Abstract
冠状動脈の結紮によって誘導される心筋梗塞は、心臓の修復および再生のメカニズムを研究するために、および治療のための新しいターゲットを定義するためのツールとして、多くの動物モデルにおいて使用されています。何十年もの間、完全な心臓再生のモデルは、両生類、魚類に存在していたが、哺乳類のカウンターパートは使用できませんでした。マウスは、回生能力を持っている間、生後ウィンドウの最近の発見は、心臓再生の哺乳動物モデルの確立につながっています。新生児マウスでは、哺乳動物の心臓再生の外科的モデルが本明細書に提示されます。簡潔には、生後1日目（P1）マウスをイソフルランで麻酔し、低体温を誘導するために氷のパッドの上に配置されます。胸を開いて、冠状動脈（LAD）を左前が可視化された後に、縫合糸は、左心室における心筋虚血を与えるためにLADの周りに配置されています。外科的手順は、10〜15分かかります。冠動脈をされている可視化正確な縫合糸の配置と再現性のために重要。心筋梗塞や心機能障害は、それぞれ、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色および心エコー検査によって確認されています。完全再生後21日心筋梗塞は、組織学によって確認されます。このプロトコルは、心筋梗塞後の哺乳動物の心臓再生のメカニズムを解明するためのツールとして使用することができます。
Introduction
心筋梗塞（MI）は、世界中で死亡の主な原因であり、心不全症例1の約3分の1の原因で残ります。血栓溶解剤の使用の経皮的介入と連続最適化の出現は、MI後の再灌流を増加している一方で、収縮心筋の心筋細胞死と損失にもかかわらず発生します。またための候補ではないか、これらの介入から利益が表示されていない「無オプション」多数の患者が残っています。これらの患者は、梗塞治癒のメカニズムとして瘢痕形成および有害な心室リモデリングにつながる虚血を無効にすることを経験し続けています。このプロセスは、最終的な予後は、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤およびβ遮断薬との最適な薬理学的管理にもかかわらず、乏しいままであるため心不全をもたらします。残念ながら、重度障害者の左心室機能を持つ患者のための1年間の死亡率は依然として残ります26％2と高いです。心臓移植は心不全患者のための最終的な治療選択肢です。しかし、心臓移植のための限られたドナープールは、このほとんどの患者のための実行可能な選択肢がありません。従って、損傷した心筋を回復するための新規治療薬の発見は、心疾患の問題を解決するための最優先事項のままです。心臓傷害の信頼できる動物モデルは、したがって、このプロセスの重要な構成要素として必要とされています。
伝統的な教義は、成人心筋細胞が分裂または損傷した心筋3を交換するために脱分化することができない有糸分裂後、最終分化細胞であることを決定付けました。このように、成人の哺乳類の心臓が完全に負傷から回復することができませんでしたし、失われた心筋細胞は、線維組織に置き換えます。したがって、研究は、梗塞の拡大を最小限にし、瘢痕形成を低減する治療薬に主に焦点を当てています。しかし最近、パラダイムシフトが発生しました心の癒しと多くの研究努力を取り巻く思考に心臓再生4のための潜在的に注力してリダイレクトされています。
最近まで、心臓再生のin vivoでの研究は、このような有尾類両生類や硬骨魚5-7のものなどの非脊椎動物のモデルに限定されていました。心筋梗塞8,9を誘導するために、心尖部の切除および冠動脈閉塞ただし、新生仔マウスにおける心臓の再生のための能力の発見は、哺乳動物の心臓再生二外科的モデルの開発につながっています。 2011年には、マウス頂点切除モデルは、完全な心臓の再生が生後1日目（P1）で可能であることを実証するために使用されました。しかし、この容量は、初期新生児期の後に急速に低下します。哺乳類の心臓はまもなく前駆細胞数の減少などP7で出産後にその再生能力を失い、心筋細胞が二核となる、失いますそれらの増殖能力、および恒久的に細胞周期10,11を終了します。新生児と成人の哺乳類の心臓との間の基本的な違いを理解することは、心臓再生への新たな洞察につながる可能性があります。
頂点切除が実際に収縮性組織の再成長への洞察を提供していますが、モデルは、典型的なヒトの心臓の損傷をシミュレートしないため、治療薬の開発にも同様に向いていません。冠状動脈閉塞モデルは、しかしながら、より直接的MI病変の病態生理学的な側面をシミュレートし、したがって、ヒトへの使用のための治療の進歩にも適用可能である機構に多くの有用な洞察を提供してもよいです。
外科的冠状動脈結紮は、多くの動物モデル12-14に有用な実験手法として用いられてきました。成人の冠動脈結紮モデルでは、動物を麻酔し、respiratiを維持しながら、胸腔の開口を可能にするために挿管されていますに。心臓は冠状血管系の可視化を可能にし、正確な縫合糸の配置を考慮して、定期的に打つことを続けています。さらに灌流が続くように、心臓はピンクのままであり、連結後の虚血性心筋が成功した冠動脈結紮を示し、淡い表示されます。冠状動脈を可視化されておらず、外科医が縫合糸15を配置する場所を推定しなければならないので、新生児マウスのために記載されているプロトコルは、しかし、信頼性が低いです。冠血管系の一般的な解剖学は同じですが、LADの方向と分岐における個々の動物のばらつきが16存在します。 「ブラインドで行く、 "時したがって、動脈が簡単に見逃される可能性があります。例えば、心エコー検査などの他の技術は、その後、MIの成功した誘導を確認するために、すべての手術は、同様の梗塞サイズをもたらす確保する必要があります。 LADの位置がESTABすることができ、最近発表された方法15の改良は、ここにある説明しますlishedしたがって、LADを再現MIを誘導するために連結され得ます。
新生児マウスにおける低体温状態で開胸肺の崩壊を生じないように、この技術は、気管内挿管や人工呼吸器を必要としません。しかし、前述した方法では、重度の低体温は、完全無呼吸と心臓リズム15の停止の両方の点に誘導されなければなりません。このアプローチの主要な制限は、冠状動脈がもはや灌流されていることではないと心にもLAD結紮の前に淡い表示されます。本明細書に記載されたアプローチでは、冠状動脈の可視化は、手術後の新生児マウスの完全な回復と深い低体温や心臓リズム停止、前の無気力の時点で可能です。この方法では、100％の再現性の主な利点を提供しています。
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Protocol
C57BL / 6およびCD-1 IG-Sマウスの繁殖ペアは、チャールズリバーから購入しました。本研究で用いた動物は、動物管理上のカナダの協議会のガイドラインに従って処理し、研究プロトコールは、ウェスタン大学、ロンドン、カナダでの動物の使用小委員会によって承認されました。
1.動物ケア
- 出産が完了し、子犬が最初に母乳で数時間のために自分の母親にされた後、CD-1養母と異なるケージに配置します。 CD-1の母親は、強力な育成の本能と穏やかな表現型を表示し、負傷した子犬15を共食いする傾向が低いです。
2.手術
- 密封されたイソフルラン室（1300以上のcmの3室を放散させて100％（v / v）のイソフルランの約500μL）に子犬を置くことによって麻酔を誘導します。運動の停止（約30秒）までチャンバー内にマウスを保管してください。
- MOを削除しますイソフルラン室から使用し、濡れた氷の上にマウスを置くことによって、低体温麻酔を誘導します。凍傷を避けるために、無菌手術用手袋の内側に氷を置いて手袋内でマウスをラップし、氷のグローブをカバーまたは滅菌湿ったガーゼでマウスをラップし、氷の上に置きます。
注：マウスは、氷との接触がより大きな表面積の上にあるときより速く冷却し、このような溶融氷のように低体温の誘導時間を短縮することができます。 - つま先と尾のピンチへの移動応答の欠如によって麻酔を確認してください。
注：誘発運動の停止は、15℃と8℃の間、体温で起こります。 （約1分、この温度に冷却時間）。完全な無呼吸と心停止は、LAD結紮のために必要とされません 。 - 手術用顕微鏡を装備した手術領域に氷のベッドを移動します。マウスの子犬が全体の外科手術中に氷の上に残っていることを確認してください。
注：手術領域、ガーゼや手術器具を滅菌する必要があります。 Mainta手順を通して無菌領域で、かつ単回使用、無菌手術用手袋を着用してください。彼らの目には17を閉じた状態でマウスが生まれているように眼軟膏は必要ありません。 - 右側臥位でマウスの子犬を置きます。優しくエタノール綿棒続いポビドンヨード溶液で拭いて胸を消毒。
- 数ミリ左前脚の下に剣状突起と左腋窩の間の皮膚を切断することにより、腋窩線に沿って左胸に皮膚切開を行います。また、基になる胸筋層を切断するはさみを使用してください。
- 鉗子で肋骨と肋間筋を分離することにより、4 番目の肋間で左開胸を行います。
注記：新生児リブが非常に脆弱であり、容易に破壊することができます。肋間筋に沿って鉗子を開く（というよりも肋骨を把握する）ことで、この、静かに別々のリブを避けるために。 - 左のAURから出てくる冠状動脈（LAD）を左前下行を可視化肺静脈の後ろICLEと大心臓静脈を超えて下降。
注：この早期新生児のウィンドウでは、胸腺は、多くの場合、可視化され、心臓ベースの一部を覆うことができます。 LADは、胸部切開部の角度に応じて、胸腺の位置のそばに出現分かります。 - 左心耳（ 図1C）以下半ば心室を通って動脈の下に11-0ナイロン縫合糸（0.007ミリメートル径の針を）渡すことでLADを結紮。虚血は、縫合部位（ 図1G）以下の心筋のブランチングで確認されています。
- 8-0ナイロン縫合糸（0.15ミリメートル径の針）を使用して、胸部切開を閉じます。リブを閉じるには、2本の縫合糸を使用してください。体腔内を通過する際に肺に穴を開けていない針を確実にするために連結する前に、両方のリブ縫合糸を配置します。
- リブを閉じた後、氷床からマウスを削除します。手術領域内でマウスを維持し、無菌の外科手術への直接置き37℃で暖かい加熱パッドの上WELは、温暖化を開始します。
- 一度滅菌加熱領域に、8-0ナイロン縫合糸（0.15ミリメートル径の針）を使用して、筋肉と皮膚層を閉じます。筋層のための1の縫合糸を使用し、皮膚切開のための2本の縫合糸を使用しています。
注：筋肉及び皮膚層は、低体温の露光時間を減少させるために加温パッド上に閉じることができます。マウスの温度が一旦加熱パッド上に置い上昇し始めるが、筋肉と皮膚閉鎖時の麻酔の維持のために十分に十分に低いままです。
3.外科回復
- 自発運動の復帰まで暖かい加熱パッド上の急速な温暖化を続行します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。優しくエタノール綿棒で損傷部位を拭くことにより、ポビドンヨードと血液を削除します。
- 麻酔から十分回復した後、里親から寝具を使用してそれを塗抹、無菌の手術領域から削除し母親のケージ、そして母を促進するために子犬を返します。これは、母体の拒絶または共食いを防ぐのに役立ちます。
注：完全に回復するまで、他の動物とのケージに子犬を返さないでください。全体のごみが使用されていない、と同腹子は養母に残っている場合、ごみの途中で回収子犬を置きます。複数の手術を行う場合は、完全に自分の養母にマウスを返す前に、個々のゴミのために必要なすべての手術。 - 子犬の受け入れを確保するために3時間 - 2のために15分 - すべての10子犬に向かって養母の挙動を観察します。母親が負傷した子犬に向かって攻撃が表示された場合は、子犬を削除し、イソフルラン過剰投与により安楽死させる（> 5％を、呼吸停止まで）、断頭しました。注：集中型の痛みの反射神経が完全にこの早い年齢15で開発されていないとして、周術期の鎮痛薬は必要ありません。
4.測定心筋の梗塞サイズ4 -6時間後のMI
- 6時間 - 子犬が4の期間については、CD-1養母のケアで回復することを可能にします。母親と一緒にケージから子犬を削除し、大きなはさみで断頭続いイソフルラン過剰投与によりそれを安楽死させます。
- 解剖顕微鏡下で、心臓を切り出し、注意しない心筋をリッピングします。
- 胸部のトップに剣状突起から皮膚をカット。胸郭下の腹壁を開きます。下部胸郭をつかみ、腋窩へのダイヤフラムから左腋窩線に沿って長手方向リブ及び筋肉組織を切断。
- 横断面にはさみを持ち、慎重に左から右への横隔膜を切断。頂点への損傷を避けるために、心臓のレベルより下にハサミを配置することを確認します。
- 胸郭をつかみ、右腋窩線に沿って右肋骨の側面や筋肉組織をカット。ハサミで心臓へのすべての血管の接続を外します。つかんで胸腔から心臓を削除します本拠。
- 節の外科炭素鋼かみそりの刃を使用して3枚に心。縫合糸と心尖部の間の中間点での心臓の短軸に沿って最初のカットを行います。縫合糸（ 図3A）のレベルで第2のカットを行います。
注：これは0.0018グラムの重さは約0.75ミリメートルの厚さの頂点部分を残します。 0.0065グラム体重約1mmの厚さの中間ベース部;そして、心の底。 - 15分 - 10室温で1％塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC）で心臓切片を置きます。慎重の上に染色を避けるために標本を見て。
- コントラストを高めるために、4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒドを用いて染色した心臓切片を固定します。 ％の梗塞領域、写真心臓切片を計算し、画像化ソフトウェアの梗塞面積を測定しました。梗塞領域が白18として区画されている間生存心筋が赤に染色します。
5.測定心エコー検査後のMIによる心臓機能
- 48時間 - 仔が24の期間については、CD-1養母のケアで回復することを可能にします。密封されたイソフルラン室（5％イソフルラン）に子犬を置くことによって麻酔を誘導します。運動の停止（約30秒）までチャンバー内にマウスを保管してください。
- （麻酔維持のための）1％イソフルラン - 0.5を提供するコーンでその鼻で加熱ドック（温度37℃）に仰臥位で子犬を固定します。左胸部領域にあらかじめ温めエコーゲルを置きます。
- 左心室（LV）の傍胸骨長軸ビューを取得します。確認画像は、LV中の縫合糸のレベルより下に得られます。位置を取得した後、胸骨傍短軸像を得るために、超音波プローブ（40 MHz）で90°回転し、記録Mモード心エコー画像。
- 拡張末期を測定し、短軸Mモード画像から収縮期の左心室内径を終了します。駆出率とfractioを計算します最終短縮。
心筋梗塞サイズの24時間後のMIの6測定
- 子犬は、24時間の期間のためのCD-1養母のケアで回復することを可能にします。母親と一緒にケージから子犬を削除し、大きなはさみで断頭続いイソフルラン過剰投与によりそれを安楽死させます。
- ステップ4.2のように胸腔を開きます。心臓を切除する前に、慎重にうまくピンセットでダイアフラムの上胸部大動脈を把握します。胸壁に対して平ら、前頭面に微細なハサミを持ち、頭蓋方向にはさみを動かす後部胸壁から胸部大動脈を切りました。
- それは心臓に達するまで、胸壁から無料で大動脈および任意の他の接続を切ります。上大静脈を把握し、身体へのすべての他の血管の接続を切断することにより、心臓を切除。
- 生理食塩水で（添付大動脈との）心を洗い流します。慎重に30ゲージの針で胸部大動脈にカニューレを挿入し、ネクタイ8-0ナイロン縫合糸でカニューレにオルタ。
- 1ml /分の速度で、30ゲージの針を介して、大動脈を通る生理食塩水1mLで心臓を灌流。 1ml /分の速度で2％エバンスブルー溶液150μlで心臓を灌流。 3枚にセクション、カニューレからそれを心を削除し、セクション4で説明したようにTTCでそれを染色。
- 梗塞サイズ、写真の中心部を算出し、画像化ソフトウェアを梗塞領域を測定しました。生存心筋は、リスクの汚れの領域が赤、青に染色し、梗塞領域は白として画定されます。
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Representative Results
P1における心筋梗塞の手順は10で完了することができます - 15分および7.8％（64仔のうち5）の死亡率を持っています。手術後、マウスは次の5以内の低体温麻酔から回復 - 20分（回復の時間は、体温外科医の麻酔と速度の間に到達するに依存します）。 （非再生心筋との比較のため）P7の仔を使用する場合、冷却のより長い期間が冬眠に到達するために必要とされます。 P7仔ははるかに大きいと、より難易度26.9パーセント（52仔のうち14）の非常に高い死亡率で、その結果、心臓の損傷および低体温の両方からの回復を持っています。
以前の研究からの結果は、19（8℃と15℃の間）に近い10℃の低体温麻酔の誘導を示す、本明細書中で確認されています。この温度ウィンドウ内に、心拍数は、遅くししかし、リズムは24 BPMと11 bpmの間の速度で継続します。冷却のこのレベルの低心拍数は大幅に術中の出血を減少させます。 LADは、容易に視覚化し、これらの温度（ 図1）に連結することができます。体温が2拍または収縮不全に心拍数の低下を引き起こし、9.6℃、4.9℃の間に達するまで、LADが表示されたまま。
P1でLAD結紮後に、子犬は完全に回復し、同腹子対照と同等のボディサイズに成長します。一度自分の養母に戻され、子犬は約10分で同腹子と同等の意識と給電能力を取り戻します。組織学的検査時には3日MI後、炎症細胞浸潤と梗塞の証拠、典型的な梗塞後の応答（ 図2）があります。 7日目MI後では、左心室組織は正常表示されます。 21日目MI後、完全なCでardiac再生が発生しました。
4染色塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC） - 6時間後-MIはMIの一貫した誘導の確認として使用されました。赤い領域は生存心筋を表し、白い部分は、虚血死んだ組織を表します。 13 LAD結紮手術の合計では、心の100％が36％の平均梗塞サイズ（ 図3）と、梗塞しました。エバンスブルー灌流とTTC染色はまた、梗塞組織の持続性を実証し、リスク領域（ 図4）に基づいて、梗塞の大きさを測定するために、24時間後にMIで行いました。これらの心、生存可能な心筋の汚れ青、赤の危険性の汚れの領域、および梗塞領域では白として画定されます。梗塞サイズは、リスク領域のパーセントとして計算しました。 4 LAD結紮手術では、心臓の100％がリスク領域の49％の平均梗塞サイズ（ 図4）と、梗塞しました。
<P FOクラス= "jove_content"：梗塞誘導を確認するためにキープtogether.withinページ= "1">は、心エコー検査は、24および48時間後MIで行いました。 24時間MI後では、駆出率（EF）は大幅に74％に84％から減少した、と短縮率（FS）が有意に40％（ 図5）に50％から減少。対照では80％と比較し、対照における50％と比較してFSはまた、25％まで有意に減少したように48時間後MIにより、EFは、更に、46％まで減少しました。また、48時間（ 図6）での収縮期の左心室内径の有意な減少がありました。 LV前壁の厚さが大幅に24または48時間後にMI（ 図5および6）のいずれかで減少しませんでした。
図1.冠動脈は新生児LAD手順の間に可視である。P1新生児マウスのafター低体温麻酔、皮膚切開、第四肋間で筋肉の切開と横開胸。A）冠状動脈（LAD）を左前下行が表示されている。BD）11-0ナイロン縫合糸は半ば心室を通過する。E）LADが連結されますそれぞれ縫合部位。F）およびG）Aの倍率である）およびE）の下に観察ブランチング。 OCC。 LAD、動脈を降順に閉塞左前。 LAは、アトリウムを残しました。 LV、左心室。 GCV、偉大な冠状静脈。白矢印、LAD。黒い矢印ヘッド、照明からのグレア。スケールバーは1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
完全カーディの図2.証拠新生児マウスのLAD結紮後の交流再生。P1マウスにおけるLAD結紮後のマッソンの三重染色。梗塞領域における全体の心と倍率は、LAD結紮後3日目、7および21に示されています。筋細胞の損失および炎症細胞は、MI後（白矢印）3日目に、梗塞領域に浸潤してください。 7日目MI後から始まる完全な梗塞域再生。線維症の証拠はほとんど一日21 MI後に指摘しました。スケールバーはそれぞれ、40X、200X、お よび630X倍率200、100及び50μmである。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.新生児LAD連結は、100％再現可能です。 A）0.75ミリメートル頂点作品を作成するために、心臓全体の切片の行とTTCのための1ミリメートルミッドベース片TTCの染色。B）代表的な画像は、偽コントロールを染色し、LAD結紮し心。スケールバーは1mmである。P1新生仔マウスにおける13 LADライゲーションにおけるC）梗塞サイズ。 6時間後、MIおよびTTC染色後に測定された梗塞サイズ - ハーツ4を集めました。赤は生存心筋を示しています。白は壊死を示しています。データは、平均±SEMである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.新生児LAD連結は、信頼性の高い梗塞で結果。 P1新生仔マウスにおけるLAD結紮後の虚血領域の％としてA）梗塞サイズ（N = 4）。心臓を24時間後MI回収し、梗塞サイズは、エバンスブルーおよびTTC染色後に測定しました。ブルー生存心筋を示しています。赤は危険にさらさ領域を示しています。白は、nを示していますecrosis。データは平均値である±SEM。B）LAD結紮後のエバンスブルーおよびTTC染色LADライゲーション心の代表的な画像。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
24時間で心機能障害における図5.新生児LADライゲーションの結果は、MI後。心機能は、両方の偽手術とLADライゲーションマウスで心エコー検査。A）代表Mモード像により評価しました。拡張末期及び収縮末期を矢印で示している。B）、拡張期および収縮期の両方で短縮率、駆出率、左心室の内径の測定。データは、平均±SEMです。 N =偽それぞれ冠動脈結紮（CAL）のための8と7。 * P <0。 05. この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図48時間後-MIでの心機能障害6.新生児LADライゲーション結果。心機能は、心エコー検査によって評価した。両方の偽のための拡張末期（長い矢印）と収縮末期（短い矢印）を示すA）代表Mモード画像操作および拡張期と収縮期の両方で短縮率、駆出率、および左心室内径を含む心エコー検査によりLAD結紮したマウス。B）心臓機能の測定。データは、平均±SEMです。 N =それぞれ偽と冠動脈結紮（CAL）、4及び6。 * P <0.05、** P <0.01。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本明細書において実証外科的LAD結紮は、新生仔マウスにMIを生成するための信頼できる方法です。このモデルは、哺乳類の心臓の再生を研究すると再現性のモデルと研究者を提供します。冠動脈血管系の可視化は、正しい縫合糸の配置を確保するため、再現性を保証し、この方法の重要なコンポーネントです。成体マウスは、体温を変温能力を持たないおよび新生児マウスの代謝速度は密接に周囲温度と関連しています。さらに、新生児マウスの小さなサイズは、表面冷却による低体温の誘導のために最適です。手術とマウスの体温のタイミングは、この手順を複製する際の精度のために非常に重要であるため、注意深く監視する必要があります。できるだけ早く無気力に達した後にライゲーションは、手術の成功を確認し、心筋の結紮後の白化を可視化するための機会を提供します。
ムーがありますMIの誘導を確認するために使用することができるltiple方法。これらは、TTC染色、心エコー検査および組織学的分析が含まれます。 TTC染色は、再現性と信頼性の高い、容易に高スループットで行われ、低コストです。これらの理由から、TTC染色が広く用いられています。心エコー検査は、時間をかけて心機能MI後で非侵襲的にモニターの変更に使用することができます。 MIの決定的証拠は、組織学的分析を通じて実証することができます。本研究では、上述の技術のすべての3つは、MIの成功した誘導を確認するために使用しました。
LADの可視化が成功したMIの誘導に重要です。研究者は、難易度（深い低体温の誘導におそらく起因する）LADを可視化を経験している場合はLADの主なルートは、より遠位のセグメントより大きく、より簡単に見ることができるように、左心耳は、鉗子で少し持ち上げることができます。 LADを可視化することができない場合は、治験責任医師は、動脈LOを推定べきではありませんカチオン。この子犬は、実験的な連結のために使用すべきではないと偽のコントロールを操作としてではなく使用することができます。
4 番目の肋間スペースでの胸腔への正しいエントリは、LAD結紮のための最適な可視化と空間を獲得することが重要です。これは、肋間スペースを慎重にカウントを介して達成することができます。出血の少量が処置中に発生した場合に加えて、それは、滅菌ガーゼを用いて除去することができます。出血が有意である場合は、しかし、外科医は、おそらく十分に手順を開始する前に、マウスを冷却しておらず、さらに冷却が必要です。冷却の程度を慎重に冠動脈を可視化するために約20拍で心拍数を確保するために制御されるべきであることに注意してください。
新生仔マウスの小さなサイズのために、高解像度の心エコー検査は、心臓機能の分析のための明確なMモード画像を得るために必要とされます。最良の結果を得るために、心拍数を確保します軽い麻酔で約400 BPM（0.5から1パーセントイソフルラン吸入）および正常体温を維持（加熱ドックとエコーゲルを温めました）。本体は右肩（〜5°頭側と5°右方向）に向かってわずかに傾いている場合に画像が最良取得されます。十分なエコーゲルを確保するノイズを最小化するために適用されます。
このアプローチは、100％の再現性を提供しないが、梗塞の大きさは、個々の新生児の解剖分岐冠動脈（ 図3）によって多少変化しうる。その結果、より高いn個の数は、心臓の再生に異なる処理または遺伝子操作の影響を決定する統計的有意性に達するために必要とされ得ます。しかし、このアプローチは、MIとは全く異なることがあり怪我のこれらのメカニズムの病態生理として両方の新生児の頂点切除およびcryoinjury以上の主要な利点を保持しているため、正確に再ない場合があります存在するヒトMI 8,20。このアプローチは、より直接的に、典型的な人体を模倣し、哺乳類のMIの設定で心臓の再生を研究するために使用されてもよいです。
それは非再生（大人）との間に心臓損傷からの回復のメカニズムの違いと再生（新生）は、哺乳動物の心筋の研究を可能にするように、このモデルはユニークです。例えば、成体マウスMIモデルは、永続的な瘢痕形成をもたらします。心室破裂は、しばしば梗塞拡大の結果として生じます。このモデル（> 100手術;未発表データ）との我々の経験では、完全な再生は、21日後の梗塞および心室破裂が観察されていない明らかです。このモデルの使用から未収情報は、成人における心の再生を促進することができるメカニズムに新たな洞察を提供することがあります。
最近の証拠は、心筋細胞の増殖が心臓再生の主要な原因であることを示している9 4,21の重要な調節因子として同定されています。ここで紹介するプロトコルを使用して、さらなる研究は、心臓の再生MI後の誘導のための治療標的を指すことがあります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
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