Abstract
Инфаркт миокарда, индуцированный перевязки коронарной артерии была использована во многих моделях животных в качестве инструмента для изучения механизмов сердечного восстановления и регенерации, а также определить новые цели для терапии. В течение многих десятилетий, модели полной регенерации сердца существовали у амфибий и рыб, но аналог млекопитающее не был доступен. Недавнее открытие послеродового окна, во время которого у мышей обладают регенеративные способности привело к созданию модели млекопитающих регенерации сердца. Хирургическая модель регенерации сердца млекопитающих в неонатальном мыши представлен в настоящем документе. В кратком изложении, постнатальный день 1 (P1), мышей анестезировали изофлуран и помещают на ледяную площадку, чтобы вызвать переохлаждение. После того, как грудь открыта, а левая передней нисходящей коронарной артерии (LAD) визуализируется, шовный материал помещается вокруг LAD, чтобы нанести ишемию миокарда в левом желудочке. Хирургическая процедура занимает 10-15 мин. Визуализируя коронарной артерииимеет решающее значение для точного размещения шовного и воспроизводимости. Инфаркт миокарда и сердечной дисфункции подтверждаются хлоридом трифенил-тетразолия (TTC) окрашивания и эхокардиографии, соответственно. Полное восстановление 21 дней после инфаркта миокарда подтверждается гистологии. Этот протокол может быть использован, чтобы в качестве инструмента для выяснения механизмов регенерации сердца у млекопитающих после инфаркта миокарда.
Introduction
Инфаркт миокарда (ИМ) является ведущей причиной смерти во всем мире, и остается ответственным за около одной трети случаев сердечной недостаточности 1. В то время как появление чрескожного вмешательства и непрерывной оптимизации использования тромболитиков увеличилась реперфузии следующее ИМ, смерть кардиомиоцитов и потеря сократительной миокарда, тем не менее происходит. Там также остаются большое количество "не-опция" пациентов, которые не являются кандидатами на или не видят пользы от этих мер. Эти пациенты продолжают испытывать инвалидизирующих ишемию, приводящие к образованию шрам и пагубное желудочков ремоделирования как механизм исцеления инфаркта. Этот процесс в конечном итоге приводит к сердечной недостаточности, для которых прогноз остается низкой, несмотря на оптимальную фармакологического управления с ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) и бета-блокаторы. К сожалению, уровень смертности один год для пациентов с тяжелыми нарушениями функции левого желудочка по-прежнему остаетсявыше , чем 26% 2. По пересадке сердца является окончательным вариантом лечения для пациентов с сердечной недостаточностью. Однако ограниченный пул доноров для трансплантации сердца не делает это жизнеспособным вариантом для большинства пациентов. Таким образом, открытие новых терапевтических агентов для восстановления поврежденного миокарда остается первостепенное значение для решения проблемы сердечно-сосудистые заболевания. Надежные модели на животных сердечной травмы, следовательно, требуется в качестве важного компонента этого процесса.
Традиционная догма диктовали , что взрослые кардиомиоциты постмитотическими, терминально дифференцированных клеток, неспособны к делению или де-дифференциации , чтобы заменить поврежденный миокард 3. Таким образом, взрослый сердце млекопитающих никогда не сможет полностью оправиться от травмы, и потерянные кардиомиоциты будут заменены фиброзной тканью. Таким образом, исследование сосредоточилось главным образом на терапевтических агентов с целью свести к минимуму расширение зоны инфаркта и уменьшить образование рубцов. Однако последнее время, смена парадигмы произошлов мышлении окружающего сердца исцеление и многие исследовательские усилия были перенаправлены , чтобы сосредоточиться на потенциал регенерации сердца 4.
До недавнего времени исследования в естественных условиях регенерации сердца был ограничен не-позвоночных животных моделей, таких , как те , в urodele амфибий и костистых рыб 5-7. Тем не менее, открытие способности к регенерации сердца в неонатальном мыши привело к разработке двух хирургических моделей регенерации сердца млекопитающих: резекция верхушки корня и коронарной окклюзии артерии сердца , чтобы вызвать инфаркт миокарда 8,9. В 2011 году модель мыши апекс резекция была использована, чтобы продемонстрировать, что полная регенерация сердца возможна в постнатальный день 1 (P1). Тем не менее, эта способность быстро снижается после того, как начальный неонатальном периоде. Сердце млекопитающих теряет свой регенеративный потенциал вскоре после рождения в Р7 как числа клеток-предшественников упадка, и кардиомиоцитов становятся двуядерных, теряютих пролиферативная компетентность, и постоянно выходить из 10,11 клеточного цикла. Понимание основных различий между неонатальной и взрослого сердца млекопитающих может привести к новым проникновения в регенерации сердца.
В то время как апекс резекция действительно дает представление о отрастает сократительной ткани, модель не моделирует типичную сердечную травму человека, и, таким образом, не поддается, а также к разработке терапевтических средств. Модель окклюзии коронарной артерии, тем не менее, более непосредственно моделирует патофизиологических аспекты МИ патологии, и, таким образом, может обеспечить более полезную информацию о механизмах, которые могут быть применимы к терапевтическому продвижению для человека.
Хирургический коронарный лигирование использовалась в качестве полезной экспериментальной техники во многих животных моделях 12-14. Во взрослом модели лигирования коронарной артерии, животных анестезируют и интубацию, чтобы отверстие полости грудной клетки при сохранении respiratiна. Сердце продолжает регулярно бить, позволяя визуализацию коронарных сосудов и позволяет для точного размещения шва. Кроме того, сердце остается розовым, как перфузия продолжается, и после перевязки ишемический миокард выглядит бледным, что указывает на успешную перевязки коронарной артерии. Протокол , описанный для новорожденных мышей, однако, является менее надежным коронарной артерии не визуализируется и хирург должен оценить , где поместить шов 15. Хотя общая анатомия коронарных сосудов является такой же, индивидуальная изменчивость животного в направлении и разветвленность ЛАД существует 16. Таким образом, когда "происходит в слепую," артерия может быть легко пропустить. Другие методы, такие как эхокардиографии затем требуется для подтверждения успешного индукции инфаркта миокарда, а также гарантировать, что все операции приводят к подобным размера инфаркта. Описанная здесь улучшение по недавно опубликованным методом 15, где положение ЛАД может быть Estabваны, таким образом ЛАД может быть лигированы с воспроизводимым вызвать инфаркт миокарда.
Этот метод не требует интубации трахеи или механической вентиляции, как торакотомии в Гипотермическую состоянии в неонатальном мыши не приводит к коллапсу легкого. Тем не менее, в описанном выше способе, тяжелой гипотермии должны быть индуцированы к точке как в полной одышки и прекращения сердечного ритма 15. Основным недостатком такого подхода является то, что коронарной артерии больше не озарен, а сердце выглядит бледным еще до ЛАД перевязки. В подходе, описанном в настоящем документе, визуализации коронарной артерии возможно в точке оцепенения до глубокой гипотермии и сердечного ритма прекращения, с полным восстановлением новорожденных мышей после операции. Этот метод дает значительное преимущество 100% воспроизводимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Размножающихся пар CD-1 мышей IG-S C57BL / 6 и были приобретены у Charles River. Животные, используемые в данном исследовании, были обработаны в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными, а также протоколы исследования были одобрены животных использования подкомитетом в Западном Университете, Лондон, Канада.
1. Уход за животными
- После родов, является полной и щенками, были первоначально грудном вскармливании их матерью в течение нескольких часов, поместите их в другую клетку с приемной матерью CD-1. CD-1 матерей показывать более спокойное фенотип с сильным инстинктом , поощряющих и имеют более низкую склонность к пожирать травмированных щенков 15.
2. хирургия
- Индуцировать анестезию путем размещения детеныша в герметичном изофлурановым камере (приблизительно 500 мкл 100% об / об изофлуран позволили рассеивать более 1300 см 3 камеры). Держите мышь в камере до прекращения движения (около 30 сек).
- Удалить моиспользовать из изофлуран камеры и вызвать Гипотермическое анестезии путем размещения мыши на мокром льду. Чтобы избежать обморожения, поместите лед внутри стерильной хирургической перчатки, оберните мышь в перчатку и покрывают перчатку со льдом или обернуть мышь в стерильной влажной марлей и поместить его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши охладиться быстрее при контакте со льдом находится на большей площади поверхности, и в этом качестве растаявшего льда может привести к сокращению гипотермии индукции время. - Подтвердите анестезию отсутствием реакции движения до ног и хвоста крайнем случае.
Примечание: Прекращение спровоцированного движения происходит при температуре тела от 15 ° С до 8 ° С. (Время охлаждения до этой температуры приблизительно 1 мин). Полная остановка дыхания и асистолия не требуется для ЛАД перевязки. - Перемещение ледяную кровать в хирургической области, оборудованного операционного микроскопа. Убедитесь в том, что щенок мыши остается на льду в течение всей хирургической процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: хирургическая область, марля и хирургические инструменты должны быть стерилизованы. Maintaв стерильной зоне в течение всей процедуры, и износа одноразового использования, стерильные хирургические перчатки. Глазные мази не требуется , поскольку мыши рождаются с закрытыми глазами 17. - Поместите щенка мыши в правой боковой позиции пролежни. Лечить грудь, осторожно протирая повидон-йода раствором с последующим тампоном этанолом.
- Выполните разрез кожи на левой стороне груди вдоль средней подмышечной линии путем разрезания кожи между xyphoid и левой подмышечной на несколько миллиметров ниже левой лапе. Кроме того, используйте ножницы, чтобы вырезать через основной слой грудные мышцы.
- Выполните левый торакотомии в 4 - м межреберье, отделяя ребра и межреберные мышцы с помощью щипцов.
Примечание: Новорожденных ребра очень хрупкие и легко ломаются. Чтобы избежать этого, мягко отдельные ребра, открыв щипцов вдоль межреберной мышцы (а не хватать ребра). - Визуализируйте левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD), выходящих из левого ОЗМicle за легочной вены и нисходящих за большой сердечной вены.
Примечание: В этом раннем неонатальном окне, тимус часто визуализируется и может включать в себя часть сердечной базы. ЛАД можно увидеть возникающие рядом с положением тимусе, в зависимости от угла торакальной разреза. - Перевязывать ЛАД путем пропускания 11-0 нейлоновой нити (0,007 мм диаметр иглы) ниже артерии , проходящей через среднюю желудочке ниже левого предсердия (рис 1C). Ишемия подтверждено побледнение миокарда ниже шовного сайта (рис 1G).
- Закройте торакальный разрез с использованием 8-0 нейлоновых швов (0,15 мм диаметр иглы). Используйте два наложения швов, чтобы закрыть ребра. Поместите оба ребра швов перед тем лигирования, чтобы гарантировать, что игла не прокол в легкие при прохождении через полость тела.
- После закрытия ребра, удалите мышь из ледяной кровати. Держите мышь в хирургической области и поместите его непосредственно на стерильный хирургический длявэй над теплым грелку при 37 ° C, чтобы начать нагревание.
- После того, как на стерильном отапливаемой площади, закройте мышечные и кожные слои с использованием 8-0 нейлоновых швов (0,15 мм диаметр иглы). Используйте один шовный материал для мышечного слоя и использовать два швами для разреза кожи.
Примечание: Мышцы и слои кожи могут быть закрыты на грелку, чтобы уменьшить гипотермии время экспозиции. Температура мыши начинает повышаться после размещения на грелку, но остается достаточно низкими для поддержания анестезии во время мышц и кожи закрытия.
3. Хирургическое восстановление
- Продолжайте быстрое потепление на теплую грелку до возвращения спонтанного движения. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Удалить повидон-йод и кровь, аккуратно протерев место повреждения этанолом тампоном.
- После достаточного восстановления после анестезии, удалите его из стерильной хирургической области, мазок с подстилкой из приемныхклетка матери, и возвращение щенку приемной матери. Это помогает предотвратить материнскую отторжение или раскулачивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не возвращать щенков в клетку с другими животными, пока полностью не выздоровел. Если весь мусор не был использован, и Однопометники остаются с приемной матерью, место оправился щенков в середине помета. При выполнении более одной операции, выполнять все операции, необходимые для индивидуального подстилке перед возвращением мышей в их приемной матери. - Наблюдайте поведение приемной матери к щенку каждые 10 - 15 мин в течение 2 - 3 ч, чтобы обеспечить принятие детеныша. Если мать показывает агрессию к травмированной детеныша, удалите детеныша и эвтаназии путем передозировки изофлуран (> 5%, до остановки дыхания), не следуют обезглавливание. ПРИМЕЧАНИЕ: Периоперационная обезболивание лекарства не требуются , как централизованные болевые рефлексы не полностью развиты в этом раннем возрасте 15 лет.
4. Измерение инфаркте миокарда Размер 4 -6 часов после инфаркта миокарда
- Разрешить щенками восстановить в уходе за приемной матери CD-1 в течение 4 - 6 часов. Извлеките щенка из клетки с матерью и усыпить его изофлуран передозировки следуют обезглавливание с большими ножницами.
- Вырежьте сердце под рассекает микроскопом, стараясь не отрываться миокард.
- Порезать кожу от мечевидный отросток в верхней части грудной клетки. Открыть брюшной стенки ниже грудной клетки. Возьмитесь за нижнюю грудную клетку и прорезать ребрами и мускулатуре в продольном направлении вдоль левой средней подмышечной линии от диафрагмы до подмышки.
- Держите ножницы в поперечной плоскости и аккуратно прорезать диафрагмы слева правой стороны. Убедитесь в том, чтобы поместить ножницы ниже уровня сердца, чтобы избежать каких-либо повреждений на вершине.
- Возьмитесь грудную клетку и разрезают правую сторону ребер и мускулатуру вдоль правой средней подмышечной линии. Удалить все сосудистые подключения к сердцу с помощью ножниц. Удалите сердце из грудной полости, схватываябаза.
- Раздел сердце на три части с помощью хирургической углеродистой стали лезвие бритвы. Сделайте первый разрез вдоль короткой оси сердца в средней точке между швом и верхушки сердца. Сделать второй разрез на уровне шовной (фиг.3А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставляет апекс участок толщиной приблизительно 0,75 мм весом 0,0018 г; среднего базовой секции толщиной около 1 мм, весом 0,0065 г; и основание сердца. - Поместите участки сердца в 1% 2,3,5-трифенилтетразолинхлорида (TTC) при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин. Внимательно следите образец, чтобы избежать чрезмерного окрашивания.
- Чтобы увеличить контрастность, исправить окрашенные срезы сердца с 4% параформальдегид в течение ночи при 4 ° С. Для расчета% площади инфаркта, участки сердца их фотографии и измерить площадь инфаркта на ПО для обработки изображений. Жизнеспособный миокард пятна красного , а площадь инфаркта разграничены как белый 18.
5. ИзмерениеФункции сердца с помощью эхокардиографии после инфаркта миокарда
- Разрешить щенками восстановить в уходе за приемной матери CD-1 в течение 24 - 48 часов. Побудить анестезии, помещая щенка в герметичном изофлуран камере (5% изофлуран). Держите мышь в камере до прекращения движения (около 30 сек).
- Закрепите детеныша в положении лежа на спине на обогреваемой доке (температура 37 ° C) с его носом в конусе поставить 0,5 - 1% изофлуран (для поддержания анестезии). Поместите предварительно нагретый эхо гель на левой грудной области.
- Получить парастернальной вид длинномерной левого желудочка (ЛЖ). Убедитесь, что снимки получаются ниже уровня шовного материала в ЛЖ. После приобретения позиции, включите ультразвуковой датчик (40 МГц) 90 ° для получения парастернальной вид короткой оси, и запись M-режим эхокардиографии изображения.
- Измерьте конечного диастолического и конечного систолического левого желудочка внутренние диаметры от короткой оси изображений M-режиме. Расчет фракции выброса и fractioNAL укорочение.
6. Измерение инфаркте миокарда Размер 24 часов после инфаркта миокарда
- Разрешить щенками восстановить в уходе за приемной матери CD-1 в течение 24 часов. Извлеките щенка из клетки с матерью и усыпить его изофлуран передозировки следуют обезглавливание с большими ножницами.
- Откройте грудной полости, как в шаге 4.2. Перед вырезанием сердца, тщательно понять грудная аорта чуть выше диафрагмы с тонким пинцетом. Держите тонких ножниц в корональной плоскости, плоские по отношению к грудной стенке, и отрежьте грудная аорта выключения задней грудной стенки, движущейся ножницами в краниальном направлении.
- Вырезать аорту свободный от грудной стенки и любых других соединений, пока он не достигнет сердца. Вырежьте сердце, захватывая верхней полой вены и резать все другие сосудистые соединения с телом.
- Ополосните сердце (с аортой прилагается) в физиологическом растворе. Тщательно иглу грудного отдела аорты с 30 калибра иглы и завяжитеорта к канюлю с 8-0 нейлоновой шовная нить.
- Заливать сердца с 1 мл физиологического раствора через аорту через 30 иглы калибра со скоростью 1 мл / мин. Заливать сердца с 150 мкл 2% -ного раствора синего Эванса со скоростью 1 мл / мин. Удалите сердце из канюли, раздел его на три части и окрашивает ее с ТТС, как описано в разделе 4.
- Для расчета размера инфаркта, участки сердца их фотографии и измерить площадь инфаркта на ПО для обработки изображений. Жизнеспособный миокард окрашивает синий, область на пятна риска красный, а площадь инфаркта разграничены, как белый.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инфаркт миокарда процедура в P1 может быть завершена в 10 - 15 мин и имеет коэффициент смертности составил 7,8% (5 из 64 щенков). После операции у мышей оправиться от гипотермии анестезии в течение ближайших 5 - 20 мин (время восстановления зависит от температуры тела, достигнутой во время анестезии и скорости хирурга). При использовании P7 бельков (для сравнения с нерегенеративной миокарда), длительный период охлаждения требуется для достижения оцепенение. P7 щенков гораздо больше и труднее восстанавливается как от сердечной травмы и переохлаждение, что приводит к значительно более высокой смертности на 26,9% (14 из 52 щенков).
Результаты предыдущих исследований подтверждены в настоящем документе, что свидетельствует о индукции гипотермии анестезии при около 10 ° C (от 8 ° С до 15 ° С) 19. В этом окне температура, частота сердечных сокращений делает медленно,но ритм продолжается на скоростях от 24 ударов в минуту и 11 ударов в минуту. Низкая частота сердечных сокращений на этом уровне охлаждения значительно снижает интраоперационную кровотечение. ЛАД можно легко визуализировать и лигировали при этих температурах (рисунок 1). ЛАД остается видимым , пока температура тела не достигают между 9,6 ° С до 4,9 ° С, что приводит к снижению частоты сердечных сокращений до 2 ударов в минуту или асистолии.
После ЛАД перевязки в P1, щенками полностью восстановиться и расти до размера тела, сравнимого с контрольной однопометница. После размещения их обратно с приемной матерью, щенками восстановить осведомленности и кормления животных, возможности, сравнимые с однопометные примерно 10 мин. При гистологическом исследовании 3 дня после инфаркта миокарда, есть свидетельства миокарда, при инфильтрации воспалительных клеток, типичный ответ после инфаркта (рисунок 2). На 7-й день после инфаркта миокарда левого желудочка ткани кажется нормальной. К 21-й день после инфаркта миокарда, в комплекте сardiac регенерации произошло.
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТС) окрашивания 4 - 6 ч после инфаркта миокарда был использован в качестве подтверждения последовательной индукции инфаркта миокарда. Красная область представляет собой жизнеспособный миокард и белая область представляет собой ишемическую мертвой ткани. В общей сложности 13 LAD лигирования операций, 100% сердец были инфаркту, со средним размером инфаркта на 36% (рисунок 3). TTC окрашивания Эванс голубым перфузией также была проведена в течение 24 часов после инфаркта миокарда , чтобы продемонстрировать сохранение инфарктом ткани и измерить размер инфаркта , основанный на зоны риска (рисунок 4). В этих сердцах, жизнеспособного миокард пятна синий, зоны риска пятен красного, а площадь инфаркта разграничены, как белый. Размер инфаркта был рассчитан как процент от зоны риска. В 4 - лигирования операций LAD, 100% сердец были инфаркту, со средним размером с инфарктом 49% зоны риска (рисунок 4).
<р класс = "jove_content" ВОК: Keep-together.within-страницу = "1"> Для подтверждения индукции инфаркта, эхокардиографию проводили при 24 и 48 ч после инфаркта миокарда. Через 24 ч после инфаркта миокарда, фракция выброса (ФВ) была значительно снижена с 84% до 74%, а фракционное укорочение (FS) значительно снижена с 50% до 40% (рисунок 5). К 48 ч после инфаркта миокарда, ФВ дополнительно снижается до 46%, по сравнению с 80% в контрольной группе и ФС также значительно снижена до 25%, по сравнению с 50% в контрольной группе. Кроме того, произошло значительное снижение систолического левого желудочка с внутренним диаметром в 48 часов (рисунок 6). LV толщина передней стенки не было значительно снижено на 24 или 48 ч после инфаркта миокарда (5 и 6).
Рисунок 1. Ишемическая видна во время процедуры неонатальной ЛАД. P1 неонатальной аф мышитер гипотермический анестезии, надрез кожи, мышц и надрез боковой торакотомии в четвертом межреберье. A) левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) видна. BD) 11-0 нейлон шовный материал проходит через середину желудочка. E) ЛАД лигируется и бланширование наблюдается ниже места наложения швов. F) и G) являются увеличениях а) и Е) соответственно. ОКК. ЛАД, окклюзия левой передней нисходящей артерии. LA, левое предсердие. LV, левый желудочек. GCV, большой коронарной вены. Белая стрелка, ЛАД. Черная голова стрелка, блики от освещения. Шкала баров 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Доказательства Complete КардиРегенерация переменного тока После ЛАД Лигирование в неонатальных мышей. трехцветный Массона окрашивание после ЛАД перевязки у мышей P1. Целые сердца и увеличениях в областях миокарда показаны на 3-й день, 7 и 21 после ЛАД перевязки. Обратите внимание, потерю миоцитов и воспалительных клеток инфильтрата в области инфаркта на 3-й день после инфаркта миокарда (белая стрелка). Полное восстановление зоны инфаркта, начиная с 7-й день после инфаркта миокарда. Мало доказательств фиброза было отмечено на 21-й день после инфаркта миокарда. Шкала баров 200, 100 и 50 мкм для 40X, 200X и 630X увеличениях, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Новорожденных ЛАД Лигирование воспроизводимо на 100%. A) Линии секционирования всего сердца , чтобы создать 0,75 мм апекс часть и 1 мм в середине базовая часть для TTCокрашивание. B) Типичные изображения TTC окрашенных контроля мнимого и LAD лигируют сердца. Шкала баров 1 мм. Размер C) Инфаркт в 13 LAD перевязку в P1 неонатальных мышей. Сердца собрали 4 - 6 ч после инфаркта миокарда и размер инфаркта, измеренный после окрашивания ТТС. Красный цвет указывает на жизнеспособный миокард; белый указывает на некроз. Данные представляют собой среднее значение ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Новорожденных ЛАД Лигирование Результаты в надежных инфарктом. А) размер Инфаркт в% от ишемической области после того, как LAD лигирования в P1 неонатального мышей (п = 4). Сердца были собраны 24 ч после инфаркта миокарда и размер инфаркта измеряли после Эванса синего и TTC окрашивания. Синий цвет обозначает жизнеспособный миокард; красный цвет указывает зону риска; Белый цвет означает пecrosis. Данные представляют собой среднее ± SEM. B) Типичные изображения синего Эванса и TTC окрашенных LAD лигируют сердца после ЛАД перевязки. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Результаты неонатальной ЛАД Лигационные в сердечной дисфункции в 24 ч после инфаркта миокарда. Сердечной функции оценивали представитель M-режиме изображений эхокардиографии. A) для обоих ложнооперированных и LAD лигируют мышей. Конце диастолы и конец систолы обозначены стрелками. Б) Измерения фракции укорочения, фракции выброса и левого желудочка внутреннего диаметра на обоих диастолы и систолы. Данные представляют собой среднее ± SEM. N = 8 и 7 для Sham и лигирования коронарной артерии (CAL) соответственно. * P <0. 05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Результаты неонатальной ЛАД Лигационные в сердечной дисфункции в 48 часов после инфаркта миокарда. Сердечной функции оценивалась по эхокардиографии. А) представитель М-режим изображения , показывающие конце диастолы (длинные стрелки) и положить конец систолы (короткие стрелки) для обоих притворство управлением и LAD лигируют мышей. B) функциональные измерения Сердечные по эхокардиографии , включая фракции укорочения, фракция выброса и левого желудочка внутреннего диаметра на обоих диастолы и систолы. Данные представляют собой среднее ± SEM. N = 4 и 6 для Sham и лигирования коронарной артерии (CAL), соответственно. * Р <0,05, ** Р <0,01.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хирургический ЛАД лигирование показано здесь является надежным методом для получения ИМ у новорожденных мышей. Эта модель предоставляет исследователям воспроизводимой модели, с которой для изучения млекопитающих регенерации сердца. Визуализация коронарных артерий является ключевым компонентом этого метода, обеспечивая правильное расположение шва и, таким образом, гарантируя воспроизводимость. В то время как взрослые мыши не обладают холоднокровных возможностями, температура тела и обмен веществ у новорожденных мышей тесно связана с температурой окружающей среды. Кроме того, небольшой размер у новорожденных мышей делает их идеальными для гипотермии индукции охлаждения поверхности. Время проведения операции и температуры тела мыши имеют решающее значение для точности репликации этой процедуры, и, таким образом, необходимо тщательно контролировать. Лигирование как можно скорее после того, как вялость достигается дает возможность визуализировать побледнение миокарда после перевязки, подтверждая успех хирургического.
Есть муltiple методы, которые могут быть использованы для подтверждения MI индукции. К ним относятся TTC окрашивания, эхокардиографию и гистологический анализ. ТТС окрашивания является низкая стоимость, воспроизводимым и надежным и легко выполняется с высокой пропускной способностью. По этим причинам, ТТС окрашивание широко используется. Эхокардиографии могут быть использованы для неинвазивного изменений монитора в сердечной функции после инфаркта миокарда в течение долгого времени. Окончательное доказательство инфаркта миокарда может быть продемонстрирована с помощью гистологического анализа. В настоящем исследовании, все три из указанных выше методик были использованы для проверки успешной индукции инфаркта миокарда.
Визуализация ЛАД имеет решающее значение для успешной индукции ИМ. Если исследователь испытывает трудности с визуализацией отрока (вероятно, из-за глубокой гипотермии индукции), левое предсердие может быть слегка приподнимается пинцетом, как главный корень ЛАД больше, чем более дистальных сегментов и могут быть более легко видеть. Если отрок не может быть визуализированы, следователь не должен предполагать, ло артериикатион. Этот щенок не следует использовать для экспериментальной перевязке и может быть использован скорее как ложнооперированных контроль.
Правильный вход в грудной полости в 4 - м межреберье важно , чтобы получить оптимальную визуализацию и пространство для ЛАД перевязки. Это может быть достигнуто за счет тщательного подсчета межреберья. Кроме того, если небольшое количество кровотечение происходит во время процедуры, она может быть удалена с стерильную марлю. Если кровотечение является значительным, однако, хирург, скорее всего, не охлаждаются мышь достаточно перед началом процедуры, и требуется дополнительное охлаждение. Пожалуйста, обратите внимание, что степень охлаждения следует тщательно контролировать, чтобы обеспечить частоту сердечных сокращений около 20 ударов в минуту для визуализации коронарной артерии.
Из-за небольшого размера у новорожденных мышей, требуется высокое разрешение эхокардиографию, чтобы получить четкое изображение М-режим для анализа сердечной функции. Для достижения наилучших результатов убедитесь, что частота сердечных сокращенийоколо 400 ударов в минуту с легкой анестезией (0,5 - 1% изофлуран ингаляции) и поддерживать нормальную температуру тела (с подогревом док-станцией и прогреты эхо гель). Изображения лучше всего приобретены , если тело слегка наклонена в сторону правого плеча (~ 5 ° краниально и 5 ° вправо). Обеспечить достаточное количество геля эхо применяется для снижения уровня шума.
Хотя такой подход делает предложение 100% воспроизводимости, размер инфаркта может быть несколько изменяться в зависимости от коронарной артерии разветвлений анатомию индивидуального новорожденному (рисунок 3). В результате, более высокие п числа могут потребоваться для достижения статистической значимости при определении влияния различных методов лечения или генетических манипуляций на регенерации сердца. Тем не менее, этот подход имеет серьезные преимущества по сравнению с обеих неонатальной апекс резекции и криоповреждений как патофизиологии этих механизмов повреждения могут быть совершенно отличным от инфаркта миокарда и, таким образом, не может точно выполнить повторноеНастоящий человек М.И. 8,20. Такой подход более непосредственно имитирует типичные травмы человека, и может быть использован для изучения регенерации сердца при установлении инфаркта миокарда у млекопитающих.
Эта модель уникальна, поскольку она позволяет для изучения различий в механизмах восстановления от сердечной травмы между нерегенеративной (для взрослых) и регенеративная (неонатальный) миокард млекопитающих. Например, у взрослых мышей МИ модели приводит к образованию постоянных рубцов. Желудочковая разрыв часто возникает в результате расширения зоны инфаркта. В нашем опыте с этой моделью (> 100 операций; неопубликованные данные), полная регенерация очевидно не наблюдалось 21 дней после инфаркта и разрыв желудочка. Информация, получаемые от использования этой модели могут предложить новые идеи в механизмы, которые могут способствовать регенерации сердца у взрослого человека.
Последние данные свидетельствуют о пролиферации кардиомиоцитов является основным фактором регенерации сердца 9 4,21 регенерации. Дальнейшие исследования с использованием протокола, представленный здесь, может указывать на терапевтические мишени для индукции регенерации сердца после инфаркта миокарда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
