Abstract
enfarte do miocárdio induzido por ligação da artéria coronária tem sido utilizado em muitos modelos animais como uma ferramenta para estudar os mecanismos de reparação e regeneração cardíaca, e para definir novos alvos para terapêuticas. Durante décadas, os modelos de regeneração cardíaca completa existia em anfíbios e peixes, mas uma contrapartida de mamíferos não estava disponível. A recente descoberta de uma janela pós-natal durante o qual os ratinhos possuem capacidades regenerativas levou ao estabelecimento de um modelo de mamífero de regeneração cardíaca. Um modelo cirúrgico de regeneração cardíaca mamíferos no ratinho neonatal é aqui apresentado. Resumidamente, um dia pós-natal (P1), os ratos são anestesiados com isoflurano e colocado sobre uma almofada de gelo para induzir hipotermia. Após o peito é aberto, eo descendente anterior da artéria coronária (LAD) é visualizado, a sutura é colocado ao redor do LAD para infligir isquemia miocárdica no ventrículo esquerdo. O procedimento cirúrgico leva 10-15 min. Visualizando a artéria coronária écrucial para a colocação precisa de sutura e reprodutibilidade. infarto do miocárdio e disfunção cardíaca são confirmados por cloreto de trifenil-tetrazólio (TTC) coloração e ecocardiograma, respectivamente. regeneração completa 21 dias pós-enfarte do miocárdio é verificada por meio de histologia. Este protocolo pode ser utilizado como uma ferramenta para elucidar os mecanismos de regeneração cardíaca após enfarte do miocárdio de mamífero.
Introduction
O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morte no mundo, e continua a ser responsável por cerca de um terço dos casos de insuficiência cardíaca 1. Embora o advento de intervenção percutânea e optimização contínua da utilização de trombolíticos aumentou reperfusão após MI, morte de cardiomiócitos e perda de miocárdio, no entanto, ocorre contráctil. Há também permanecem um grande número de pacientes "não-opção" que não são candidatos para ou não vêem benefício destas intervenções. Esses pacientes continuam a sofrer isquemia incapacitantes que levam à formação de cicatriz e remodelação ventricular nocivo como um mecanismo de cura do enfarte. Este processo resulta em insuficiência cardíaca, para o qual o prognóstico continua pobre apesar de tratamento farmacológico óptimo com enzimas (IECA) de conversão da angiotensina e betabloqueadores. Infelizmente, a taxa de mortalidade de um ano para pacientes com função ventricular esquerda severamente prejudicada ainda permanece comoelevado como 26% 2. transplante de coração é a opção de tratamento final para pacientes com insuficiência cardíaca. No entanto, o número limitado de dadores para o transplante cardíaco não tornar esta uma opção viável para a maioria dos pacientes. Assim, a descoberta de novos agentes terapêuticos para restaurar a miocárdio danificado permanece fundamental para a resolução do problema de doença cardíaca. modelos animais confiáveis de lesão cardíaca são, portanto, necessários como um componente crítico deste processo.
Dogma tradicional ditou que os cardiomiócitos adultos são pós-mitótico, as células terminalmente diferenciadas, incapaz de dividir ou de-diferenciação para substituir o miocárdio danificado 3. Como tal, um coração de mamífero adulto nunca poderia recuperar completamente a partir de lesões, e perda de cardiomiócitos seria substituído por tecido fibroso. Assim, a investigação tem-se centrado principalmente em agentes terapêuticos para minimizar a expansão do enfarte e reduzir a formação de cicatriz. Mais recentemente no entanto, uma mudança de paradigma ocorreuno pensamento em torno de cura cardíaco e muitos esforços de pesquisa foram redirecionadas para focar o potencial para regeneração cardíaca 4.
Até recentemente, o estudo in vivo de regeneração cardíaca foi limitado aos modelos não vertebrados, tais como aqueles em anfíbios e peixes teleósteos urodele 5-7. No entanto, a descoberta da capacidade de regeneração cardíaca no rato neonatal tem levado ao desenvolvimento de dois modelos cirúrgicos de regeneração cardíaca de mamífero: a ressecção da oclusão da artéria coronária cardíaca ápice e para induzir enfarte do miocárdio 8,9. Em 2011, um modelo de ressecção ápice do rato foi utilizado para demonstrar que a regeneração cardíaca completa é possível em um dia pós-natal (P1). No entanto, esta capacidade diminui rapidamente após o período neonatal inicial. O coração de mamíferos perde o seu potencial regenerativo logo após o nascimento em P7 como números de células progenitoras declínio e cardiomiócitos ficar binucleadas, perdemsua competência proliferativa, e permanentemente 10,11 sair do ciclo celular. Entender as diferenças fundamentais entre a neonatal e do coração de mamíferos adultos pode levar a novos insights sobre a regeneração cardíaca.
Enquanto ressecção ápice de facto oferece uma visão sobre re-crescimento do tecido contráctil, o modelo não simula o dano cardíaco humano típico, e, portanto, não se presta, assim como para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. O modelo de oclusão da artéria coronária, no entanto, simula mais diretamente os aspectos fisiopatológicos da MI patologia, e, portanto, pode fornecer insights mais úteis em mecanismos que podem ser aplicáveis ao avanço terapêutico para uso humano.
Ligadura coronária cirúrgica tem sido usada como uma técnica útil experimental em muitos modelos animais 12-14. No modelo de ligação da artéria coronária adulto, os animais são anestesiados e intubados para permitir a abertura da cavidade torácica, mantendo respiratiem. O coração continua a bater de forma regular, que permite a visualização da vasculatura coronária e permitindo a colocação de sutura precisa. Além disso, o coração permanece rosa como perfusão continua, e após a ligação do miocárdio isquémico parece pálido, indicando a ligação da artéria coronária bem sucedida. O protocolo descrito para ratos neonatais, no entanto, é menos fiável como a artéria coronária não é visualizado e o cirurgião deve estimar onde colocar o fio de sutura 15. Embora a anatomia geral da vasculatura coronária é a mesma, a variabilidade de animal individual na direcção e ramificação da LAD existe 16. Assim, quando "indo no escuro", a artéria pode ser facilmente perdida. Outras técnicas, como a ecocardiografia são, então, necessário para confirmar a indução bem-sucedida de MI e para assegurar todas as cirurgias resultam em um tamanho do infarto similar. Aqui descrito é uma melhoria em um método recentemente publicado 15, onde a posição do LAD pode ser estabecido e, assim, podem ser ligados LAD para induzir de forma reprodutível MI.
Esta técnica não requer entubação endotraqueal ou ventilação mecânica, como toracotomia em estado hipotérmico no ratinho neonatal não resulta em colapso pulmonar. No entanto, no método anteriormente descrito, a hipotermia grave deve ser induzida para o ponto de ambos apneia completa e cessação do ritmo cardíaco 15. A principal limitação desta abordagem é que a artéria coronária não é perfundido e o coração parece pálido mesmo antes LAD ligadura. Na abordagem aqui descrita, a visualização da artéria coronária é possível a um ponto de torpor antes de hipotermia profunda e cessação do ritmo cardíaco, com total recuperação do rato neonatal após a cirurgia. Este método oferece uma grande vantagem de 100% reprodutibilidade.
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Protocol
pares de reprodução de ratinhos CD-1 IG-S ratinhos C57BL / 6 e foram adquiridos a Charles River. Os animais utilizados neste estudo foram tratados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care e protocolos de estudo foram aprovados pela Subcomissão Use Animal da Universidade Ocidental, London, no Canadá.
1. Animal Care
- Depois do parto é completa e os filhotes têm sido inicialmente por sua mãe por alguns hr amamentado, colocá-los em uma gaiola diferente, com uma mãe adotiva CD-1. Mães CD-1 exibir um fenótipo mais calmo com um forte instinto de fomento, e têm uma tendência menor a canibalizar os filhotes feridos 15 anos.
2. Cirurgia
- Induzir anestesia, colocando o filhote numa câmara selada isoflurano (aproximadamente 500 ul de 100% v / v de isoflurano permitido para dissipar mais de 1.300 cm3 câmara). Mantenha o mouse na câmara até cessação do movimento (cerca de 30 segundos).
- Remover mousar a partir de câmara de isoflurano e induzir a anestesia hipotérmicos, colocando o mouse sobre gelo molhado. Para evitar queimaduras, coloque gelo dentro de uma luva cirúrgica esterilizada, enrole o rato dentro do porta-luvas e cobrir a luva com gelo ou enrole o mouse em gaze molhada estéril e colocá-lo em gelo.
NOTA: Os ratinhos arrefecer mais rapidamente quando o contacto é com gelo ao longo de um maior área de superfície, e como tal o gelo derretido pode encurtar o tempo de indução hipotermia. - Confirmar a anestesia por falta de resposta movimento aos pés e cauda pitada.
NOTA: cessação do movimento provocado ocorre a uma temperatura do corpo entre 15 ° C e 8 ° C. (Tempo de resfriamento a esta temperatura, aproximadamente, 1 min). Apneia completa e assistolia NÃO é necessária para LAD ligadura. - Mover o leito de gelo na zona cirúrgica equipado com um microscópio de operação. Certifique-se que o filhote do rato permanece no gelo durante todo o procedimento cirúrgico.
NOTA: A área cirúrgica, gaze e instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados. maintano campo estéril durante todo o procedimento, e desgaste de uso único, luvas cirúrgicas estéreis. Pomada oftálmica não é requerida como ratos nascem com os olhos fechados 17. - Coloque o filhote de rato em decúbito lateral direito. Desinfectar peito, limpando suavemente com solução de iodo-povidona seguido por um algodão embebido em etanol.
- Realizar incisão na pele no peito esquerdo ao longo da linha médio-axilar cortando pele entre o xifóide e axila esquerda alguns milímetros abaixo da pata dianteira esquerda. Também usar uma tesoura para cortar através da camada de músculo peitoral subjacente.
- Realizar uma toracotomia esquerda no 4º espaço intercostal, separando costelas e músculos intercostais com uma pinça.
NOTA: costelas neonatais são muito frágeis e podem ser facilmente quebrados. Para evitar isso, gentilmente nervuras separadas por pinças de abertura ao longo do músculo intercostal (em vez de agarrar costelas). - Visualizar a artéria descendente anterior coronariana (DAE) que emerge do aur esquerdaigo atrás da veia pulmonar e descendo além da grande veia cardíaca.
NOTA: Neste cedo janela neonatal, o timo é muitas vezes visualizada e pode cobrir parte da base cardíaca. A LAD pode ser visto emergente ao lado da posição do timo, dependendo do ângulo de incisão torácica. - Ligar o LAD pela passagem de uma sutura de nylon 11-0 (0,007 agulha mm de diâmetro) por baixo da artéria através de meados do ventrículo abaixo da aurícula esquerda (Figura 1C). A isquemia é confirmada com o branqueamento do miocárdio abaixo do local da sutura (Figura 1G).
- Fechar a incisão torácica utilizando 8-0 suturas de nylon (agulha 0,15 mm de diâmetro). Use duas suturas para fechar as costelas. Coloque as duas suturas de nervura antes ligando para assegurar que a agulha não perfurar os pulmões quando passa através da cavidade do corpo.
- Depois de fechar as costelas, remova o rato da cama de gelo. Mantenha o mouse dentro da área cirúrgica e colocá-lo diretamente na cirúrgica esterilizada parawel sobre uma almofada de aquecimento quente a 37 ° C para começar o aquecimento.
- Uma vez na área aquecida estéril, fechar as camadas musculares e da pele utilizando 8-0 suturas de nylon (agulha de diâmetro 0,15 milímetros). Use um fio de sutura para a camada muscular e usar duas suturas para a incisão na pele.
NOTA: Muscle e camadas de pele podem ser fechados em uma almofada de aquecimento para reduzir o tempo de exposição hipotermia. temperatura rato começa a subir uma vez colocado no almofada de aquecimento, mas permanece suficientemente baixa o suficiente para manutenção da anestesia durante o fechamento do músculo e pele.
3. Recuperação Cirúrgica
- Continuar o aquecimento rápido sobre uma almofada de aquecimento quente até o retorno da circulação espontânea. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Remover iodopovidona e sangue limpando suavemente sítio da lesão com cotonete de etanol.
- Após a recuperação da anestesia suficiente, remova-a estéril área cirúrgica, manchá-la com roupa de cama de Fostergaiola da mãe e filhote de retorno para promover a mãe. Isso ajuda a evitar a rejeição ou a canibalização materna.
NOTA: Não devolva os filhotes a uma gaiola com outros animais até que esteja totalmente recuperado. Se uma ninhada inteira não tem sido utilizado e ninhada permanecer com a mãe adotiva, coloque filhotes recuperados no meio do lixo. Se realizar mais de uma cirurgia, completa todas as cirurgias necessárias para uma ninhada indivíduo antes de retornar ratos para sua mãe adotiva. - Observar o comportamento da mãe adotiva para o filhote a cada 10 - 15 minutos para 2 - 3 horas para garantir a aceitação do filhote. Se a mãe apresenta agressividade para com o filhote ferido, remover o filhote de cachorro e eutanásia por overdose isoflurano (> 5%; até cessação da respiração), seguido por decapitação. NOTA: perioperatória medicamentos analgésicos não são requeridas como os reflexos da dor centralizados não estão totalmente desenvolvidos neste início de 15 anos de idade.
4. Medição da do Miocárdio Tamanho 4 -6 horas pós-MI
- Permitir que os filhotes a se recuperar no cuidado de uma mãe adotiva CD-1 por um período de 4 - 6 horas. Remover o filhote de gaiola com mãe e sacrificá-lo por overdose isoflurano seguido por decapitação com grandes tesouras.
- Extirpar o coração sob o microscópio de dissecação, cuidado para não rasgar o miocárdio.
- Cortar a pele a partir do processo xifóide ao topo do tórax. parede abdominal aberto abaixo da caixa torácica. Segure a caixa torácica inferior e cortar as costelas e musculatura longitudinalmente ao longo da linha médio-axilar esquerda do diafragma para a axila.
- Mantenha uma tesoura em plano transversal e corte cuidadosamente através do diafragma da esquerda para a direita. Certifique-se de colocar uma tesoura abaixo do nível do coração, de modo a evitar qualquer dano ao ápice.
- Segure caixa torácica e cortar o lado direito das costelas e da musculatura ao longo da linha médio-axilar direita. Remova todas as conexões vasculares para o coração com tesouras. Tiraram o coração do cavidade torácica, segurandoa base.
- Seção do coração em três pedaços usando uma lâmina de barbear de aço-carbono cirúrgico. Adicione o primeiro corte ao longo do eixo curto do coração no ponto médio entre a sutura e a ponta cardíaca. Adicione o segundo corte ao nível da sutura (Figura 3A).
NOTA: Isso deixa uma seção ápice aproximadamente 0,75 mm de espessura pesando 0,0018 g; uma seção meados de base de cerca de 1 mm de espessura, pesando 0,0065 g; e a base do coração. - Coloque as secções de coração em 1% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) à temperatura ambiente durante 10 - 15 min. observar cuidadosamente amostra para evitar o excesso de coloração.
- Para aumentar o contraste, corrigir fatias coradas coração com 4% de paraformaldeído durante a noite a 4 ° C. Para calcular% de área de infarto, seções coração fotografar e medir a área do enfarte em software de imagem. O miocárdio viável manchas vermelhas enquanto a área de enfarte é demarcada como branco de 18.
5. Medição daA função cardíaca por ecocardiografia pós-MI
- Permitir que os filhotes a se recuperar no cuidado de uma mãe adotiva CD-1 por um período de 24 - 48 h. Induzir a anestesia, colocando o filhote em uma câmara de isoflurano selada (5% de isoflurano). Mantenha o mouse na câmara até cessação do movimento (cerca de 30 segundos).
- Fixe o filhote na posição supina em um cais aquecida (temperatura 37 ° C) com o seu nariz em um cone para entregar 0,5-1% isoflurano (para manutenção da anestesia). Coloque gel de eco pré-aquecida na área torácica esquerda.
- Obter uma vista do eixo longo paresternal do ventrículo esquerdo (LV). Assegurar as imagens são obtidas abaixo do nível da sutura no VE. Depois de adquirir a posição, vire a sonda de ultrassom (40 MHz) 90 ° para obter uma visão paraesternal eixo menor, e gravar M-mode imagens ecocardiográficas.
- Medir a diastólica final e terminar diâmetros internos sistólica do ventrículo esquerdo a partir das imagens de modo M-eixo curto. Calcule fração de ejeção e fractioencurtamento nal.
6. Medição da do Miocárdio Tamanho 24 horas pós-MI
- Permitir que os filhotes a se recuperar no cuidado de uma mãe adotiva CD-1 por um período de 24 horas. Remover o filhote de gaiola com mãe e sacrificá-lo por overdose isoflurano seguido por decapitação com grandes tesouras.
- Abrir a cavidade torácica como no passo 4.2. Antes da excisão do coração, compreender cuidadosamente a aorta torácica logo acima do diafragma com uma pinça fina. Mantenha uma tesoura fina no plano coronal, plana contra a parede torácica, e cortou a aorta torácica fora da parede torácica posterior mover uma tesoura na direção cranial.
- Cortar a aorta livre de parede torácica e quaisquer outras ligações até atingir o coração. Extirpar o coração, segurando a veia cava superior e cortar todas as outras conexões vasculares para o corpo.
- Lavar o coração (com aorta em anexo) em solução salina. Cuidadosamente canular a aorta torácica com uma agulha de calibre 30 e dê umorta à cânula com 8-0 nylon fios de sutura.
- Perfundir o coração com 1 ml de solução salina através da aorta por meio de uma agulha de calibre 30 a uma taxa de 1 ml / min. Perfundir o coração com 150 ul de 2% de azul de Evans solução a uma taxa de 1 ml / min. Retire o coração da cânula, secção-lo em três pedaços e manchá-la com TTC, conforme descrito no ponto 4.
- Para calcular o tamanho do infarto, seções coração fotografar e medir a área do enfarte em software de imagem. O miocárdio viável mancha azul, a área em manchas de risco vermelho, ea área de enfarte está demarcada como branco.
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Representative Results
O procedimento de infarto do miocárdio em P1 pode ser concluído em 10 - 15 minutos e tem uma taxa de mortalidade de 7,8% (5 de 64 filhotes). Após a cirurgia, os ratos recuperar da anestesia hipotérmicos no próximo 5-20 min (tempo de recuperação depende a temperatura corporal atingiu durante a anestesia e a velocidade do cirurgião). Ao utilizar crias P7 (por comparação com uma miocárdio não-regenerativa), um longo período de arrefecimento é necessária para alcançar o torpor. crias P7 são muito maiores e têm mais dificuldade em se recuperar de ambos lesão cardíaca e hipotermia, resultando em uma taxa de mortalidade muito mais alta de 26,9% (14 de 52 filhotes).
Os resultados de estudos anteriores são aqui confirmado, indicando a indução da anestesia hipotérmica a perto de 10 ° C (entre 8 ° C e 15 ° C), 19. Dentro desta janela de temperatura, freqüência cardíaca faz lento,mas o ritmo continua a taxas entre 24 bpm e 11 bpm. A baixa taxa de coração a este nível de arrefecimento reduz significativamente o sangramento intra-operatório. A LAD pode ser facilmente visualizado e ligado a estas temperaturas (Figura 1). O LAD permanece visível até que a temperatura do corpo atingir entre 9,6 ° C e 4,9 ° C, causando diminuição da frequência cardíaca a 2 bpm ou assistolia.
Após a ligadura LAD em P1, filhotes recuperar totalmente e crescer para um tamanho de corpo comparável à dos controlos da mesma ninhada. Uma vez colocado de volta com sua mãe adotiva, filhotes recuperam suas capacidades de sensibilização e de alimentação comparáveis aos ninhada em cerca de 10 min. Após uma análise histológica de 3 dias pós-MI, não há evidência de enfarte, com infiltração de células inflamatórias, uma resposta pós-enfarte típica (Figura 2). No dia 7 pós-MI, tecido ventricular esquerda parece normal. Por volta do dia 21 de pós-MI, completo cregeneração ardiac ocorreu.
2,3,5-Trifeniltetrazólio cloreto (TTC) coloração 4-6 horas pós-MI foi usada como uma confirmação da indução consistente de MI. A área vermelha representa miocárdio viável ea área branca represente tecido morto isquêmico. Num total de 13 cirurgias de ligação LAD, a 100% dos corações eram enfartado, com uma dimensão média do enfarte de 36% (Figura 3). TTC coloração com azul de Evans perfusão também foi realizada às 24 horas pós-MI para demonstrar persistência do tecido enfartado e medir o tamanho do enfarte com base na área de risco (Figura 4). Nesses corações, miocárdio viável mancha azul, a área no manchas vermelhas de risco, ea área de enfarte é demarcada como branco. tamanho do enfarte foi calculado como uma percentagem da área de risco. Em cirurgias de ligação 4 LAD, 100% dos corações foram enfartado, com um tamanho de enfarte média de 49% da área em risco (Figura 4).
<p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "1"> Para confirmar a indução do infarto, o ecocardiograma foi realizada em 24 e 48 horas pós-MI. Às 24 horas pós-MI, fracção de ejecção (EF) foi significativamente reduzido de 84% a 74%, e de encurtamento fraccional (SF) significativamente reduzida de 50% para 40% (Figura 5). Por 48 hr pós-MI, EF foi ainda mais reduzida para 46%, quando comparado com 80% nos controlos e FS também foi significativamente reduzida para 25%, quando comparado com 50% nos controlos. Além disso, houve uma redução significativa do diâmetro interno do ventrículo esquerdo sistólica em 48 h (Figura 6). A espessura da parede anterior não foi significativamente reduzida em 24 ou 48 horas de pós-MI (Figuras 5 e 6).
Figura 1. Artéria Coronária é visível Durante Neonatal LAD Processo. P1 af neonatal do ratoTer anestesia hipotérmica, incisão na pele, incisão muscular e toracotomia lateral na quarta espaço intercostal. A) Esquerda artéria coronária descendente anterior (LAD) é visível. BD) 11-0 sutura nylon é passado através de meados do ventrículo. E) LAD é ligado e branqueamento observada abaixo do local da sutura. F) e G) são ampliações de a) e e), respectivamente. Occ. LAD, anterior esquerda ocluído artéria descendente. LA, átrio esquerdo. Lv, ventrículo esquerdo. GCV, veia coronária. seta branca, LAD. cabeça da seta Preto, o brilho da iluminação. Barras de escala são de 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A prova da completa Cardiac Regeneração Após LAD Ligadura em Ratos Neonatal. coloração Masson após LAD ligação em ratos P1. corações e ampliações inteiras nas áreas de infarto são mostrados no dia 3, 7 e 21 após a ligadura LAD. Nota perda de miócitos e infiltrado inflamatório na região do infarto no dia 3 pós-MI (seta branca). Completa regeneração zona de enfarte começando no dia 7 pós-MI. Pouca evidência de fibrose observado no dia 21 pós-MI. Barras de escala são 200, 100 e 50 mm para 40X, ampliações de 200X e 630X, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A ligadura Neonatal LAD é 100% reprodutível. A) As linhas de corte de todo o coração para criar uma peça ápice 0,75 mm e uma peça de um milímetro meados de base para TTCcoloração. B) Imagens representativas de TTC manchada controle sham e LAD ligado corações. Barras de escala são 1 mm. Tamanho C) infarto em 13 ligadura LAD em ratos neonatais P1. Corações coletadas 4-6 horas pós-MI e tamanho do infarto medido após a coloração TTC. O vermelho indica miocárdio viável; branco indica necrose. Os dados são média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Neonatal LAD Ligadura Resultados no Infarto confiável. A) Dimensão do Enfarte como% de área isquémica após ligadura LAD em ratinhos neonatais P1 (n = 4). Os corações foram recolhidas 24 horas pós-MI e tamanho do infarto foi medida após a coloração azul e TTC Evans. Azul indica miocárdio viável; vermelha indica área de risco; branca indica necrosis. Os dados são média ± SEM. B) Imagens representativas de Evans LAD coradas corações ligados azuis e TTC após ligadura LAD. Escala Bar = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Neonatal LAD Ligadura Resultados em Disfunção Cardíaca às 24 h pós-MI. A função cardíaca foi avaliada por imagens em modo-M Representante ecocardiografia. A) para ambos os ratos sham operados e LAD ligado. -Diástole e final da sístole são indicados por setas. B) Medidas de fração de encurtamento, fração de ejeção e diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole e sístole. Os dados são média ± SEM. N = 8 e 7 para sham e ligação da artéria coronária (CAL), respectivamente. * P <0. 05. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Neonatal LAD Ligadura Resultados em Disfunção Cardíaca em 48 horas pós-MI. A função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia. A) Representante M-mode imagens que mostram final da diástole (setas longas) e final da sístole (setas curtas), tanto para sham operado e LAD ligado ratos. B) medidas funcionais cardíaco pela ecocardiografia incluindo fração de encurtamento, fração de ejeção e diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole e sístole. Os dados são média ± SEM. N = 4 e 6 para sham e ligação da artéria coronária (CAL), respectivamente. * P <0,05, ** P <0,01.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A ligadura LAD cirúrgica aqui demonstrada é um método confiável para produzir MI em ratinhos neonatais. Este modelo fornece aos pesquisadores um modelo reprodutível com que para estudar a regeneração do coração dos mamíferos. Visualização da vasculatura coronária é um componente chave deste método, garantindo a colocação de sutura correta e garantindo assim a reprodutibilidade. Enquanto camundongos adultos não possuem capacidades poiquilotérmicos, a temperatura do corpo e taxa metabólica de ratos neonatal está intimamente associado à temperatura ambiente. Além disso, o pequeno tamanho de ratinhos neonatais torna-os ideais para a indução de hipotermia por arrefecimento da superfície. O momento da cirurgia e temperatura do corpo do rato são cruciais para a exatidão em replicar este procedimento e, portanto, devem ser cuidadosamente monitorizados. A ligação o mais cedo possível após o torpor é atingido proporciona a oportunidade de visualizar branqueamento do miocárdio pós-ligação, confirmando o sucesso da cirurgia.
Existem multiple métodos que podem ser utilizados para confirmar a indução mi. Estes incluem a coloração TTC, ecocardiografia e análise histológica. coloração TTC é de baixo custo, reproduzível e confiável, de fácil execução e com alta taxa de transferência. Por estas razões, a coloração TTC tem sido amplamente usado. A ecocardiografia pode ser utilizado para monitorar mudanças não invasiva na função cardíaca pós-MI ao longo do tempo. prova definitiva de MI pode ser demonstrada através de análise histológica. No presente estudo, todas as três técnicas acima foram empregues para verificar a indução bem sucedida de MI.
A visualização de LAD é crítico para a indução bem sucedida MI. Se o investigador está enfrentando dificuldade em visualizar o LAD (provavelmente devido à indução de hipotermia profunda), a aurícula esquerda pode ser levantada ligeiramente com uma pinça, como a principal raiz da LAD é maior do que os segmentos mais distais e pode ser mais facilmente visível. Se o rapaz não pode ser visualizada, o investigador não devem presumir lo artériacação. Este filhote não deve ser utilizada para a ligação experimental e pode mesmo ser utilizado como um controlo de operação simulada.
Entrada correta na cavidade torácica, no 4º espaço intercostal é importante para ganhar a visualização ideal e espaço para ligadura LAD. Isto pode ser conseguido por meio de contagem cuidadosa dos espaços intercostais. Além disso, se uma quantidade menor de sangramento ocorre durante o procedimento, ele pode ser removido com gaze estéril. Se o sangramento é significativo, no entanto, o cirurgião tem provavelmente não o rato arrefecida suficientemente antes de iniciar o procedimento, e arrefecimento adicional é necessária. Por favor, note que o grau de arrefecimento devem ser cuidadosamente controladas para garantir a frequência cardíaca em torno de 20 bpm, a fim de visualizar a artéria coronária.
Devido ao pequeno tamanho de ratinhos neonatais, ecocardiografia de alta resolução é necessária a obtenção de imagens claras em modo-M para análise da função cardíaca. Para melhores resultados, certifique-se da frequência cardíaca emcerca de 400 bpm com anestesia leve (0,5-1% isoflurano inalação) e manter a temperatura corporal normal (doca aquecido e aquecido gel eco). As imagens são melhor adquiridos se o corpo está ligeiramente inclinado em direção ao ombro direito (~ 5 ° cranial e 5 ° para a direita). Certifique-se de gel de eco suficiente é aplicada para minimizar o ruído.
Embora esta abordagem não oferecem 100% de reprodutibilidade, o tamanho do enfarte pode ser um tanto variável, dependendo da ramificação da artéria coronária anatomia do indivíduo neonato (Figura 3). Como resultado, mais elevados números de n pode ser necessária para alcançar significância estatística para determinar os efeitos de diferentes tratamentos ou manipulações genéticas em regeneração cardíaca. No entanto, esta abordagem mantém grandes vantagens sobre ambos os ressecção ápice neonatal e criolesão como a fisiopatologia destas mecanismos de lesão pode ser inteiramente diferente do MI e, assim, não pode com precisão represente humana MI 8,20. Esta abordagem imita mais directamente lesão humano típico, e podem ser usadas para estudar a regeneração cardíaca na definição de MI de mamífero.
Este modelo é único, uma vez que permite o estudo das diferenças nos mecanismos de recuperação da lesão cardíaca entre o não-regenerativa (adulto) e o regenerador (neonatal) miocárdio mamíferos. Por exemplo, o modelo de ratinho adulto MI resulta na formação de cicatriz permanente. ruptura ventricular ocorre frequentemente como resultado da expansão do infarto. Em nossa experiência com este modelo (> 100 cirurgias; dados não publicados), a regeneração completa é evidente não foi observado 21 dias pós-infarto e ruptura ventricular. As informações acumuladas de uso deste modelo podem oferecer novos insights sobre os mecanismos que podem promover a regeneração cardíaca no adulto.
Evidências recentes indicam a proliferação de cardiomiócitos é um dos principais contribuintes para a regeneração cardíaca 9 4,21 regeneração cardíaca. Mais pesquisas utilizando o protocolo aqui apresentado pode apontar para alvos terapêuticos para indução da regeneração cardíaca pós-MI.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
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