Abstract
Hjärtinfarkt inducerad av kransartärligering har använts i många djurmodeller som ett verktyg för att studera mekanismerna för hjärt reparation och förnyelse, och att definiera nya mål för läkemedel. Under årtionden, modeller av total hjärta förnyelse fanns i amfibier och fiskar, men en däggdjurs motsvarighet var inte tillgänglig. Den senaste upptäckten av en postnatal fönster under vilket möss har regenerativa kapacitet har lett till inrättandet av en däggdjursmodell av hjärt förnyelse. En kirurgisk modell av däggdjur hjärt förnyelse i neonatal mus presenteras häri. I korthet är postnatal dag 1 (P1) möss bedövades genom isofluran och placerades på en is pad för att inducera hypotermi. Efter det att bröstkorgen öppnas, och den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD) visualiseras, är en sutur placeras runt LAD att orsaka myokardischemi i den vänstra ventrikeln. Det kirurgiska ingreppet tar 10-15 min. Visualisera kransartären äravgörande för noggrann sutur placering och reproducerbarhet. Hjärtinfarkt och hjärtdysfunktion bekräftas av trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) färgning och ekokardiografi, respektive. Fullständig regenerering 21 dagar efter hjärtinfarkt verifieras genom histologi. Detta protokoll kan användas för att som ett verktyg för att klarlägga mekanismerna för däggdjur hjärt regeneration efter hjärtinfarkt.
Introduction
Hjärtinfarkt (MI) är en ledande dödsorsaken i världen, och förblir ansvarig för omkring en tredjedel av hjärtsvikt fall 1. Medan tillkomsten av perkutan intervention och kontinuerlig optimering av användningen av trombolytika har ökat reperfusion efter Ml, cardiomyocyte död och förlust av kontraktila hjärtmuskeln ändå sker. Det finns också fortfarande ett stort antal "no-alternativ" patienter som inte är kandidater för eller inte ser nytta av dessa åtgärder. Dessa patienter fortsätter att uppleva handikapp ischemi leder till ärrbildning och skadlig kammar ombyggnad som en mekanism för infarkt healing. Denna process resulterar i slutändan i hjärtsvikt, där prognosen är fortfarande dålig, trots optimal farmakologisk hantering med angiotensin-converting enzyme (ACE) hämmare och betablockerare. Tyvärr förblir ettårsdödligheten för patienter med kraftigt nedsatt vänsterkammarfunktion fortfarande likahög som 26% 2. Hjärttransplantation är den sista behandlingsalternativ för patienter med hjärtsvikt. Men den begränsade donatorpoolen för hjärttransplantation inte göra detta ett hållbart alternativ för de flesta patienter. Således, upptäckten av nya terapeutiska medel för att återställa den skadade hjärtmuskeln förblir ytterst viktigt att lösa hjärtsjukdom orsakad sjukdom. Tillförlitliga djurmodeller av hjärtskada Därför krävs som en viktig komponent i denna process.
Traditionella dogm har dikterat att vuxna cardiomyocytes är post-mitotiska, terminalt differentierade celler, oförmögna att dela eller de-differentiering för att ersätta den skadade hjärtmuskeln 3. Som sådan, kan en vuxen hjärta däggdjur aldrig helt återhämta sig från skador, och förlorade kardiomyocyter skulle ersättas med fibrös vävnad. Således har forskningen främst inriktad på terapeutiska medel för att minimera infarkt expansion och minska ärrbildning. På senare tid har dock ett paradigmskifte inträffati tänkandet kring hjärt läkning och många forskningsinsatser har omdirigerats att fokusera på risken för hjärt regenere 4.
Tills nyligen var in vivo-studie av hjärt förnyelse begränsad till ryggradslösa modeller, såsom de i urodele amfibier och teleost fisk 5-7. Emellertid har upptäckten av kapaciteten för hjärt förnyelse i neonatal mus ledde till utvecklingen av två kirurgiska modeller av däggdjurs hjärt förnyelse: resektion av hjärt spetsen och kranskärls ocklusion för att inducera hjärtinfarkt 8,9. Under 2011 genomfördes en mus spets resektion modell som används för att visa att hela hjärtregenerering är möjlig postnatal dag 1 (P1). Emellertid avböjer denna kapacitet snabbt efter den inledande neonatalperioden. Däggdjurs hjärta förlorar sin regenerativ potential strax efter födseln på P7 som nummer progenitorceller nedgång, och kardiomyocyter blir binucleated, förlorarderas proliferativa kompetens och permanent avsluta cellcykeln 10,11. Att förstå de grundläggande skillnaderna mellan den neonatala och vuxna hjärta däggdjur kan leda till nya insikter i hjärt förnyelse.
Medan spetsen resektion erbjuder verkligen en inblick i återväxt av kontraktil vävnad blir modellen inte simulera typiska mänskliga hjärtskada, och därför inte lämpar sig såväl för utvecklingen av läkemedel. Kransartären ocklusion modell, dock simulerar mer direkt de patofysiologiska aspekter av MI patologi, och därmed kan ge mer användbara insikter i mekanismer som kan vara tillämpliga på terapeutiska framsteg för humant bruk.
Kirurgisk koronarligation har använts som en användbar experimentell teknik i många djurmodeller 12-14. I vuxen kransartärligering modell djuren bedövas och intuberades för att kunna öppna brösthålan bibehållen respiratipå. Hjärtat fortsätter att slå regelbundet, vilket möjliggör visualisering av kranskärlen och möjliggör noggrann sutur placering. Dessutom förblir hjärt rosa som perfusion fortsätter och efter ligering den ischemiska hjärtmuskeln verkar blek, vilket indikerar framgångsrik kransartärligering. Det protokoll som beskrivits för neonatala möss, dock är mindre tillförlitligt som kransartären inte visualiseras och kirurgen måste uppskatta var att placera suturen 15. Även om den allmänna anatomin hos kranskärlen är densamma, individuellt djur variabilitet i riktning och förgrening av LAD existerar 16. Så när "gå i blind" artären kunde lätt missas. Andra tekniker såsom ekokardiografi därefter krävs för att bekräfta framgångsrik induktion av MI, och att se till att alla operationer resulterar i en liknande infarktstorlek. Beskrivs här är en förbättring jämfört med en nyligen publicerad metod 15, där positionen av LAD kan etarade och således LAD kan ligeras att reproducerbart inducera Ml.
Denna teknik kräver inte endotrakeal intubation eller mekanisk ventilation, som torakotomi i en hypotermiska tillstånd i den neonatala musen inte resulterar i lungkollaps. Men i den tidigare beskrivna metoden, svår hypotermi måste induceras till punkten för både komplett apné och upphörande av hjärtrytmen 15. Den huvudsakliga begränsningen av detta tillvägagångssätt är att kransartären inte längre perfusion och hjärtat verkar blek även innan LAD-ligering. I den strategi som beskrivs häri, är kranskärls visualisering möjligt vid en punkt i dvala innan djup hypotermi och hjärtrytmen upphörande, med full återhämtning av den neonatala musen efter operationen. Denna metod erbjuder en stor fördel med 100% reproducerbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Häckande par av C57BL / 6 och CD-1 IG-S-möss köptes från Charles River. Djur som används i denna studie hanterades i enlighet med riktlinjerna från det kanadensiska rådet om Animal Care och studieprotokoll godkändes av Animal Använd underutskottet vid Western University, London, Kanada.
1. Djurvård
- Efter födelseprocess är klar och valparna har varit initialt ammas av sin mor för några timmar, placera dem i en annan bur med en CD-1 fostermor. CD-1 mödrar uppvisa en lugnare fenotyp med en stark främjandet instinkt, och har en lägre tendens att cannibalize skadade valpar 15.
2. kirurgi
- Inducera anestesi genom att placera valp i en förseglad isofluran kammare (ca 500 pl 100% v / v isofluran tillåtet att skingra över 1300 cm3 kammare). Håll musen i kammaren tills upphörandet av rörelse (ca 30 sek).
- avlägsna moanvända från isofluran kammare och framkalla hypotermiska anestesi genom att placera musen på våt is. För att undvika frostskador, placera is i en steril operationshandske, linda musen inom handsken och täcka handske med is eller linda musen i steril våt gasväv och placera den på is.
OBS: Möss svalna snabbare vid kontakt med is är över en större yta, och som sådan smält is kan förkorta hypotermi induktionstid. - Bekräfta anestesi genom brist på rörelse respons på tå och svans nypa.
OBS: upphörande provocerad rörelse sker vid en kroppstemperatur mellan 15 ° C och 8 ° C. (Kylning tid till denna temperatur ca 1 min). Komplett apné och asystoli krävs inte för LAD-ligering. - Flytta isen sängen till operationsområdet utrustad med ett operationsmikroskop. Se till att musen valpen kvar på is under hela kirurgiska ingrepp.
OBS: operationsområdet, gasbinda och kirurgiska instrument bör steriliseras. Maintai sterilt område under hela förfarandet, och bära engångsbruk, sterila kirurghandskar. Oftalmologiska salva krävs inte eftersom möss föds med slutna ögon 17. - Placera musen valp i rätt sidoläge trycksår. Desinficera bröstet genom att försiktigt torka med povidon-jodlösning, följt av en etanolpinne.
- Utför hudsnitt på vänstra bröstet längs mitt axillarlinjen genom att skära huden mellan xyphoid och vänstra armhålan några millimeter under vänster framben. Också använda sax för att skära igenom det underliggande bröstmuskeln skiktet.
- Gör en vänster torakotomi i den 4: e interkostalrummet genom att separera revben och interkostal muskler med pincett.
OBS: Neonatal revben är mycket bräcklig och kan lätt brytas. För att undvika detta, försiktigt separata revben genom att öppna pincett längs interkostala muskeln (snarare än gripa revben). - Visualisera den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD) som kommer ut från den vänstra aurkel bakom lungvenen och nedåtgående bortom den stora hjärtvenen.
OBS: I detta tidiga neonatal fönster är bräss ofta visualiseras och kan täcka en del av hjärt bas. LAD kan ses fram bredvid position bräss, beroende på vinkeln bröstkorg snitt. - Ligera LAD genom att en 11-0 nylon sutur (0,007 nål mm diameter) under artären genom mitten ventrikeln under vänstra förmaket (Figur 1C). Ischemi bekräftas med blanche av hjärtmuskeln under suturen plats (figur 1G).
- Stäng bröst snitt med hjälp av 8-0 nylon suturer (nål 0,15 mm diameter). Använd två suturer att stänga revbenen. Placera båda ribb suturer innan ligering för att säkerställa att nålen inte punktera lungorna när de passerar genom kroppen hålighet.
- Efter att ha stängt revbenen, ta bort musen från isen sängen. Håll musen inom operationsområdet och placera den direkt på den sterila operations tillwel över en värmedyna vid 37 ° C för att påbörja uppvärmningen.
- Väl på sterila uppvärmd area, stänga muskler och hudlagren använder 8-0 nylon suturer (nål 0,15 mm diameter). Använd en sutur för muskellagret och använder två suturer för hudsnittet.
OBS: Muskel och ytskikten kan stängas på en värmedyna för att minska hypotermi exponeringstid. Mus temperaturen börjar stiga en gång placeras på värmedyna, men är fortfarande tillräckligt låg för anestesi underhåll under muskler och hud stängning.
3. Kirurgisk Recovery
- Fortsätt snabb uppvärmning på en värmedyna tills återlämnande av spontan rörelse. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Ta povidon-jod och blod genom att försiktigt torka skada plats med etanol pinne.
- Efter tillräcklig återhämtning från anestesi, ta bort den från sterila operationsområdet, smeta den med sängkläder från fostermors bur och retur valp till fostermor. Detta hjälper till att förhindra moderns avvisande eller cannibalization.
OBS: Returnera inte valpar till en bur med andra djur tills återhämtat sig helt. Om en hel kull inte har använts, och kullsyskon kvar hos fostermor, placera återvunna valpar i mitten av kullen. Om utför mer än en operation, komplett alla operationer som krävs för en enskild kull innan han återvände möss till sin fostermor. - Observera beteende fostermor mot valpen var 10 - 15 min för 2-3 timmar för att säkerställa godkännande av valp. Om modern visar aggression mot den skadade valp, ta valpen och avliva av isofluran överdos (> 5%, tills andnöd), följt av halshuggning. OBS: perioperativ analgesi läkemedel behövs inte eftersom de centraliserade smärt reflexer inte är fullt utvecklade i detta tidiga 15 år.
4. Mätning av hjärtinfarkt Storlek 4 -6 h efter MI
- Låt valpar att återhämta sig i vården av en CD-1 fostermor under en period på 4-6 timmar. Ta valpen från buren med mor och avliva den med isofluran överdos följt av halshuggning med stora saxar.
- Skära hjärtat i dissekera mikroskop, noga med att inte slita hjärtmuskeln.
- Skära in i huden från xyphoid processen till början av bröstkorgen. Öppna bukväggen under bröstkorgen. Ta tag i nedre bröstkorgen och skär genom revbenen och muskulaturen i längdriktningen längs den vänstra mitt axillarlinjen från membranet till armhålan.
- Håll sax i tvärgående plan och skär försiktigt genom membranet från vänster till höger sida. Se till att placera en sax under nivån för hjärtat för att undvika eventuella skador på spetsen.
- Fatta bröstkorg och skär höger revben och muskulatur längs den högra mitt axillarlinjen. Ta bort alla kärlförbindelser till hjärtat med en sax. Ta hjärtat från brösthålan genom att greppabasen.
- § hjärtat i tre delar med hjälp av en kirurgisk kolstål rakblad. Göra det första snittet längs kort-axeln hos hjärtat vid mittpunkten mellan suturen och hjärt apex. Göra det andra snittet vid nivån av suturen (figur 3A).
OBS: Detta lämnar en toppsektion ungefär 0,75 mm tjock väger 0,0018 g; en mellan bassektion ungefär 1 mm tjock, väger 0,0065 g; och basen av hjärtat. - Placera de hjärtsektioner i 1% 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) vid rumstemperatur under 10 - 15 min. titta noga prov för att undvika över färgning.
- För att öka kontrasten, fixa färgade hjärta skivor med 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C. För att beräkna% infarktområdet, fotograferar hjärtsektioner och mäta infarktområdet på bildprogram. Den livskraftiga hjärtmuskeln fläckar rött när infarktområdet avgränsas som vitt 18.
5. Mätning avHjärtfunktionen med ekokardiografi Post-MI
- Låt valpar att återhämta sig i vården av en CD-1 fostermor under en period av 24-48 timmar. Inducera anestesi genom att placera valp i en förseglad isofluran kammare (5% isofluran). Håll musen i kammaren tills upphörandet av rörelse (ca 30 sek).
- Säkra valpen i ryggläge på en uppvärmd docka (temperatur 37 ° C) med nosen i en kon för att leverera 0,5-1% isofluran (för anestesi underhåll). Placera förvärmas eko gel på den vänstra bröstområdet.
- Skaffa en parasternal lång axel syn på den vänstra kammaren (LV). Se till att bilder erhålls under nivån för suturen i LV. Efter förvärvet positionen, vrid ultraljudssonden (40 MHz) 90 ° för att erhålla en parasternala kort axel visa och spela M-mode ekokardiografiska bilder.
- Mät slutdiastoliska och avsluta systoliska vänsterkammar innerdiametrar från kortaxel M-mode bilder. Beräkna ejektionsfraktion och FRACTIOslutlig förkortning.
6. Mätning av hjärtinfarkt Storlek 24 timmar efter MI
- Låt valpar att återhämta sig i vården av en CD-1 fostermor under en period av 24 timmar. Ta valpen från buren med mor och avliva den med isofluran överdos följt av halshuggning med stora saxar.
- Öppna brösthålan som i steg 4,2. Innan skära hjärtat, försiktigt tag bröstaortan precis ovanför membranet med fin pincett. Håll fina sax i frontalplanet, platt mot bröstväggen, och skär bröst aorta från den bakre bröstväggen flyttar sax i hjärn riktning.
- Skär aortan fri från bröstväggen och eventuella andra anslutningar tills den når hjärtat. Excidera hjärtat genom att greppa den övre hålvenen och skära alla andra vaskulära anslutningar till kroppen.
- Skölj hjärtat (med aorta bifogas) i saltlösning. Noggrant cannulate bröstaortan med en 30 gauge nål och knyt enorta att kanyl med 8-0 nylonsutur tråden.
- BEGJUTA hjärtat med 1 ml saltlösning genom aorta via en 30 gauge nål vid en hastighet av 1 ml / min. BEGJUTA hjärtat med 150 pl 2% Evans blue lösning vid en hastighet av 1 ml / min. Ta hjärtat från kanylen avsnitt den i tre delar och fläcka den med TTC som beskrivs i avsnitt 4.
- För att beräkna infarktstorlek, fotograferar hjärtsektioner och mäta infarktområdet på bildprogram. Den livskraftiga hjärtmuskeln fläckar blå, riskområdet fläckar rött, och infarktområdet avgränsas som vitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hjärtinfarkt förfarande vid P1 kan fyllas i 10-15 minuter och har en dödlighet på 7,8% (5 av 64 valpar). Efter operation, möss återhämta sig från hypotermiska anestesi inom de närmaste 5 - 20 min (tid för återhämtning beror på kroppstemperaturen uppnås under anestesi och hastighet kirurg). Vid användning av P7 pups (för jämförelse med en icke-regenerativ myokardium), är en längre period av kylning krävs för att nå dvala. P7 valpar är mycket större och har svårare att återhämta sig från både hjärtskada och hypotermi, vilket resulterar i en mycket högre dödlighet på 26,9% (14 av 52 valpar).
Resultat från tidigare studier bekräftas häri, indikerar induktion av hypotermiska anestesi på nära till 10 ° C (mellan 8 ° C och 15 ° C) 19. Inom detta temperaturfönster, gör hjärtfrekvens långsam,men rytm fortsätter med en hastighet av mellan 24 bpm och 11 bpm. Den låga hjärtfrekvens på denna nivå av kylning minskar intraoperativ blödning avsevärt. LAD kan lätt visualiseras och ligeras vid dessa temperaturer (Figur 1). LAD förblir synlig tills kroppstemperatur når mellan 9,6 ° C och 4,9 ° C, vilket orsakar sänkning av hjärtfrekvensen till två slag per minut eller asystoli.
Efter LAD ligation på P1, valpar återhämtar sig helt och växa till en kroppsstorlek som är jämförbar med kull kontroller. När placeras tillbaka med sin fostermor, valpar återfå medvetenhet och utfodringskapacitet jämförbara med kullsyskon i ca 10 min. Vid histologisk undersökning 3 dagar post-MI, finns det bevis för infarkt, med infiltrerande inflammatoriska celler, en typisk post-infarkt svar (figur 2). Vid dag 7 efter MI visas vänsterkammarvävnad normalt. Vid dag 21 efter MI, komplett cardiac regenere har inträffat.
2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning 4-6 h efter Ml användes som en bekräftelse på konsekvent induktion av MI. Den röda området representerar livskraftig hjärtmuskulaturen och det vita området representerar ischemisk död vävnad. I totalt 13 LAD ligation operationer, var 100% av hjärtan infarkt, med en genomsnittlig infarktstorlek på 36% (Figur 3). TTC färgning med Evans blå perfusion utfördes också 24 timmar efter MI att visa uthållighet av infarktvävnad och mäta infarktstorlek baserad på riskområdet (Figur 4). I dessa hjärtan, fläckar livskraftig hjärtmuskeln blå, riskområdet fläckar rött, och infarktområdet avgränsas som vitt. Infarktstorlek beräknades som procent av riskområdet. I 4 LAD ligation operationer, var 100% av hjärtan infarkt, med en genomsnittlig infarktstorlek 49% av riskområdet (Figur 4).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> För att bekräfta infarktinduktion var ekokardiografi utfördes vid 24 och 48 timmar efter MI. Vid 24 h post-MI, var ejektionsfraktion (EF) signifikant reducerad från 84% till 74%, och fraktionerad förkortning (FS) minskade signifikant från 50% till 40% (figur 5). Av 48 h efter-MI, var EF ytterligare till 46%, jämfört med 80% i kontrollgruppen och FS minskade också avsevärt till 25%, jämfört med 50% i kontrollgruppen. Dessutom fanns det en signifikant sänkning av det systoliska vänsterkammar inre diameter vid 48 h (fig 6). LV främre väggtjocklek var inte signifikant minskade vid antingen 24 eller 48 timmar efter MI (fig 5 och 6).
Figur 1. Kranskärls är synligt under Neonatal LAD ordningen. P1 neonatal mus after hypotermisk anestesi, hud snitt, muskel snitt och laterala torakotomi i det fjärde revbensmellanrummet. A) Vänster främre nedåtgående kransartären (LAD) är synlig. BD) 11-0 nylonsutur får passera genom mitten av ventrikeln. E) LAD är ligerade och skållning i observeras nedanför suturstället. F) och G) är förstoringar av A) och E) respektive. Occ. LAD, ockluderade vänstra främre nedåtgående artär. LA, vänster atrium. LV, vänster kammare. GCV, stora krans ven. Vit pil, LAD. Svart pil huvud, reflexer från belysning. Skala barer är 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bevis Complete Cardiac återhämtning efter LAD Ligering i neonatala möss. Massons trikromfläckning efter LAD ligation i P1 möss. Hela hjärtan och förstoringar på infarkten områdena visas i dag 3, 7 och 21 efter LAD ligation. Notera myocyt förlust och inflammatorisk cell infiltrera i infarktregionen vid dag 3 efter Ml (vit pil). Komplett infarktområdet regenerering börjar vid dag 7 efter MI. Få tecken på fibros noterades på dag 21 efter MI. Skala barer är 200, 100 och 50 pm för 40X, 200X, och 630X förstoringar, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Neonatal LAD Ligering är 100% Reproducerbar. A) Linjer för sektionering av hela hjärtat för att skapa en 0,75 mm spets bit och en 1 mm mid-bas bit för TTCfärgning. B) Representativa bilder av TTC färgade skenstyrning och LAD ligeras hjärtan. Skala barer är 1 mm. C) Infarktstorlek i 13 LAD ligeringar i P1 neonatala möss. Hjärtan samlas 4-6 timmar efter MI och infarktstorlek mätt efter TTC färgning. Rött indikerar livskraftig hjärtmuskeln; vit indikerar nekros. Data är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Neonatal LAD Ligation Resultat i Pålitlig infarkt. A) Infarktstorlek som% av ischemisk område efter LAD-ligering i P1 neonatala möss (n = 4). Hjärtan samlades 24 timmar efter MI och infarktstorlek mättes efter Evans blå och TTC färgning. Blått anger livskraftig myokardium; rött indikerar riskområdet; vit indikerar necrosis. Data är medelvärde ± SEM. B) Representativa bilder av Evans blått och TTC färgade LAD ligerade hjärtan efter LAD ligation. Skala Bar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Neonatal LAD ligering resulterar i hjärtdysfunktion vid 24 timmar Hjärtfunktionen bedömdes genom ekokardiografi. A) representant M-mode bilder för både skenopererade och LAD ligeras möss efter MI.. Slut diastole och slut systole anges med pilar. B) Mätningar av fractional förkortning, ejektionsfraktion och vänsterkammarinnerdiameter på både diastole och systole. Data är medelvärde ± SEM. N = 8 och 7 för bluff och kransartärligering (CAL) respektive. * P <0. 05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Neonatal LAD ligering resulterar i hjärtdysfunktion vid 48 timmar efter MI Hjärtfunktionen bedömdes genom ekokardiografi. A). Representativa M-mode bilder som visar slut diastole (långa pilar) och slut systole (korta pilar) för både sham drivs och LAD ligeras möss. B) Hjärtat funktionella mätningar av ekokardiografi inklusive fraktionerad förkortning, ejektionsfraktion och vänsterkammarinnerdiameter på både diastole och systole. Data är medelvärde ± SEM. N = 4 och 6 för falskt och kransartärligering (CAL), respektive. * P <0,05, ** P <0,01.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiska LAD ligation visas häri är en tillförlitlig metod för att producera MI i neonatala möss. Denna modell ger forskare med en reproducerbar modell med att studera däggdjurs hjärta förnyelse. Visualisering av kranskärlen är en viktig del av denna metod säkerställer korrekt sutur placering och därmed garantera reproducerbarhet. Medan vuxna möss inte har växelvarma kapacitet, är kroppstemperaturen och metabolisk hastighet av neonatala möss nära förknippade med omgivningstemperatur. Dessutom den lilla storleken på neonatala möss gör dem idealiska för hypotermi induktion av ytan kylning. Tidpunkten för kirurgi och mus kroppstemperatur är avgörande för riktigheten i replikera detta förfarande och därför måste övervakas noggrant. Ligering så snart som möjligt efter dvala har uppnåtts ger möjlighet att visualisera blanche av myokardiet efter ligering, vilket bekräftar kirurgisk framgång.
Det finns multiple metoder som kan användas för att bekräfta MI induktion. Dessa inkluderar TTC färgning, ekokardiografi och histologisk analys. TTC färgning är låg kostnad, reproducerbar och tillförlitlig och lätt utföras med hög genomströmning. Av dessa skäl har TTC färgning använts i stor utsträckning. Ekokardiografi kan användas för att icke-invasivt övervaka förändringar i hjärtfunktion efter MI över tiden. Definitiva beviset på MI kan påvisas genom histologisk analys. I den aktuella studien var alla tre av ovanstående tekniker som används för att kontrollera framgångsrik induktion av MI.
Visualisering av LAD är avgörande för framgångsrik MI induktion. Om utredaren upplever svårigheter att visualisera LAD (sannolikt på grund av djup hypotermi induktion), kan den vänstra förmaket lyftas något med pincett, som huvud roten av LAD är större än de mer distala segment och kan vara lättare synligt. Om LAD inte kan visualiseras, bör utredaren inte förutsätta artär lokatjon. Denna valp bör inte användas för experimentell ligering och kunde ganska användas som en skenopererade kontroll.
Korrekt inträde i brösthålan på 4: e interkostalrummet är viktigt att få en optimal visualisering och utrymme för LAD ligation. Detta kan åstadkommas genom noggrann räkning av interkostal utrymmen. Dessutom, om en mindre mängd av blödning inträffar under förfarandet, kan den avlägsnas med steril gasbinda. Om blödningen är betydande, men kirurgen har sannolikt inte svalnat musen tillräckligt innan proceduren, och ytterligare kylning erfordras. Observera att graden av kylning bör kontrolleras noggrant för att säkerställa puls på omkring 20 bpm för att visualisera hjärtats kranskärl.
På grund av den begränsade storleken på neonatala möss, är hög upplösning ekokardiografi krävs för att få tydliga M-mode bilder för analys av hjärtfunktionen. För bästa resultat, se till att hjärtfrekvensen vidca 400 bpm med lätt anestesi (0,5-1% isofluran inandning) och upprätthålla normal kroppstemperatur (uppvärmd brygga och värmde eko gel). Bilderna bäst förvärvas om kroppen lutar något mot höger axel (~ 5 ° cranially och 5 ° åt höger). Säkerställa tillräcklig eko gel appliceras för att minimera buller.
Även om detta tillvägagångssätt inte erbjuder 100% reproducerbarhet, kan storleken på infarkten vara något varierande beroende på kransartären förgrening anatomi hos den individuella nyfödda (Figur 3). Som ett resultat kan högre n nummer krävas för att nå statistisk signifikans vid bestämning av effekterna av olika behandlingar eller genetiska manipulationer på hjärtats regenerering. Men har detta tillvägagångssätt stora fördelar jämfört med både neonatal apex resektion och cryoinjury som patofysiologin av dessa mekanismer för skada kan vara helt annorlunda från MI och kan därför inte exakt åternuvarande mänskliga MI 8,20. Detta tillvägagångssätt efterliknar mer direkt typisk personskador, och kan användas för att studera hjärt förnyelse i fastställandet av däggdjurs MI.
Denna modell är unik eftersom den tillåter att studera skillnaderna i mekanismer för återhämtning från hjärtskada mellan den icke-regenerativ (vuxen) och regenerativ (neonatal) däggdjurshjärtmuskeln. Till exempel vuxen mus MI modellresultat i permanent ärrbildning. Kammar bristning uppstår ofta som en följd av infarktexpansion. I vår erfarenhet med denna modell (> 100 operationer, opublicerade data), är fullständig regenerering uppenbar 21 dagar efter infarkt och kammarbrott har inte observerats. Informationen upplupna från användning av denna modell kan erbjuda nya insikter i mekanismer som kan främja hjärt förnyelse i vuxen.
Nya rön tyder på cardiomyocyte spridning är en viktig bidragande orsak till hjärt regenere 9 4,21. Ytterligare forskning med hjälp av protokoll som presenteras här kan tyda på terapeutiska mål för induktion av hjärt förnyelse efter MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
