio da dissezione, attenzione a non strappare il miocardio.
- Tagliare la pelle dal processo xifoideo all'inizio del torace. Aprire parete addominale sotto la gabbia toracica. Afferrare la gabbia toracica inferiore e tagliare le costole e la muscolatura longitudinalmente lungo la linea medio-ascellare sinistro dal diaframma per l'ascella.
- Tenere le forbici in piano trasversale e tagliare attentamente diaframma da sinistra a destra. Assicurarsi di posizionare forbici di sotto del livello del cuore, in modo da evitare danni al vertice.
- Afferrare gabbia toracica e tagliare a destra di costole e la muscolatura lungo la linea medio-ascellare destra. Rimuovere tutte le connessioni vascolari al cuore con le forbici. Rimuovere il cuore dalla cavità toracica afferrandola base.
- Sezione cuore in tre pezzi con una lama di rasoio in acciaio al carbonio chirurgico. Effettuare il primo taglio lungo l'asse corto del cuore a metà tra la sutura e l'apice cardiaco. Effettuare il secondo taglio a livello della sutura (Figura 3A).
NOTA: Questo lascia una sezione apice spessore di circa 0,75 millimetri del peso di 0,0018 g; una sezione mid-base di circa 1 mm di spessore, con un peso 0,0065 g; e la base del cuore. - Posizionare sezioni cuore in 1% 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) a temperatura ambiente per 10 - 15 min. guardare con attenzione esemplare per evitare un eccesso di colorazione.
- Per aumentare il contrasto, correggere le fette di cuore colorato con 4% paraformaldeide notte a 4 ° C. Per calcolare l'area infartuale%, sezioni di cuore fotografare e misurare la zona dell'infarto su software di imaging. Il miocardio vitale macchie rosse mentre l'area infartuale è delimitata come bianco 18.
5. Misura dellaFunzione cardiaca mediante ecocardiografia post-MI
- Consentire cuccioli di recuperare nella cura di un CD-1 madre adottiva per un periodo di 24 - 48 ore. Indurre l'anestesia ponendo il cucciolo in una camera sigillata isoflurano (5% isoflurano). Tenere il mouse nella camera fino a cessazione del movimento (circa 30 sec).
- Fissare il cucciolo in posizione supina su un bacino riscaldato (temperatura 37 ° C) con il suo naso in un cono per fornire 0,5 - 1% isoflurano (per anestesia di mantenimento). Posizionare il gel eco pre-riscaldato nella zona toracica sinistra.
- Ottenere una visione a lungo l'asse parasternale del ventricolo sinistro (LV). Assicurarsi che le immagini sono ottenute sotto del livello della sutura nel LV. Dopo aver acquisito la posizione, ruotare la sonda ad ultrasuoni (40 MHz) 90 ° per ottenere una visione parasternale asse corto, e registrare M-mode immagini ecocardiografiche.
- Misurare la diastolica finale e telesistolico ventricolare sinistro, diametri interni dalle immagini M-mode asse corto. Calcola frazione di eiezione e fractioaccorciamento finale.
6. Misura del Myocardial Infarto Size 24 ore post-MI
- Consentire cuccioli di recuperare nella cura di un CD-1 madre adottiva per un periodo di 24 ore. Rimuovere il cucciolo dalla gabbia con la madre e l'eutanasia è per overdose isoflurano seguita da decapitazione con grandi forbici.
- Aprire la cavità toracica come al punto 4.2. Prima di ablazione del cuore, cogliere con attenzione l'aorta toracica appena sopra il diaframma con una pinza sottile. Tenere forbici sottili nel piano coronale, piatte contro la parete toracica, e tagliare l'aorta toracica dalla parete toracica posteriore forbici muoversi nella direzione craniale.
- Tagliare l'aorta dalla parete toracica e le altre connessioni fino al cuore. Asportare cuore afferrando la vena cava superiore e tagliare tutte le altre connessioni vascolari al corpo.
- Risciacquare cuore (con l'aorta allegati) in soluzione salina. cannulate con attenzione l'aorta toracica con un ago calibro 30 e legare unorta di cannula 8-0 nylon filo di sutura.
- Profumato cuore di 1 ml di soluzione fisiologica attraverso l'aorta mediante un ago da 30 gauge ad una velocità di 1 ml / min. Profumato cuore con 150 ml di 2% soluzione di blu Evans ad una velocità di 1 ml / min. Rimuovere il cuore dalla cannula, la sezione in tre pezzi e macchiare con TTC come descritto nel paragrafo 4.
- Per calcolare la dimensione infartuale, sezioni di cuore fotografare e misurare la zona dell'infarto su software di imaging. Il miocardio vitale macchie blu, la zona a macchie rischio rosso, e l'area infartuale è delimitata come bianco.
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Representative Results
La procedura di infarto miocardico a P1 può essere completato in 10 - 15 minuti e ha un tasso di mortalità del 7,8% (5 su 64 cuccioli). Dopo l'intervento chirurgico, i topi recuperare da anestesia ipotermico entro i prossimi 5 - 20 min (tempo di recupero dipende dalla temperatura del corpo raggiunta durante l'anestesia e la velocità del chirurgo). Quando si utilizza cuccioli P7 (per confronto con un miocardio non rigenerativo), è necessario un periodo di raffreddamento più tempo per raggiungere torpore. cuccioli P7 sono molto più grandi e più difficoltà recupero sia danno cardiaco ed ipotermia, risultando in un tasso di mortalità molto più elevato del 26,9% (14 su 52 cuccioli).
I risultati di studi precedenti sono confermati nel presente documento, che indica l'induzione di anestesia ipotermico a chiudere a 10 ° C (tra 8 ° C e 15 ° C) 19. All'interno di questa finestra di temperatura, frequenza cardiaca fa lento,ma il ritmo continua a tassi compresi tra 24 bpm e 11 bpm. La bassa frequenza cardiaca a questo livello di raffreddamento riduce in modo significativo sanguinamento intraoperatorio. Il LAD può essere facilmente visualizzato e ligato a queste temperature (Figura 1). Il LAD rimane visibile fino a quando la temperatura del corpo a raggiungere tra 9,6 ° C e 4,9 ° C, causando l'abbassamento della frequenza cardiaca al 2 bpm o asistolia.
Dopo LAD legatura a P1, cuccioli recuperare pienamente e crescono a una dimensione corporea paragonabile a quella dei controlli littermate. Una volta rimesso con la loro madre adottiva, cuccioli riacquistano capacità di sensibilizzazione e di alimentazione paragonabili a cucciolata in circa 10 min. All'esame istologico 3 giorni post-MI, vi è evidenza di infarto, di infiltrarsi cellule infiammatorie, una tipica risposta post-infarto (Figura 2). Al giorno 7 post-MI, tessuti del ventricolo sinistro appare normale. Di giorno 21 post-MI, completa crigenerazione ardiac si è verificato.
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione 4-6 ore post-MI è stata usata come una conferma di induzione consistente di MI. L'area rossa rappresenta miocardio vitale e l'area bianca rappresenta tessuto morto ischemico. In un totale di 13 LAD ambulatori legatura, 100% dei cuori erano infartuata, con una dimensione media infarto del 36% (Figura 3). TTC colorazione con blu Evans perfusione è stata eseguita anche a 24 ore post-MI per dimostrare la persistenza di tessuto infartuato e misurare dimensioni dell'infarto in base all'area a rischio (Figura 4). In questi cuori, miocardio vitale macchie blu, la zona a macchie rischio rosso, e l'area infartuale è delimitata come bianco. dimensione dell'infarto è stata calcolata come percentuale dell'area a rischio. In 4 ambulatori legatura LAD, 100% dei cuori erano infartuata, con una dimensione media infarto del 49% della superficie a rischio (Figura 4).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Per confermare l'induzione dell'infarto, l'ecocardiografia è stata eseguita a 24 e 48 ore post-MI. A 24 ore post-MI, frazione di eiezione (EF) è stata significativamente ridotta dal 84% al 74%, e la frazione di accorciamento (FS) significativamente ridotta dal 50% al 40% (Figura 5). Con 48 hr post-MI, EF è ulteriormente ridotta al 46%, rispetto al 80% nei controlli e FS è stata ridotta in modo significativo al 25%, rispetto al 50% nei controlli. Inoltre, c'è stata una significativa riduzione del diametro interno sistolica ventricolare sinistra a 48 ore (Figura 6). LV spessore della parete anteriore non era significativamente diminuita a 24 o 48 ore post-MI (figure 5 e 6).
Figura 1. coronarica è visibile durante neonatale LAD procedura. P1 af neonatale del mouseter anestesia ipotermico, incisione cutanea, incisione muscolare e toracotomia laterale nel quarto spazio intercostale. A) a sinistra coronaria discendente anteriore (LAD) è visibile. BD) 11-0 sutura in nylon viene fatto passare attraverso la metà del ventricolo. E) LAD è legatura e sbiancamento osservato sotto il sito di sutura. f) eg) sono ingrandimenti di A) ed e), rispettivamente. Occ. LAD, occlusa discendente anteriore sinistra. Los Angeles, lasciò atrio. LV, ventricolo sinistro. GCV, grande vena coronaria. freccia bianca, LAD. punta di freccia nera, abbagliamento dall'illuminazione. Barre di scala sono da 1 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La prova della completa Cardiac rigenerazione dopo LAD legatura in topi neonati. colorazione tricromica di Masson dopo LAD legatura in topi P1. cuori interi e ingrandimenti presso le aree di infarto sono indicati il giorno 3, 7 e 21 dopo LAD legatura. Nota perdita di miociti e cellule infiammatorie infiltrarsi nella regione di infarto al giorno 3 post-MI (freccia bianca). completa rigenerazione zona dell'infarto con inizio alle 7 ° giorno post-MI. Poche prove di fibrosi rilevare giorno 21 post-MI. Barre di scala sono 200, 100 e 50 micron per 40X, ingrandimenti 200X e 630X, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. neonatale LAD legatura è riproducibile al 100%. A) le linee di sezionamento di tutto il cuore per creare un pezzo apice 0,75 millimetri e un pezzo 1 millimetro a metà base per TTCcolorazione. B) Immagini rappresentative della TTC macchiato di controllo sham e KOP ligato cuori. Barre di scala sono di 1 mm. Dimensioni C) dell'infarto in 13 legature LAD in P1 topi neonati. Cuori raccolti 4-6 ore post-MI e la dimensione infartuale misurata dopo TTC colorazione. Il rosso indica miocardio vitale; bianca indica necrosi. I dati sono media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. neonatale LAD legatura Risultati in Infarto affidabile. A) le dimensioni dell'infarto in% della zona ischemica dopo LAD legatura in P1 topi neonati (n = 4). Cuori sono stati raccolti 24 ore post-MI e dimensione dell'infarto è stata misurata dopo Evans blu e TTC colorazione. Blu indica miocardio vitale; rosso indica zona a rischio; bianca indica necrosis. I dati sono media ± SEM. B) Immagini rappresentative della Evans blu e TTC LAD macchiato cuori legatura dopo LAD legatura. Scala Bar = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Risultati neonatale LAD Ligation in Cardiac erettile a 24 ore post-MI. La funzione cardiaca è stata valutata mediante ecocardiografia. A) immagini Rappresentante M-mode per entrambi i topi sham gestito e LAD legatura. Telediastole e fine sistole sono indicati da frecce. B) Misure di accorciamento frazionale, frazione di eiezione, e il diametro interno del ventricolo sinistro in diastole sia e la sistole. I dati sono media ± SEM. N = 8 e 7 per sham e legatura dell'arteria coronaria (CAL), rispettivamente. * P <0. 05. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Risultati neonatale LAD Ligation in Cardiac erettile a 48 ore post-MI. La funzione cardiaca è stata valutata mediante ecocardiografia. A) Rappresentante M-mode immagini che mostrano telediastole (lunghe frecce) e di fine-sistole (brevi frecce) sia per sham gestito e LAD legatura topi. b) misurazioni funzionali cardiache mediante ecocardiografia, tra cui frazione di accorciamento, frazione di eiezione, e il diametro interno del ventricolo sinistro in diastole sia e la sistole. I dati sono media ± SEM. N = 4 e 6 rispettivamente per sham e coronarica legatura dell'arteria (CAL),. * P <0.05, ** P <0,01.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La legatura LAD chirurgica dimostrato qui è un metodo affidabile per produrre MI in topi neonati. Questo modello fornisce ai ricercatori con un modello riproducibile con cui studiare la rigenerazione del cuore dei mammiferi. La visualizzazione del sistema vascolare coronarico è un componente chiave di questo metodo, garantendo il posizionamento della sutura corretta e garantendo così la riproducibilità. Mentre topi adulti non possiedono le capacità poikilothermic, la temperatura corporea e il metabolismo dei topi neonati è strettamente associata con la temperatura ambiente. Inoltre, le dimensioni ridotte dei topi neonati li rende ideali per l'induzione ipotermico da raffreddamento superficiale. I tempi di intervento chirurgico e la temperatura corporea del mouse sono cruciali per la precisione a replicare questa procedura e, quindi, deve essere attentamente monitorato. Ligation appena possibile dopo torpore raggiunta fornisce la possibilità di visualizzare imbiancamento del miocardio post-legatura, confermando il successo chirurgico.
Ci sono mumetodi ltiple che possono essere utilizzati per confermare MI induzione. Questi includono colorazione TTC, ecocardiografia e l'analisi istologica. colorazione TTC è a basso costo, riproducibile e affidabile, e facilmente eseguita con un elevato throughput. Per questi motivi, la colorazione TTC è stato ampiamente utilizzato. L'ecocardiografia può essere usato per non invasivo monitorare i cambiamenti nella funzione cardiaca post-MI nel corso del tempo. prova definitiva di MI può essere dimostrata attraverso l'analisi istologica. Nel presente studio, tutte e tre le tecniche di cui sopra sono stati impiegati per verificare l'induzione successo di MI.
La visualizzazione di LAD è fondamentale per il successo di induzione MI. Se l'investigatore sta vivendo difficoltà visualizzazione della LAD (probabilmente a causa di profonda dell'induzione ipotermia), il padiglione auricolare sinistro può essere sollevato leggermente con una pinza, come la radice principale della LAD è più ampio dei segmenti più distali e può essere più facilmente visibile. Se il LAD non può essere visualizzato, il ricercatore non dovrebbe presumere lo arteriacazione. Questo cucciolo non deve essere usato per la legatura sperimentale e potrebbe invece essere usato come una farsa di controllo operato.
Voce corretta nella cavità toracica al 4 ° spazio intercostale è importante ottenere una visualizzazione ottimale e spazio per LAD legatura. Ciò può essere ottenuto attraverso un'attenta conteggio degli spazi intercostali. Inoltre, se una quantità minore di sanguinamento si verifica durante il procedimento, può essere rimosso con garza sterile. Se il sanguinamento è significativo, tuttavia, il chirurgo ha probabilmente non raffreddato il mouse sufficientemente prima di iniziare la procedura, ed è richiesto un ulteriore raffreddamento. Si noti che il grado di raffreddamento deve essere controllata attentamente per assicurare frequenza cardiaca a circa 20 bpm per visualizzare l'arteria coronaria.
A causa delle piccole dimensioni dei topi neonati, alta risoluzione ecocardiografia è necessaria per ottenere immagini di modo M chiari per l'analisi della funzione cardiaca. Per ottenere risultati ottimali, assicurare la frequenza cardiaca acirca 400 bpm con l'anestesia luce (0,5-1% isoflurano inalazione) e mantenere la temperatura corporea normale (dock riscaldata e riscaldato gel eco). Le immagini vengono acquisite meglio se il corpo è inclinato leggermente verso la spalla destra (~ 5 ° craniale e 5 ° verso destra). Assicurarsi che il gel eco sufficiente viene applicato per ridurre al minimo il rumore.
Sebbene questo approccio non offrono 100% riproducibilità, le dimensioni dell'infarto può essere alquanto variabile in funzione coronaria ramificazione anatomia del singolo neonato (Figura 3). Come risultato, n numeri superiore può essere necessaria per raggiungere la significatività statistica per determinare gli effetti di diversi trattamenti o manipolazioni genetiche sulla rigenerazione cardiaca. Tuttavia, questo approccio tiene principali vantaggi rispetto sia resezione dell'apice neonatale e cryoinjury la fisiopatologia di questi meccanismi di danno può essere completamente diverso da MI e quindi non può accuratamente ripresente umana MI 8,20. Questo approccio imita più direttamente pregiudizio umano tipico, e può essere utilizzato per studiare la rigenerazione cardiaca nel contesto di mammiferi MI.
Questo modello è unico in quanto consente lo studio delle differenze nei meccanismi di recupero da lesione cardiaca tra la non-rigenerativo (adulti) e la rigenerazione (neonatale) miocardio mammiferi. Ad esempio, l'adulto del mouse risultati del modello MI in formazione di cicatrici permanenti. rottura ventricolare si verifica spesso a causa di espansione dell'infarto. Nella nostra esperienza con questo modello (> 100 interventi chirurgici; dati non pubblicati), completa la rigenerazione è evidente non è stata osservata 21 giorni post-infarto e la rottura del ventricolo. Le informazioni maturato dall'uso di questo modello può offrire nuove intuizioni in meccanismi che possono promuovere la rigenerazione cardiaca negli adulti.
Recenti evidenze indicano cardiomiociti proliferazione è un importante contributo per la rigenerazione cardiaca 9 4,21 rigenerazione cardiaca. Ulteriori ricerche utilizzando il protocollo presentato qui può puntare a bersagli terapeutici per l'induzione della rigenerazione cardiaca post-MI.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
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