Abstract
koroner arter ligasyonu ile uyarılmış miyokard enfarktüsü, kalp tamir ve yenilenme mekanizmaları incelemek için, ve tedavisi için yeni hedeflerin belirlenmesine için bir araç olarak bir çok hayvan modellerinde kullanılmıştır. Onlarca yıldır, tam kalp rejenerasyon modelleri Kurbağa ve balık var, ama bir memeli meslektaşı mevcut değildi. fareler rejeneratif yeteneklere sahip sırasında bir doğum sonrası pencerenin son keşif kardiyak rejenerasyon bir memeli modeli kurulmasına yol açmıştır. Yenidoğan fare memeli kalp yenilenme cerrahi modelinde, burada sunulmuştur. Kısaca, doğum sonrası gün 1 (P1) fareler izofluran ile anestetize edilmiş ve hipotermi uyarılması için bir buz pedi üzerine yerleştirilir. Göğüs açılır ve koroner arter (LAD) sol ön görüntülenmiştir sonra, bir dikiş sol ventrikül miyokard iskemi indirebilmek için LAD etrafına yerleştirilir. cerrahi işlem 10-15 dakika sürer. Koroner arter olduğunu görselleştirmeDoğru sütür yerleştirme ve tekrarlanabilirlik için çok önemlidir. Miyokard enfarktüsü ve kardiyak disfonksiyon sırasıyla trifenil-tetrazolyum klorür (TTC) boyama ve ekokardiyografi ile teyit edilir. Komple rejenerasyon 21 gün miyokard infarktüsü sonrası histoloji ile doğrulandı. Bu protokol, miyokard enfarktüsünden sonra kalp, memeli rejenerasyon mekanizmaları aydınlatmak için bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
Miyokard infarktüsü (Mİ) tüm dünyada ölüm önde gelen nedenidir ve kalp yetmezliği vakaların 1 yaklaşık üçte sorumludur kalır. perkütan girişim ve trombolitik kullanımı sürekli optimizasyon gelişi MI, kardiyomiyosit ölümü ve kasılma miyokardın kaybı aşağıdaki reperfüzyon artarken yine ortaya çıkar. Ayrıca aday olmayan ya da bu müdahalelerin fayda görmüyorum "no-seçeneği" hastaların çok sayıda var olmaya devam etmektedir. Bu hastalar enfarktüs şifa bir mekanizma olarak oluşumunu ve zararlı ventriküler yeniden biçimlenme yara giden devre dışı iskemi yaşamaya devam ediyor. Bu süreç sonunda prognoz anjiotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörleri ve beta bloker optimal farmakolojik tedaviye rağmen zayıf kaldığı için kalp yetmezliği ile sonuçlanır. Ne yazık ki, ciddi sol ventrikül disfonksiyonu olan hastalarda bir yıllık ölüm oranı hala kalır% 26 2 gibi yüksek. Kalp nakli kalp yetmezliği olan hastalar için nihai bir tedavi seçeneğidir. Ancak, kalp nakli için sınırlı bir donör havuzu bu çoğu hasta için uygun bir seçenek yapmaz. Böylece, hasarlı miyokard geri yeni terapötik ajanların keşfi kalp hastalığı sorunu çözmek için her şeyden kalır. kardiyak hasar güvenilir hayvan modelleri, bu nedenle bu sürecin önemli bir bileşeni olarak gereklidir.
Geleneksel dogma yetişkin kardiyomiyositlerde bölünmesi ya da hasarlı miyokard 3 yerine de-ayırt aciz post-mitotik, terminal farklılaşmış hücreler, olduğu dikte etmiştir. Bu nedenle, bir yetişkin memeli kalp tamamen yaralanma kurtarmak asla ve kayıp kardiyomyositler fibröz doku ile değiştirilmesi gerekmektedir. Böylece, araştırma infarkt genişleme en aza indirmek ve skar oluşumunu azaltmak için öncelikle terapötik ajanlar üzerine odaklanmıştır. Daha yakın zamanlarda, ancak bir paradigma kayması oluştuKalp şifa ve birçok araştırma çabaları çevreleyen düşünme kardiyak rejenerasyon 4 potansiyeli odaklanmak yönlendirildi edilmiştir.
Yakın zamana kadar, kalp rejenerasyon in vivo çalışma gibi urodele amfibiler ve teleost balık 5-7 gibi olmayan omurgalı modeller ile sınırlandırılmıştır. Ancak, yenidoğan fare kalp rejenerasyon kapasitesinin keşif memeli kardiyak rejenerasyon iki cerrahi modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır: Kalp tepe ve koroner arter oklüzyonu rezeksiyonu miyokard infarktüsü 8,9 ikna etmek. 2011 yılında, bir fare apeks rezeksiyon model, tam bir kardiyak rejenerasyon doğum sonrası 1. gün (P1) mümkündür göstermek için kullanılmıştır. Ancak, bu kapasite hızla ilk yenidoğan döneminden sonra azalır. Memeli kalp kısaca progenitör hücre sayıları düşüş olarak P7 doğumdan sonra rejeneratif potansiyelini kaybeder ve iki nükleuslu hale kardiyomiyositlere, kaybetmekonların çoğalma yetkinlik ve kalıcı hücre döngüsü 10,11 çıkın. neonatal ve yetişkin memeli kalbi arasındaki temel farkları anlamak kardiyak rejenerasyon içine yeni anlayışlar yol açabilir.
apeks rezeksiyonu gerçekten kasılma dokusunun yeniden büyümesine fikir veriyor olsa da, model, tedavilerin geliştirilmesine de kendini ödünç vermez, böylece tipik insan kalp yaralanması simüle ve vermez. Koroner arter tıkanıklığı modeli, ancak, daha doğrudan insan kullanımı için tedavi edici ilerleme için geçerli olabilecek mekanizmalar içine daha yararlı açılımlar sağlayabilir böylece MI patoloji patofizyolojik yönlerini taklit ve.
Cerrahi koroner ligasyon birçok hayvan modellerinde 12-14 faydalı bir deney tekniği olarak kullanılmıştır. Yetişkin koroner arter ligasyonu modelinde hayvanlar anestetize edilmiş ve respirati korurken göğüs boşluğunun açılmasına izin vermek için nefes borusuna boru sokulmuşturüzerinde. Kalp koroner damarların görselleştirme izin ve doğru sütür yerleştirme için izin düzenli olarak yenmek için devam ediyor. Ayrıca perfüzyon devam ettikçe, kalp pembe kalır ve bağlanmasından sonra iskemik miyokard başarılı koroner arter ligasyonu gösteren soluk görünür. Koroner arter görüntülenmiştir değildir ve cerrah dikiş 15 nereye yerleştirileceğini tahmin gerektiği gibi yenidoğan fareler için açıklanan protokol, ancak, daha az güvenilirdir. Koroner damarların genel anatomi yönünde aynı, bireysel hayvan değişkenliği ve LAD dallanma 16 mevcut olmasına rağmen. "Kör gidiyor," Böylece, arter kolayca cevapsız olabilir. Ekokardiyografi gibi diğer teknikler daha sonra MI başarılı indüksiyon onaylamak için, ve tüm ameliyatlar benzer bir infarkt sonucu sağlamak için gereklidir. Bir gelişme LAD pozisyonu kurulacaktır bir süre önce yayınlanan yönteme 15, burada olduğu açıklananyayınlanmamış ve böylece LAD tekrar üretilebilir MI uyarılması için bağlanabilir.
Bu teknik, akciğer çöküşü yol açmaz yenidoğan fare bir hipotermik durumda torakotomi olarak endotrakeal entübasyon veya mekanik ventilasyon, gerektirmez. Bununla birlikte, daha önce tarif edilen bir yöntemde, ciddi hipotermi tam apnesi ve kalp ritmi 15 kesilmesinden iki noktasına bağlı olması gerekir. Bu yaklaşımın en önemli kısıtlılığı, koroner arter artık perfüze olmasıdır ve kalp bile LAD ligasyonu önce soluk görünür. Burada tarif edilen yaklaşımda, koroner arter görselleştirme cerrahisi sonrası yenidoğan fare tam iyileşme ile derin hipotermi ve kalp ritim kesilmesinden önce uyuşukluk bir noktada mümkündür. Bu yöntem% 100 tekrarlanabilirliği önemli bir avantaj sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL / 6 ve CD-1 IG-S farelerin üreyen Charles River'dan satın alınmıştır. Bu çalışmada kullanılan Hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak ele alındı ve çalışma protokolleri Batı Üniversitesi, Londra, Kanada'da Hayvan Kullanımı Alt Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Hayvan Bakımı
- doğum tamamlanana ve yavrular başlangıçta anne sütü birkaç saat boyunca anneleri tarafından olmuştur sonra, CD-1 bakıcı anne ile farklı bir kafese koyun. CD-1 anne, güçlü bir teşvik edilmesi içgüdüsü ile sakin bir fenotip görüntüler ve yaralı yavrular 15 yediklerini daha düşük bir eğilim var.
2. Cerrahi
- Kapalı bir izofluran odası içinde yavru yerleştirerek anestezi neden (yaklaşık% 100 hacim / hacim izofluran 500 ul 3 cm 1300 bölmeyi dağıtmak için izin verilir). hareket (yaklaşık 30 saniye) sona erene kadar odasında fare tutun.
- mo kaldırizofluran odasından kullanmak ve ıslak buz üzerinde fare koyarak hipotermik anestezi neden. donma önlemek için, steril bir cerrahi eldiven içine buz koyun eldiven içinde fare sarın ve buz ile eldiven kapak VEYA steril gazlı bez, ıslak fare sarın ve buz üzerine yerleştirin.
NOT: Fareler buz temas daha geniş bir alana üzerinde olduğunda daha hızlı serin ve bu erimiş buz gibi hipotermi indüksiyon süresini kısaltabilir. - ayak ve kuyruk tutam hareket yanıt eksikliği ile anestezi onaylayın.
Not: tahrik hareketinin durması 15 ° C ile 8 ° C arasında bir vücut sıcaklığında olur. (Bu sıcaklıkta yaklaşık 1 dak zaman Soğutma). Komple apne ve asistoli LAD ligasyonu için gerekli DEĞİLDİR. - Bir ameliyat mikroskobu ile donatılmış cerrahi alana buz yatağa taşımak. Fare yavru tüm cerrahi prosedür sırasında buz üzerinde kalmasını sağlamak.
NOT: Cerrahi alan, gazlı bez ve cerrahi aletler sterilize edilmelidir. maintaprosedür boyunca steril alanda, ve tek kullanımlık, steril cerrahi eldiven giyin. Gözleri 17 kapalı fareler doğarlar olarak Oftalmik merhem gerekli değildir. - sağ lateral dekübit pozisyonunda fare yavru yerleştirin. yavaşça etanol bez tarafından takip povidon-iyot çözeltisi ile silerek göğüs dezenfekte edin.
- Sol ön ayağın altında xiphoid ve sol aksillada arasında birkaç milimetre cilt keserek orta aksiller hat boyunca sol göğüste cilt kesisi gerçekleştirin. Ayrıca altta yatan pektoral kas tabakası kesmek için makas kullanın.
- Forseps ile kaburga ve interkostal kasları ayırarak 4. interkostal aralıkta sol torakotomi gerçekleştirin.
NOT: Yenidoğan kaburga çok kırılgan ve kolayca kırılabilir. interkostal kas boyunca forseps açılması (yerine kaburga açgözlü) tarafından bu hafifçe ayrı kaburga önlemek için. - Sol AUR'un çıkan sol ön koroner arter (LAD) inen görselleştirmekpulmoner ven arkasında icle ve büyük kalp ven ötesine azalan.
NOT: Bu erken neonatal penceresinde, timus genellikle görüntülenmiştir ve kardiyak tabanının bir kısmını kapsayabilir. LAD göğüs kesi açısına bağlı olarak, timus konumu yanında ortaya çıkan görülebilir. - Sol kulak (Şekil 1C) aşağıdaki ortasında ventrikül ile arter altında 11-0 naylon dikiş (0.007 mm çaplı bir iğne) geçirilerek LAD Arter. İskemi dikiş yeri (Şekil 1G) altında miyokard haşlama ile teyit edilir.
- 8-0 naylon dikişler (0.15 mm çaplı iğne) ile göğüs kesi kapatın. kaburga kapatmak için iki sütür kullanın. vücut boşluğunda geçerken akciğerleri delinme yok iğne sağlamak için bağlanmadan önce hem kaburga sütür yerleştirin.
- kaburga kapattıktan sonra, buz yataktan fareyi çıkarın. cerrahi alanı içinde fare tutmak ve steril cerrahi doğrudan yerleştirin37 ° C 'de sıcak bir ısıtma pedi üzerine wel sıcaklaştıralım.
- Bir kez steril ısıtmalı alanda, 8-0 naylon sütür (0.15 mm çaplı iğne) kullanarak kas ve deri katmanları kapatın. kas tabakası için bir sütür kullanın ve cilt kesisi için iki sütür kullanın.
NOT: Kas ve deri katmanları hipotermi maruz kalma süresini azaltmak için bir ısıtma pedi üzerinde kapalı olabilir. Fare sıcaklığı kez ısıtma pedi üzerine yerleştirilir yükselmeye başlar, ancak kas ve cilt kapatılması sırasında anestezi bakımı için yeterli yeterince düşük kalmaktadır.
3. Cerrahi Kurtarma
- kendiliğinden hareketin dönüşüne kadar sıcak bir ısıtma yastığı hızlı ısınma devam ediyor. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. yavaşça etanol çubukla yaralanma sitesi silerek povidon-iyot ve kan çıkarın.
- anestezi yeterli kurtarma sonra, beslemek gelen yatak ile yayma, steril cerrahi alanında çıkarınannenin kafes ve dönüş yavru anne teşvik etmek. Bu anne reddi veya cannibalization önlemeye yardımcı olur.
NOT: Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanlarla bir kafes yavrular iade etmeyin. Bütün bir çöp kullanılan ve yavruları beslemek annesi ile kalır değilse, çöp ortasında kurtarıldı yavrular yerleştirin. Birden fazla ameliyat gerçekleştirmek ise, tam da üvey anneye fareler dönmeden önce bireysel çöp için gerekli tüm ameliyatlar. - yavru kabulü sağlamak için 3 saat - 2 için 15 dakika - yavru doğru her 10 bakıcı annenin davranışlarını gözlemleyin. anne yaralı yavru doğru saldırganlığı görüntülerse, yavru çıkarmak ve izofluran doz aşımı ile euthanize (>% 5, solunum durması kadar), dekapitasyon. NOT: Merkezi ağrı refleksleri tam olarak bu erken 15 yaşında gelişmemiştir olarak Perioperatif analjezi ilaçlar gerekli değildir.
4. Ölçüm Miyokard ve Enfarktüs boyutu 4 -6 saat sonrası MI
- 6 saat - yavrular 4 bir süre için, bir CD-1 üvey annenin bakımında kurtarmak için izin verin. anne ile kafesinden yavru çıkarın ve büyük makas ile dekapitasyon izofluran doz aşımı bunu euthanize.
- Diseksiyon mikroskop altında kalbi tüketim, dikkatli değil miyokard rip.
- Toraks üstüne xiphoid süreçte cilt kesin. göğüs kafesi altında açın karın duvarı. alt göğüs kafesi tutun ve Aksillaya diyaframın sol orta aksiller hat boyunca uzunlamasına kaburga ve kas kesti.
- enine düzlemde makas tutun ve sağ tarafta soldan dikkatlice diyafram kesti. apeks zarar görmemesi amacıyla kalp seviyesinin altında makas yerleştirmek için emin olun.
- göğüs kafesi tutun ve sağ orta aksiller hat boyunca sağ kaburga yan ve kas kesti. makasla kalbe tüm damar bağlantıları çıkarın. tutarak göğüs boşluğundan kalbe kaldırbaz.
- Bölüm cerrahi karbonlu çelik jilet kullanarak üç parçaya kalp. sütür ve kardiyak apeks arasındaki orta noktada kalbin kısa ekseni boyunca ilk kesim olun. Ameliyat dikiş ipliği (Şekil 3A) seviyesinde, ikinci kesim yapın.
NOT: Bu 0.0018 g ağırlığında yaklaşık 0.75 mm kalınlığında bir tepe bölümü bırakır; 0.0065 g ağırlığındaki yaklaşık olarak 1 mm kalınlığında bir orta taban bölümü; ve kalbin tabanı. - 15 dakika - 10 Oda sıcaklığında% 1 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) kalp bölümleri yerleştirin. Dikkatle aşırı boyama önlemek için numune izleyin.
- gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehid ile lekeli kalp dilimleri, kontrastı arttırmak düzeltmek için. % Infarkt alanı, fotoğraf, kalp bölümleri hesaplamak ve görüntüleme yazılımı üzerinde infarkt alanı ölçmek için. Infarkt alanı beyaz 18 olarak demarcated ise canlı miyokard kırmızı lekeleri.
5. ÖlçümEkokardiyografi Post-MI kardiyak işlev
- 48 saat - yavrular 24 bir süre için, bir CD-1 üvey annenin bakımında kurtarmak için izin verin. kapalı bir izofluran odasının (% 5 izofluran) 'de yavru koyarak anestezi neden olur. hareket (yaklaşık 30 saniye) sona erene kadar odasında fare tutun.
- (Anestezi bakım için)% 1 izofluran - 0.5 sunmak için bir koni onun burnu ile ateşli bir dok (sıcaklık 37 ° C) sırtüstü pozisyonda yavru sabitleyin. Sol göğüs alana önceden ısıtılmış yankı jel yerleştirin.
- sol ventrikül (LV) bir parasternal uzun eksen görünümü elde. Emin olun görüntüleri LV dikiş seviyesinin altında elde edilir. pozisyon aldıktan sonra, ultrason probu (40 MHz) 90 ° bir parasternal kısa eksen görünümü elde etmek ve kayıt M-mod ekokardiyografik görüntüleri açın.
- son diyastolik ölçün ve kısa eksen M-mode görüntülerden sistolik sol ventrikül iç çapları sonunda. ejeksiyon fraksiyonu ve fractio hesaplayınnal kısalma.
6. Ölçüm Miyokard ve Enfarktüs boyutu 24 saat sonrası MI
- Yavrular, 24 saat bir süre için, bir CD-1 üvey annenin bakımında kurtarmak için izin verin. anne ile kafesinden yavru çıkarın ve büyük makas ile dekapitasyon izofluran doz aşımı bunu euthanize.
- Adım 4.2 olarak göğüs boşluğunu açın. kalbi eksize önce, dikkatli bir şekilde gayet güzel forseps ile diyafram üzerinde aorta kavramak. göğüs duvara düz koronal düzlemde ince makas, tutun ve kranial yönde makas hareketli arka göğüs duvarı kapalı aorta kesti.
- o kalbi ulaşıncaya kadar göğüs duvarı ve diğer bağlantılardan ücretsiz aorta kesin. superior vena kava tutup vücudun diğer tüm vasküler bağlantıları keserek kalbini tüketim.
- tuzlu su içinde (ekli aorta) ile kalbi durulayın. Dikkatle 30 gauge iğne ile aorta cannulate ve kravatorta 8-0 naylon dikiş ipliği ile kanül.
- 1 ml / dk'lık bir oranda 30 ebatlı iğne ile, aorttan tuz 1 ml kalp serpmek. 1 ml / dakika bir hızda,% 2 Evans mavisi solüsyonundan 150 ul kalp serpmek. üç parçaya bölüm, kanül onu kalbi çıkarın ve bölüm 4'te açıklandığı gibi TTC ile leke.
- infarkt, fotoğraf, kalp bölümleri hesaplamak ve görüntüleme yazılımı üzerinde infarkt alanı ölçmek için. canlı miyokard riski lekeleri alan kırmızı, mavi lekeler ve enfarktüs alanı beyaz demarcated edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P1 miyokard enfarktüsü prosedürü 10 içinde tamamlanabilir - 15 dakika ve% 7.8 (5 64 üzerinden yavrular) bir mortalite oranına sahiptir. Ameliyattan sonra, fareler önümüzdeki 5 içinde hipotermik anesteziden - 20 dakika (iyileşme süresi vücut ısısının cerrahın anestezi ve hız sırasında ulaşılan bağlıdır). (Non-rejeneratif miyokardın ile karşılaştırma için) P7 yavrular kullanırken, soğutma daha uzun bir süre uyuşukluk ulaşmak için gereklidir. P7 yavruların çok daha büyük ve% 26.9 (14 52 üzerinden yavrular) çok daha yüksek bir mortalite oranı ile sonuçlanan, kardiyak yaralanma ve hipotermi hem kurtarma fazla zorluk çekerler.
Önceki çalışmaların sonuçları 19 (8 ° C ve 15 ° C arasında) yakın, 10 ° C'de hipotermik anestezinin indüksiyonu gösteren tarifnamede teyit edilir. Bu sıcaklık penceresi içinde, kalp hızı, yavaş yaparama ritim 24 bpm ve 11 bpm arasındaki hızlarda devam ediyor. Soğutma bu düzeyde düşük kalp hızı önemli ölçüde intraoperatif kanamayı azaltır. LAD kolayca görülebilir ve bu sıcaklıklarda (Şekil 1) bağlanabilir. Vücut sıcaklığı 2 bpm veya asistoli kalp hızının düşürülmesi neden 9,6 ° C ve 4.9 ° C arasında ulaşana kadar LAD görünür kalır.
P1 LAD ligasyonu sonra, yavrular tamamen iyileşir ve yavru kontroller ile karşılaştırılabilir bir vücut boyutu büyür. Bir kez kendi üvey annesi ile geri yerleştirilir, yavruların yaklaşık 10 dakika içinde littermates karşılaştırılabilir farkındalık ve beslenme yetenekleri kazanmak. Histolojik inceleme 3 gün sonrası MI üzerine, iltihap hücreleri, tipik bir post-enfarktüs yanıtı (Şekil 2) infiltre ile enfarktüsü kanıt yoktur. gün 7 post-MI, sol ventrikül doku normal görünür. gün 21 sonrası MI tarafından, tam cardiac rejenerasyon meydana geldi.
4 boyanması 2,3,5-Triphenyltetrazolium klorür (TTC) - 6 saat post-MI MI tutarlı indüksiyon bir teyidi olarak kullanılmıştır. kırmızı alan canlı miyokard temsil eder ve beyaz alan iskemik ölü dokuyu temsil eder. 13 LAD ligasyon ameliyatları olmak üzere toplam, kalplerin% 100% 36 (Şekil 3) ortalama enfarktüs boyutu ile, infarkt idi. Evans mavisi perfüzyon ile TTC boyama da risk altında alana dayalı enfarktüs boyutunu (Şekil 4) infarkt dokusunun sebat göstermek ve ölçmek için 24 saat sonrası MI gerçekleştirildi. Bu kalplerinde, canlı miyokard, kırmızı risk lekeleri bölgeyi mavi lekeleri ve enfarktüs alanı beyaz demarcated edilir. Enfarktüs büyüklüğü riskli alanın bir yüzdesi olarak hesaplandı. 4 LAD ligasyon ameliyatlarında, kalplerin% 100 risk altındaki alanın% 49 ortalama enfarkt boyutu (Şekil 4) ile, infarkt idi.
<keep-together.within-page = "1"> enfarktüs indüksiyon, ekokardiyografi 24 ve 48 saat sonrası MI gerçekleştirilmiştir onaylamak için: fo p class = "jove_content". 24 saat sonrası MI anda, ejeksiyon fraksiyonu (EF) anlamlı% 74% 84 düşürüldü ve fraksiyonel kısalma (FS) anlamlı% 40 (Şekil 5)% 50'ye düşürüldü. kontrol içinde% 80 ile karşılaştırıldığında, kontrol grubunda% 50 ile karşılaştırıldığında, FS,% 25 önemli ölçüde azalır gibi 48 saat sonrası MI tarafından EF ayrıca% 46 düşürülmüştür. Bundan başka, 48 saat (Şekil 6), sol ventrikül sistolik iç çapı belirgin bir azalma oldu. LV ön duvar kalınlığı 24 veya 48 saat sonrası-MI azalmıştır anlamlı değildi (Şekil 5 ve 6).
Şekil 1. Koroner Arter Neonatal LAD Prosedürü. P1 yenidoğan fare af sırasında Görünür olduğunukoroner arter (LAD ön inen Sol dördüncü interkostal. A)) 'de ter hipotermik anestezi, cilt insizyonu, kas kesi ve lateral torakotomi görülebilir. BD) 11-0 naylon dikiş LAD bağlandı ortalarında ventrikül. E) geçirilir sırasıyla dikiş yeri. F) ve G) A büyütme) ve E) altında gözlendi gerçekleştirilen ağartma. Oks. LAD, tıkanan sol ön inen arter. LA, atrium bıraktı. LV, sol ventrikül. GCV büyük koroner damar. Beyaz ok, LAD. Siyah ok başı, aydınlatmadan parlama. Ölçek çubukları 1 mm'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Komple Hırka Şekil 2. KanıtYenidoğan Farelerde LAD Ligasyonu sonra ac Rejenerasyon. P1 farelerde LAD bağlanmasından sonra Masson trikrom boyama. enfarktüs alanlarda bütün kalpleri ve büyütme LAD bağlanmasından sonra 3 gün, 7 ve 21 gösterilmektedir. 3. gün sonrası MI (beyaz ok) infarkt bölgede sızmak miyosit kaybı ve inflamatuar hücre unutmayın. gün 7 sonrası MI başlayan Komple infarkt bölgesi rejenerasyon. fibrozis az kanıt gününde 21 MI sonrası da kaydetti. Ölçek çubukları 200, 100 ve 40X için 50 mikron olan, 200X ve 630X büyütme sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Yenidoğan LAD ligasyonu% 100 tekrarlanabilir olduğunu. A) 0.75 mm tepe parça oluşturmak için bütün kalp kesit hatları ve TTC için 1 mm orta taban parçasıboyama. B) TTC lekeli sahte kontrol ve LAD lige kalplerin Temsilcisi görüntüler. Ölçek çubukları 1 mm'dir. P1 yenidoğan farelerde 13 LAD ligasyonu C) Enfarktüs büyüklüğü. 6 saat post-MI ve TTC boyamadan sonra ölçülen infarkt - Kalpler 4 topladı. Kırmızı canlı miyokard belirtir; beyaz nekroz gösterir. Veriler ortalama ± SEM vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Yenidoğan LAD ligasyon Güvenilir İnfarktüsünde bulundu. P1 neonatal farelerde LAD bağlanmasından sonra iskemik alanın% 'si olarak A) enfarktüs boyutunu (n = 4). Kalpler 24 saat MI sonrası toplandı ve enfarkt boyutu Evans mavisi TTC lekelemesi sonra ölçüldü. Mavi canlı miyokard belirtir; Kırmızı risk altındaki alanı belirtir; beyaz n gösterirecrosis. Veriler ortalama olan ± SEM. B) LAD bağlanmasından sonra Evans mavisi ve TTC lekeli LAD lige kalplerin Temsilcisi görüntüler. Ölçek Bar = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
24 saat sonra kalp Bozukluklarında Şekil 5. Yenidoğan LAD ligasyonu Sonuçları post-MI. Kardiyak fonksiyon hem sahte işletilen ve LAD bağlandı fareler için ekokardiyografi. A) Temsilcisi M-mod görüntüleri ile değerlendirildi. Sonu diyastol ve son-sistol oklarla gösterilmiştir. B) diastolik ve sistolik hem de fraksiyonel kısalma, ejeksiyon fraksiyonu, sol ventrikül iç çapı ölçümü. Veri ± SEM. N = sham ve sırasıyla koroner arter ligasyonu (CAL) için 8 ve 7. * P <0. 05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
48 saat MI sonrası Kardiyak Bozukluklarında Şekil 6. Yenidoğan LAD ligasyonu Sonuçları. Kardiyak fonksiyon ekokardiyografi. A) ile değerlendirildi Temsilcisi M-mod, hem sahte için son diyastol (uzun oklar) ve son sistol (kısa oklar) gösteren görüntüler işletilen ve diyastol ve sistol hem de fraksiyonel kısalma, ejeksiyon fraksiyonu ve sol ventrikül iç çapı dahil ekokardiyografi ile LAD bağlandı fareler. B) Kalp fonksiyonel ölçümler. Veri ± SEM. N = sırasıyla, kontrol ve koroner arter ligasyonu (CAL), 4 ve 6. * P <0.05, ** p <0.01.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada gösterilen cerrahi LAD ligasyonu yenidoğan farelerde MI üretmek için güvenilir bir yöntemdir. Bu model memeli kalp rejenerasyon çalışması için hangi ile bir tekrarlanabilir model ile araştırmacılar sağlar. Koroner damarların görselleştirme doğru sütür yerleştirme sağlanması ve böylece tekrarlanabilirlik garanti Bu yöntemin önemli bir bileşenidir. Yetişkin farelerde poikilothermic yeteneklere sahip değilse de, vücut ısısı ve neonatal farelerde metabolizma hızı yakın ortam sıcaklığı ile ilişkilidir. Ayrıca, yenidoğan farelerin küçük boyutlu yüzey soğutma ile hipotermik indüksiyon için idealdir. Cerrahi ve fare vücut ısısını ve zamanlaması, prosedür kopyalayan doğruluğu için çok önemli olan ve bu nedenle dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir. Ligasyon kısa sürede torpor ulaştıktan sonra cerrahi başarıyı teyit miyokard sonrası ligasyon haşlama görselleştirmek için fırsat sağlar.
mu varMI indüksiyon teyit etmek için kullanılabilir ltiple yöntemleri. Bu TTC boyama, ekokardiyografi ve histolojik analizini içerir. TTC lekeleme, yeniden üretilebilir ve güvenilir ve kolay bir şekilde yüksek verimlilik ile gerçekleştirilen düşük maliyetlidir. Bu nedenlerden dolayı, TTC lekelemesi yaygın şekilde kullanılmıştır. Ekokardiyografi zamanla kalp fonksiyonları sonrası MI non-invaziv monitör değişiklikleri için kullanılabilir. MI bariz bir kanıtı, histolojik analiz ile gösterilebilir. Bu çalışmada, yukarıdaki tekniklerin her üç MI başarılı indüksiyon doğrulamak için kullanılmıştır.
LAD Görselleştirme başarılı MI indüksiyon için kritik öneme sahiptir. Araştırmacı zorluk (derin hipotermi indüksiyon olasılığı nedeniyle) LAD görselleştirme yaşanıyor LAD ana kök daha uzak kesimleri daha büyük ve daha kolay görülebilir olarak, sol kulak kepçesi, forseps ile hafifçe kaldırdı olabilir. LAD görüntülenmiştir edilemezse, araştırmacı arter lo tahmin olmamalıkatyon. Bu yavru deney ligasyon için kullanılmamalıdır ve sham kontrol işletilen çok kullanılabilir.
4. interkostal göğüs boşluğuna doğru giriş LAD ligasyonu için en uygun görselleştirme ve yer kazanmak önemlidir. Bu interkostal boşluk dikkatli sayımı ile elde edilebilir. kanama az miktarda işlemi sırasında meydana Buna ek olarak, steril bir gazlı bez ile temizlenebilir. Kanama önemli ise, ancak, cerrah muhtemelen yeterince işlemine başlamadan önce fare soğutmalı değil, ve daha fazla soğutma gereklidir. soğutma derecesi dikkatle koroner arter görselleştirmek için yaklaşık 20 bpm kalp hızını sağlamak için kontrol edilmesi gerektiğini unutmayın.
Nedeniyle yenidoğan farelerin küçük boyutu, yüksek çözünürlüklü ekokardiyografi kalp fonksiyonu analizi için net M-mode görüntüleri elde etmek için gereklidir. En iyi sonuçlar için, kalp hızı sağlamakHafif anestezi ile yaklaşık 400 bpm (0,5-1% izofluran inhalasyon) ve normal vücut ısısını korumak (ısıtmalı yuvası ve eko jel ısındı). Vücut sağ omuza doğru hafifçe eğik ise Görüntüler iyi elde edilir (~ 5 ° cranially ve 5 ° sağa doğru). Yeterli yankı jel sağlamak gürültüyü en aza indirmek için uygulanır.
Bu yaklaşım% 100 tekrarlanabilirlik sunuyor olsa da, enfarktüs boyutu bireysel yenidoğan anatomisini dallanma koroner arterde (Şekil 3) bağlı biraz değişken olabilir. Bunun bir sonucu olarak, daha yüksek n, farklı tedavi veya kardiyak rejenerasyona genetik manipülasyonlar etkisini belirlemede istatistiksel olarak anlamlı gerekebilir. Ancak, bu yaklaşım MI tamamen farklı olabilir yaralanma bu mekanizmaların patofizyolojisinde hem yenidoğan apeks rezeksiyonu ve cryoinjury üzerinde önemli avantajlar tutar ve böylece doğru yeniden olmayabilirMevcut insan MI 8,20. Bu yaklaşım daha doğrudan tipik insan yaralanma taklit ve memeli MI ortamda kardiyak rejenerasyon incelemek için kullanılabilir.
non-rejeneratif (yetişkin) arasında kalp yaralanma kurtarma mekanizmalarının farklılıklar çalışma için izin verir ve rejeneratif (yenidoğan) memeli miyokard olarak bu model benzersizdir. Örneğin, kalıcı yara oluşumu yetişkin fare MI model sonuçları. Ventriküler rüptür sıklıkla enfarktüs genişlemesi sonucu oluşur. Bu modelde (> 100 ameliyatları, yayınlanmamış veri) ile bizim deneyim, tam rejenerasyon 21 gün sonrası enfarktüs ve ventriküler rüptür gözlenmemiştir açıktır. Bu modelin kullanımından tahakkuk bilgiler erişkin kalp rejenerasyonu teşvik edebilir mekanizmalar yeni bakış açıları sunabilir.
Son kanıtlar kardiyomiyosit çoğalması kalp rejenerasyon 9 büyük katkıyı olduğunu belirtir 4,21 kritik düzenleyiciler olarak tespit edilmiştir. Burada sunulan protokolü kullanarak daha fazla araştırma kardiyak rejenerasyon sonrası MI uyarılması için terapötik hedefler işaret edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
