Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Abstract

Anastasis (Yunanca "hayat yükselen" için) sayede hücreler ölüyor genellikle özünde geri dönüşümsüz olarak kabul edilir son aşama hücre ölüm işlemleri tersine çevirebilirsiniz bir yeni keşfedilen hücre kurtarma olgudur. Anastasis teşvik ilke kurtarma yaralı ya da koru içinde cardiomyocytes veya nöronlar, böylece doku kurtarma kolaylaştırmak gibi değiştirmek zor olan hücreler. Diğer taraftan, kanser hücre ölümü emin olun ve nüks olasılığını azaltmak sonra anti-kanser tedavileri, Apoptozis geçiren anastasis kanser hücrelerinde bastırmak. Ancak, bu çalışmalar anastasis Canlı hayvanlarda tabi hücre kaderi izleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Morfolojik normal görünümlerini kurtarma sonra rağmen hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreleri tanımlamak için mücadeledir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz Drosophila ve tanımlamak ve kalıcı olarak anastatic hücreleri içinde vitro veya vivo içindeizlemek memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemleri geliştirdik. Burada, üretimi ve CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı sistemini algılamak ve hücre ölüm bizi canlı tutan geçici maruz kaldıktan sonra anastasis Drosophila melanogaster içinde izlemek için in vivo protokolleri mevcut. Geleneksel biyosensörler ve protokolleri hücreleri aktif olarak geçiren apoptotik hücre ölümü etiketleyebilirsiniz iken, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sonra caspase etkinleştirme - son aşama apoptosis, damgasını iyileşti hücreleri kalıcı olarak etiketleyebilirsiniz ve aynı anda etkin apoptotik süreçleri tanımlamak. Bu Biyoalgılayıcı da diğer formları doğrudan veya dolaylı olarak caspase etkinliği söz konusu hücre ölümü çalıştı hücre kurtarma izleyebilirsiniz. Bu nedenle, bu iletişim kuralı sürekli bu hücreler ve biyolojik işlevleri, moleküler mekanizmaları, fizyolojik ve patolojik sonuçları ve tedavi edici etkileri gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak onların döl kaderi takip etmemizi sağlar Anastasis. Biz de bu apoptotik sigara caspase aktivite içinde vivogörüntüleyen anastasis geçmesi hücreleri ayırt etmek için uygun kontrollerin tartışıyorlar.

Introduction

Programlanmış hücre ölümü Apoptozis gibi çok hücreli organizmalar1,2,3, yaralı, istenmeyen veya tehlikeli hücrelerde ortadan kaldırarak embriyonik geliştirme ve normal homeostazı önemli bir rol oynar. Hücre ölüm ve yaşam arasında denge kaybı kanser, kalp yetmezliği, otoimmünite ve dejenerasyon4,5,6,7,8gibi ölümcül sonuçlara yol açabilir. Caspases geleneksel olarak "dönüş yok" apoptoz9,10,11, olarak kabul edilmiştir Cellat aktivasyonu hızlı ve büyük hücresel yıkım12tetikler, 13,14,15,16. Bu genel dogma zorlu, kültürlü ölmekte olan Primer hücre ve kanser hücrelerinin değil sadece caspase harekete geçirmek, ama aynı zamanda aşağıdaki önemli hücre sonra plazma zarı blebbing, hücre büzülme de dahil olmak üzere ölüm işaretlerinden kurtarabilirsiniz gösterdi, Mitokondrial parçalanma, mitokondrial sitokrom c yayın sitozol, nükleer ve Kromatin yoğunlaşma, DNA hasarı, nükleer parçalanma, içine hücre yüzey teshir edilmesi Fosfatidilserin (PS) ve apoptotik organları oluşumu 17 , 18 , 19 , 20 , 21. ölen hücreleri hücre ölüm uyaranlara17,18,19,20, kaldırdıktan sonra kurtarabilirsiniz olarak önerdiğimiz bu anastasis bir iç hücre kurtarma olgu olduğunu 21. dönem "Anastasis" (Αναστάσης)18"için Yunanca olarak hayata yükselen" anlamına gelir, icat bu beklenmedik hücre kurtarma fenomeni açıklamak. Anastasis bizim gözlem daha sonra Fosfatidilserin dışa22,23,24, mitokondrial sınırlı da kurtarma hücre ortaya son bağımsız çalışmalar tarafından desteklenen dış membran permeabilization25, karışık soy kinaz benzeri aktivasyon (MLKL) ve hücre büzülme26.

Anastasis düzenleyen mekanizmalar karakterize paradigma kayması fizyolojik, patolojik ve tedavi edici etkileri olacaktır. Anastasis kurtarmak ya da ventrikül sol ventrikül kaldırarak önemli postmitotic hücreleri ve değiştirmek zor olan doku ve muhtemelen kalp yetmezliği tersine çevirme için hesabı korumak için daha önce bilinmeyen cytoprotective mekanizma temsil edebilir aygıtlar (LVADs)27,28, kurtarma sonra aşırı ışık29,30,31geçici pozlama veya onarım nöronların photoreceptor hücrelerinin beyin yaralanması32sonra yardımcı. Öyleyse Anastasis teşvik hücre ve doku kurtarma geliştirmek. Diğer taraftan, anastasis kanser nüks17,18neden terapi, hücre ölüm neden hayatta kalmak için kanser hücreleri tarafından kullanılan bir beklenmeyen kaçış taktik olabilir. Bu nedenle, anastasis kanser hücrelerinin sırasında ölüyor ve kanser tedavisi yanında onların nüks önleme kanser tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi olabilir sonra bastırmak.

Anastasis işlemi sırasında biz bulduk kurtarılan bazı hücreler kalıcı genetik değişiklikler satın aldı ve oncogenic dönüşüm uygulandı, DNA hasar nedeniyle büyük olasılıkla apoptosis18,20sırasında,21 tahakkuk . DNA zarar görmüş hücreleri ölüm sürecinin tersine tumorigenesis bir mekanizma olabilir, özofagus kronik termal yaralanma indüklenen gibi potansiyel olarak doku yaralanması tekrarlanan gözlem altında yatan dokuları, çeşitli kanser riskini artırır çok sıcak içecekler33,34,35, alkolizm36,37nedeniyle karaciğer hasarı, tümör evrim tüketimi ise kanser terapisi38, sonra tarafından 39,40ve anti-kanser tedavisi41,42,43,44 döngüleri arasındaki aralıkları sırasında ortaya çıkan normal dokuların üzerinden yeni kanser gelişimi . TRUE ise, anastasis hedefleme önlemek ya da kanser gelişme ve ilerleme tutuklandı. Biz ölmekte olan germ hücreleri açlıktan kaynaklı anastasis yeniden beslenen Drosophila19geçmesi bulduk.  Germ hücreleri DNA hasarı Anastasis ortaya çıkarsa, hesap çevresel stres uzun süreli gözlem için genetik hastalıklar gelişimini destekler olabilir. Örneğin, kıtlıklar diyabet ve Koroner kalp hastalıkları45gibi transgenerational devralınabilir hastalıkların gelişmesine katkıda bulunmak. Bu nedenle, anlayış anastasis devralınabilir hastalıklar bu potansiyel mekanizması tarafından neden geliştirme önleme stratejileri neden olabilir.

Anastasis keşfi koşum ve yenilikçi tedaviler geliştirmek için doğrudan için sebep ve sonucu anastasis Canlı hayvanlarda eğitim esastır. Ancak, bu teknik olarak tanımlamak ve anastatic hücreleri vivo içindeçünkü hücre ölüm işlemi kurtarılan hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez görünür ve hiçbir biyomarker anastasis izlemek için zordur tespit henüz17,18,21. Biz son zamanlarda yeni bir in vivo caspase Biyoalgılayıcı tanımlamak ve sonra caspase harekete geçirmek19,46, Apoptozis hayatta hücreleri izlemek için "CaspaseTracker"19, Özel Sigara İçilir bu sorunları çözmek için geliştirilen Hallmark apoptosis10,14. SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 ve iCasper52 gibi "gerçek zamanlı" caspase biyosensörler dan ayırt devam caspase aktivite algılayan, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı, ayrıca kalıcı olarak hücreleri bu hızlı caspase etkinliği bile geçici etiket yeteneği sahiptir. Bu nedenle, caspase-aracılı ters hücre sonra ölüm süreci içinde vivoCaspaseTracker Biyoalgılayıcı anastasis uzun vadeli izlenmesini sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) CaspaseTracker Biyoalgılayıcı hazırlanması uçar

  1. CO2sinekli anestezi ve sinek yiyecek ve taze Maya yapıştır ile aynı şişe içinde 7 ila 10 caspase duyarlı Gal4 (DQVD)19 bakire kadın ve 7 10 G-izleme53 Gal4 muhabir genç erkek sinek (veya tersi) aktarmak için bir fırça kullanın.
    Not: Çapraz Caspase duyarlı (DQVD) Gal4 ve G-izleme Sineklerin Tanrısı CaspaseTracker döl sinekler üretecek. Caspase - duyarlı (DQVA)'19 Gal4 çapraz ve G-izleme sinekler (konuya bakın) negatif kontrol uçar sağlayacaktır. Taze Maya Yapıştır o döl sayısı artar bu yüzden yumurta üretimi, geliştirmek için protein kaynağı olarak hizmet vermektedir. Bakire kadın ve genç erkek sinek onların fenotipleri54göre seçin.
  2. Sinekler, 18 santigrat derece (oC) sırasında çapraz için 3-7 gün kuluçkaya ve sonra yeni bir çapraz 18 ° C'de ayarlamak için yeni bir şişe için sinekler aktarın Döl eclose uçar kadar 18 ° C'de orijinal şişe kuluçkaya devam'i tıklatın.
    Not: Üst sinek özgün flakon, döl, aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeleri aktarın. Üst sinek döl taze yiyecek ve Maya salçası ilk 2-3 anahtarları oluşturabilir ve sonra verimliliği önemli ölçüde zamanla azalacak. Sinekler yükselterek 18 ° C CaspaseTracker Biyoalgılayıcı non-spesifik sinyal azaltabilir (konuya bakın).
  3. Seçme döl ile doğru fenotipleri54 aşağıdaki deneyler için uçar.
    Not: Burada transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme CyO dengeleyici ile dengeli ikinci kromozom bulunur. Her iki transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme olan kıvırcık kanat döl (olmadan CyO) seçin.

2) uygulama geçici hücre ölüm indüksiyon CaspaseTracker Biyoalgılayıcı uçar

  1. 10 eclosed erkek taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile yeni bir şişe için 1 gün için 18 ° C'de yumurta odası üretimi oogenesis tarafından izin vermek için uçar-20 yeni transfer.
    Not: Dişi erkek sinek ile tutmak yumurta odası üretimini artırmak.
  2. Soğuk şok Apoptosis geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler sonra-7 ° C için 1 h yerleştirilmiş olması yeni boş şişe aktarın.
    Not: soğuk şok kişi yaralandı hücreler plazma zarı yırtılması55,56inducing tarafından.
  3. Apoptozis protein açlık tarafından geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler 18 ° C'de % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe 3 gün boyunca aktarın.
    Not: Protein açlık (protein olmayan gıda) yumurta chambers apoptosis57,58,59 ve autophagy60,61geçmesi tetikleyebilir. Sinekler sinek gıda Sükroz en iyi durumu tutmak için her gün % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe geçin.
  4. Stresli sinekler geri yeni bir şişe taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile onları kurtarmak izin vermek için 18 ° c 3 gündür aktarın. Aç ve yumurtalıkların yumurta odalarından açıklanan62elde etmek için açlıktan kurtarılan sinekler incelemek.
    Not: Kopyalayabilmek Drosophila yumurtalık elde etmek için sinekler CO2, anestezi ve forseps 2 Çift sinek baş kaldırmak için kullanın ve forseps Bankası yumurtalık "Sineklerin Tanrısı" kaldırmak için karın çekmek için kullanın.

3) fiksasyon ve disseke yumurta odalarının görüntüleme için boyama

  1. 0.5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çevresinde disseke yumurta chambers ile birlikte 1 mL santrifüj tüpleri için transfer. Yumurta yerleşmek izin verir.
    Not: Plastik pipet ipuçları %1 sığır serum su veya yumurta odaları ipuçları plastik yüzeyde sopa önlemek için PBS çözünmüş albumin (BSA) ile kat. Karanlıkta photobleaching kırmızı floresan protein (RFP, DsRed olarak da bilinir) önlemek için aşağıdaki yordamları gerçekleştirin ve yeşil flüoresan protein (GFP) yumurta odalarında.
  2. Pipetting tarafından PBS kaldırın ve sonra 0.5 mL % 4 paraformaldehyde 20-30 dk için karanlık oda sıcaklığında yumurta chambers düzeltmek için PBS içinde geçerlidir.
    Not: Bu ve aşağıdaki kuluçka adımları nazik döndürme uygulama.
  3. Pipetting tarafından paraformaldehyde kaldırın ve sonra yumurta odası 0.5 mL PBST ile yıkanmış (PBS + %0,1 Triton X-100) için 3 kere.
    Not: Uzun süreli fiksasyon RFP ve GFP sinyalleri azaltmak olabilir.
  4. PBST ile yumurta salonları, oda sıcaklığında 1-2 h için kuluçkaya veya bir yumurta Chambers'ı permeabilize için nazik döndürme ile 4 ° C'de gece.
    Not: PBST Ayrıca BSA sigara kaplı plastik yüzey sopa yumurta chambers kaçının.
  5. Pipetting tarafından PBST kaldırın ve daha sonra mavi nükleer Höchst boya PBST 10 μg/mL 0.5 mL yumurta salonları çekirdeği için leke için oda sıcaklığında 1-2 h için geçerli.
    NOTE1: Bu non-spesifik sinyal artacak gibi nükleer boya ile uzun süreli kuluçka kaçının.
    NOT2: Çekirdeği Höchst olmadan leke için alternatif yaklaşımdır 200 eklemek μL anti-beyazlatma DAPI montaj aracıyla (malzemeleri görmek) ve protokol 3.8 açıklandığı gibi cam kapak fişinde dokular Montaj önce gecede63, kuluçkaya.
    NOTE3: photobleaching önlemek için karanlıkta boyama ve aşağıdaki yordamları gerçekleştirin.
  6. Pipetting tarafından nükleer boya kaldırmak ve 0.5 mL için 10-20 dk kuluçka her yıkama adım arasında nazik rotasyon ile ile 3 kere 1 mL santrifüj tüpleri yumurta odasında yıkamayı PBST uygulayın.
  7. İyi pipet ile tüm PBST kaldırmak ve sonra uygulamak 200 μL anti-beyazlatma montaj ajan (tüp altına yumurta chambers lavabo kadar yumurta odaları 3 h için oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de kuluçkaya için bkz: belgeleri).
    Not: tam montaj Ajan absorbe doku tüpün dibine lavabo.
  8. 200 μL anti-beyazlatma ile aktarmadan tarafından lekeli yumurta chambers mount Ajan pipetting tarafından görüntüleme için önceden temizlenmiş cam slayt üzerindeki montaj yumurta Odaları bir 20 x 20 mm önceden temizlenmiş cam kapak notu ile kapak ve koyarak cam kaymak kapak fişinde mühür tırnak cilası kapak notu kenarında.
    NOTE1: Cam slayt ve kapak kayma su ya da % 70ini etanol ile önceden temiz.
    NOT2: Vazelin cam slayt ve yumurta chambers tarafından overcompression yok önlemek için kapak Not arasında geçerlidir.
  9. Floresan veya 20 x NA 0,8 kullanarak confocal mikroskop kullanarak yumurta chambers görüntü planı-Apochromat amacı, nükleer boyama için uyarma ışık dalga boyu 405 nm ile (emisyon ~ 461 nm algılama), 561 nm RFP (devam eden veya son caspase aktivite) sinyal () için emisyon ~ 590 nm algılama) ve 488 nm GFP (geçmiş caspase aktivite) sinyal için (emisyon tespit ~ 518nm).
    Not: Yayımlanmış protokolümüze mikroskobu20,64için bkz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hızlandırılmış canlı cep mikroskobu yolu anastasis kültürlü hücreleri20için güvenilir bir yöntem olmakla birlikte, kurtarılan hücreleri morfolojik ayırt edilemez görüntülendiðinden hangi hücrelerin anastasis hayvanlarda, uğramıştır tanımlamak zordur hücre ölümü teşebbüs değil normal sağlıklı hücreler. Örneğin, yanıt olarak hücre ölümü Apoptozis1,2,14, hücre büzülme, nükleer yoğunlaşma ve plazma zarı blebbing gibi morfolojik işaretlerinden insan servikal kanser HeLa hücreleri görüntülemek uyarıcı 1µM staurosporine17 (şekil 1A, şekil 1B i-II). Hücre ölüm uyarıcı ve kuluçka taze ortamda çıkardıktan sonra ölen hücreleri hücre ölüm süreci anastasis17,18tarafından morfolojik kurtarma (şekil 1B III-IV), tarafından belirtildiği şekilde tersine yayılması (şekil 1B v-VI) tarafından takip. Önceki çalışmalarımız de sonra caspase harekete geçirmek18,20ApoAlert (NES-DEVD-YFP-apoptosis iptali göstermek için NLS) gibi "gerçek zamanlı" caspase biyosensörler kullandık. Bu Biyoalgılayıcı sağlıklı hücrelere (şekil 1 c, 1 D ben) sitozol yerelleştirir. Hücre ölüm uyarıcı % 3.7 etanol tarafından tetiklenen caspase harekete geçirmek bu YFP tabanlı Biyoalgılayıcı i caspases tarafından ciddi ve nerede o birikir ve elde edilen nükleer floresan YFP etiketinin adıyla devam ile hücreleri tanımlayan çekirdeği, translocated caspase etkinliği (1 C rakam, 1 D II-III). Ölen hücreleri de sırasında etanol-indüksiyon1,14,18,20, borulu mitokondri, nükleer parçalanma gibi Apoptozis morfolojik işaretlerinden görüntülemek yoğunlaşma, hücre büzülme ve plazma zarı blebbing (şekil 1 d II-III). İlginçtir, hücre ölüm uyarıcı kaldırıldıktan sonra aynı hücreler yeniden elde etmek ve normal morfoloji (şekil 1 d IV-VIII) yeniden elde etmek. Özellikle, ApoAlert (Biyoalgılayıcı i ciddi) nükleer Floresans öldü (şekil 1 d IV-VIII) kurtarılan hücrelerdeki 1 saat içinde muhtemelen anastatic hasarlı bileşenleri ortadan kaldırmak benzer işlemler nedeniyle18 hücreleri , i ciddi caspase-3, PARP ve Apoptozis sırasında oluşturulan ICAD gibi. Bu nedenle, yeni bir strateji anastasis daha uzun bir zaman dilimi içinde özellikle vivo içindeizlemek için gereklidir.

Anastatic hücreleri kaderi izlemek için kalıcı olarak hücreleri tarafından Cellat caspase faaliyet i ciddi sonra etiketleri memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemi geliştirdi. Bu Biyoalgılayıcı bir caspase duyarlı rtTA (ters tetrasiklin kontrollü transactivator) ve Cre-LoxP tabanlı muhabir rtTA etkinliği (şekil 2A-B) için oluşur. Hiçbir caspase etkinlik ile sağlıklı hücreleri içinde transactivator rtTA65 plazma zarı çapa (Lyn11)66,67için çekirdek dışlama sinyal (NES) harita kinaz kinaz (MAPKK)68, gergin ve östrojen reseptör varyant (ERT2)69 caspase yarilabilir (DEVD)70 bağlayıcı aracılığıyla elde edilen PARP (şekil 2A, 2B). Hayvan zinciri rtTA sitozol çekirdek için translocate olamaz gibi rtTA muhabir etkinleştiremezsiniz. Ancak, yanıt olarak bir hücre ölüm uyarıcı harekete geçirmek caspases çekirdeği (şekil 2B) translocate rtTA boşaltma DEVD halkalı ayırmak. Bir kez çekirdeğinde, rtTA tet yanıt öğesi (TRE) ve tetikleyiciler geçici ifade stop kodonu kaset CAG organizatörü ve kodlama dizileri arasında kaldırır bir geri dönüşü olmayan rekombinasyon olay yol açar Cre recombinase bağlar Kırmızı floresan protein (DsRed). DsRed (şekil 2B), caspase etkinlik, aynı zamanda onların döl (şekil 2C) yaşamış sonra hayatta kalabileceği hücreleri kalıcı floresan marker olarak hizmet veren kalıcı ifade sonuçlanır.

Memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı test etmek için biz tarafından geçici transfection HeLa hücreleri tanıttı, bir hücre ölüm uyarıcı (1µM staurosporine) hücrelerle tedavi ve yaptığımız gibi hücre kurtarma hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu tarafından izlenen 20nitelendirdi. RtTA etkinlik65,71izin vermek için gerekli olan Doksisiklin (1µg/mL nihai toplama), deneme boyunca Biyoalgılayıcı açmak için hücre kültür orta eklendi. Hücre ölüm uyarıcı yanıt olarak, işlem görmüş hücreleri Apoptozis hücre büzülme ve plazma zarı blebbing beklenen (şekil 2B i-III) olarak da dahil olmak üzere, işaretlerinden görüntüler. Hücre ölüm uyarıcı kaldırdıktan sonra hücre katmanı bir kez ve ekleme taze kültür orta, anastasis durulama normal morfoloji (şekil 2B IV-VII) geri tarafından belirtildiği gibi ölmekte olan hücrelerdeki görülebilir. Eden, onları hem sigara kurtarılan hücreleri (şekil 2B IV-VII) ve kontrol hücreleri ayrım DsRed floresan işaretçiyi sırasında ve sonrasında anastasis (şekil 2B IV-VII), hücreleri express yalnızca yeniden elde etmek hücre ölüm uyarıcı (şekil 2E) maruz bırakılmamalıdır. Bu uygulama ve memeli CaspaseTracker programı belirlenmesi ve kalıcı olarak caspase-aktivasyon kurtarma anastatic hücreleri etiketleme yeni bir roman araç olarak gösterir ve izlemek ve daha uzun vadeli kaderlerini çalışma için bir yol sağlar.

Algılamak ve canlı hayvanlarda anastasis izlemek için CaspaseTracker Biyoalgılayıcı Transjenik hayvanlar gereklidir. Bu nedenle, biz ilk Drosophila melanogaster bir model sistem19, çünkü kullanılan önemli bir genetik olarak uysal canlı hayvan geliştirme ve insan hastalıkları72,73,74 çalışma için olduğu gibi ,75. Memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı değiştirilmiş olarak Drosophila çift Biyoalgılayıcı tanımlamak ve "son/caspase etkinlik"geçmiş"devam" dan ayırt. Bu ikili Biyoalgılayıcı caspase duyarlı Gal419ve Gal4 muhabir G-izleme53 (şekil 3A) oluşur. Etkinlik içermeyen caspase hücrelerde, Maya transkripsiyon faktörü Gal4 DIAP1 türetilmiş bir caspase yarilabilir bağlayıcı (DQVD) üzerinden bir plazma zarı çapa (mCD8) etki alanına hayvan zinciri (şekil 3B), yıkımı önlemek için 21NN/GV22 mutasyon sahip drICE caspase inhibitör işlevinde BIR1 etki alanı77kaldırılması için bağlayıcı afterAsp2076ve D135R mutasyon caspase bölünme üzerine N uç kuralı tarafından Gal4. Hayvan zinciri Gal4 caspase tarafından serbest bırakmak için bölünme olmadan çekirdeği için translocate olamaz, Gal4 muhabir G-izleme yok caspase etkinlik19sahip hücrelerde devre dışı kalır. Caspase harekete geçirmek, ancak, aktif caspases Gal4 G-izleme gazeteci (şekil 3A)19etkinleştirmek için çekirdek translocate azat DQVD bağlayıcı ayırmak. Gal4 için özel bağlar akıntıya karşı Gal4 kadar son veya geçerli caspase aktivitesinin floresan muhabir olarak hizmet veren dizileri (UAS) geçici transkripsiyon ve teklif toplama, ifade tetiklemek için etkinleştirme (caspase) etkinliğini durdurur ve sonra RFP proteindir bozulmuş. Gal4 da stop kodonu kaset Ubikuitin (UBI) organizatörü ve bir kodlama dizisi arasındaki çekirdeği hedefli GFP (nucGFP) kaldırır rekombinasyon olay önde gelen FLP recombinase transgene üzerinden ifade tetikler. Bu, hayatta kalmak ve caspase aktivite yaşamış hücreleri kalıcı marker olarak hizmet veren nucGFP, kalıcı ifadesi olur.

Apoptozis ve anastasis algılamak için Drosophila CaspaseTracker Biyoalgılayıcı test etmek için in vivo, erkek uçar CaspaseTracker tabi fizyolojik stres (şekil 3 c), hangi-ebilmek etkili bir şekilde19, soğuk şok gibi Tetikleyici hücre ölümü, caspase harekete geçirmek, nükleer yoğunlaşma ve hücre büzülme19,78ve membran bütünlüğü kaybı ve sitoplazmik kaçağı neden olan soğutma nedeniyle nekroz tarafından da belirtildiği gibi Apoptozis de dahil olmak üzere içeriği55,56. Beklendiği gibi CaspaseTracker yumurta etkinleştirilemedi nerede strese bağlı hücre ölümü değildi odaları kontrol uçar (şekil 3D) indüklenen. Buna ek olarak, stresli sinekler yumurta odaları soğuk şok sonra bir gün sadece karakteristik apoptotik hücre büzülme ve nükleer yoğunlaşma, ama aynı zamanda RFP ve GFP ifade, son varlığını gösteren veya (RFP +) devam ve son (GFP +) caspase gösterdi aktivite (şekil 3E). Ancak, 3 gün normal durum sigara vurgulayarak, GFP ama hiçbir RFP için stresli sinekler döndükten sonra kurtarılmış yumurta chambers (şekil 3F) ifade algılandı. Bu stres takip caspase aktivite dile getirmişti yumurta chambers hücre ölüm süreci aşmak ve hayatta mümkün olduğunu gösterir.

Daha fazla yumurta odaları19' reversibility hücre ölüm sürecinin sınamak için CaspaseTracker dişi sinekler % 8 Sükroz %1 agar 3 gün boyunca besleniyor sonra protein açlık tarafından vurguladı. Önceki çalışmalar gösterdi protein açlık caspase-aracılı Apoptozis ve somatik ile dokularda autophagy tetikleyebilir ve germ hücreleri, yumurta chambers57,60,61de dahil olmak üzere. Beklendiği gibi CaspaseTracker protein açlık (şekil 3 g) 3 gün sonra yumurta odasında çalıştırıldım. Ölmek üzere olan yumurta chambers apoptotik türleri morfoloji ve ifade son veya devam gösteren RFP ve GFP Biyoalgılayıcı işaretleri, (RFP +) ve (GFP +) caspase etkinliği (şekil 3 g) geçmiş sergiledi. CaspaseTracker önce caspase harekete geçirmek bir ölüm uyarıcı sonra karşılaştığınız kurtarılan hücreleri izleyebilirsiniz göstermek için yıldız sinekler sonra protein içeren normal sinek yemek için transfer edildi. Beklendiği gibi bu yeniden beslenen sinekleri kurtarılan yumurta odaları yok son veya devam eden caspase etkinliği (şekil 3 H) gösteren RFP geçici caspase muhabir yok. Ancak, normal gıda döndürerek stres giderici olduğunu belirten GFP caspase muhabir (şekil 3 H), hücrelerin bu yumurta odasında göstermesinden sonra bu sinekler yumurta odasında başlatılan hücre ölüm bir noktadan sonra bu ters bir işlemdir caspase harekete geçirmek. CaspaseTracker Biyoalgılayıcı faaliyet caspase tarafından tetiklenir doğrulama hangi caspase ayırmak değiştiremiyor ve hangi Biyoalgılayıcı etkinliği (şekil 3B, 3I kaldırılması DQVA, sıra ile göğüs arası sıra DQVD değiştirerek elde edildi ).

Drosophila CaspaseTracker protein açlıktan kurtarıldı sonra bulduk (folikül) somatik hücreler gibi yumurta odalarında ve germline hücreyi (hemşire hücreleri ve yumurta), birden çok türde GFP, ancak değil RFP (şekil 3J görüntülenen ) bu hücreler caspase harekete geçirmek sonra anastasis geçirmek için gösteren19,. İlginçtir, GFP da aynı ovariole zinciri onun ilişkili yumurta odasında birlikte kök hücre içeren germarium (şekil 3J)19hücrelerde etiketli. Bu nedenle, bu GFP pozitif yumurta odaları hücre ölüm işleminden caspase harekete geçirmek sonra iyileşti kök hücrelerden elde edilmiş. Önemlisi, aç ve yeniden beslenen dişi döl sinekler19GFP ifade etmek,-ebilmek üretmek yatıyordu verimli yumurta caspase harekete geçirmek Görünüşe göre normal işlevini yeniden elde edebilirsiniz sonra potansiyel olarak hücreleri hücre ölüm bu ters bir işlemdir olduğunu düşündüren uçar. Gelecekteki çalışmalar anastasis sonucu olarak hayatta döl sinekler kalıcı sekel sergiler belirlemek için ihtiyaç vardır.

Figure 1
Resim 1 . Kurtarma HeLa hücreleri hücre ölüm indüksiyon sonra.
(A)hücre ölümüne neden ve daha sonra hücre hücre ölüm uyarıcı çıkarıldıktan sonra kurtarmak için ölmek izin yaklaşım şematik diyagramı.
(B) hızlandırılmış canlı hücre DIC mikroskobu sağlıklı HeLa hücre (Ben), (II), 1µM staurosporine ile tedavi sonra hücrelerinin aynı grup ve sonra yıkanmış ve daha fazla taze kültür ( staurosporine kaldırmak için orta ile inkübe III-vi). Beyaz ok hücre bölünme gösterir.
(C) caspase Biyoalgılayıcı füzyon protein NES-DEVD-YFP-NLS şematik diyagramı ve hücre ölüm indüksiyon sırasında ve sonrasında anastasis YFP hücre altı yerelleştirme.
(D) hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu bir HeLa hücre sırasında pozlama % 3.7 etanol (II - III) ve sonra (ben), daha önce caspase Biyoalgılayıcı füzyon protein NES-DEVD-YFP-NLS ifade etanol kültür ortamından (IV - VIII) kaldırma. Burada gösterilen (yeşil Floresan, üst satır); caspase Biyoalgılayıcı sadece görüntüleri vardır birleştirilmiş Höchst lekeli çekirdeği (mavi floresan) ve mitokondri (kırmızı Floresans) görüntüleri (orta sıra), ve orta sıra Albümdeki daha fazla DIC görüntüleri (alt satır) ile birleştirilir. Üst satırdaki beyaz okları nükleer yerelleştirilmiş YFP gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemi.
(A) caspase duyarlı rtTA şematik diyagramı.
(B) memeli CaspaseTracker rtTA Biyoalgılayıcı sistemi şematik diyagramı.
(C) anastasis algılamaya CaspaseTracker rtTA Biyoalgılayıcı sistemini kullanarak akış çizelgesi. Kırmızı/Sarı üçgen (geçerli hücre ölüm uyarıcı) ve yeşil/mavi (yıkama uyarıcı kapalı) sembollerdir şekil 1Aolduğu gibi.
(D) hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu HeLa hücreleri memeli CaspaseTracker rtTA Biyoalgılayıcı (ben), daha önce ifade bir küme ve pozlama için 1µM staurosporine (II - III) ve çıkardıktan sonra sırasında staurosporine kültür ortamdan (IV - VII). DIC ve DsRed sinyalleri birleştirilmiş görüntüler. Oklar hücre 1 (sarı) belirtmek ve 2 (yeşil) hücre.
(E) hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu tedavi edilmezse Biyoalgılayıcı ifade HeLa hücre. DIC ve DsRed sinyalleri birleştirilmiş görüntüler. Beyaz okları sayesinde bunun bölünen hücreler gösterir.
Doksisiklin (1ug/mL) panelleri (D) ve (E)gösterilen deneyler boyunca orta mevcuttu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Drosophila CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı sistemi. (İzni gelen Tang vd., bilimsel raporlar 2015, 9:9015 ile kabul 19 ).
(A) Drosophila CaspaseTracker Gal4 Biyoalgılayıcı sistem şematik diyagramı.
(B) şematik diyagramı caspase duyarlı (DQVD) ve caspase-duyarlı kontrol (DQVA) Gal4.
(C) Drosophila yumurtalık ve hücre ölüm-indüksiyon 1 bayat sinekler, normal durum 3 gün iyileşme ardından içinde için akış şeması. Darren Obbard tarafından sağlanan drosophila görüntü.
Bir kadın Biyoalgılayıcı sinek yumurtalık gelen yumurta chambers (D) temsilcisi confocal görüntüsünü 6 gün (tedavi edilmezse) normal sinek gıda ile beslenen.
(E) yumurta odalarının bir soğuk şok kadın Biyoalgılayıcı sinek yumurtalık üzerinden temsilcisi confocal Resim-7 ° c için 1 h yerleştirilir ve sonra normal kültür durumu 1 günde (soğuk şok, CS) için açık.
(F) panelinde E dışında soğuk şok sinekler gibi normal kültür durumu 3 gün (CS sonra kurtarılan) için açık.
(G) temsilcisi confocal görüntü odaları aç bir kadın Biyoalgılayıcı yumurtalık üzerinden uçmak yumurta %1 agar protein olmadan % 8 Sükroz ile 3 gündür (Aç) beslenen.
(H) panelinde G dışında tedavi sinekler gibi protein açlık muamele (yeniden beslenen) sonra 3 gün boyunca normal sinek yemek için açık.
(I) negatif kontrol hizmet hassas CaspaseTracker (DQVA) kadın Biyoalgılayıcı sinek caspaseaçlıktan gösterilen dışında G paneli gibi.
(J) aç ve yeniden beslenen kadın Drosophilagelen yumurta chambers temsilcisi confocal görüntüsü. Oklar nükleer GFP hemşire hücreleri (siyah), yumurta (beyaz) ve folikül hücreleri (sarı) yumurta odalarının ve germarium (yeşil) ifade gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Anastasis fizyolojik, patolojik ve tedavi edici etkileri. (İzni gelen Tang vd., F1000Res 2017, 6:43 ile kabul 21 ). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı bir roman ve son olarak algılanmasını sağlayan benzersiz araç veya devam eden caspase etkinliği ve hücre ölümü ters hücre izleme işlemek ve caspase etkinlik içinde vivoettikten sonra hayatta kalmak. Caspase aktivite geleneksel apoptosis damgasını kabul ederken, apoptotik sigara caspase etkinlik düzenleme nöronal aktivite79, , gibi çeşitli normal hücre fonksiyonları potansiyel rolleri oynar büyüyen çalışmalar ortaya çıkarmak 80, öğrenme ve bellek81,82,83,84, necroptotic hücre ölüm85,86, spermatid kişiselleştirme87bastırılması, 88,89, Hücre proliferasyonu90ve91biçimlenme hücre kader işleme mikroRNA. Apoptozis ve anastasis ek olarak, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistem bu nedenle beyin ve optik loblar, cardia, gut, Malpighi tübüllerin, Trakea, kas ve diğer dokuların mevcut olmayan apoptotik caspase etkinlik algılayabilir Drosophila19,46,64. Bu Biyoalgılayıcı sinyal geçerli veya son anastatic aktivite embriyo geliştirme veya bu dokuların normal homeostazı sırasında temsil edebilir. Sonra geçici hücre ölüm-inducing çevresel stres Canlı hayvanlarda Anastasis çalışmaya kurcalayarak bu normal fizyolojik koşullar altında caspase Biyoalgılayıcı aktivite sergilemek, ama bu caspase geçmesi bağlı olmak hücreleri seçmek için önemlidir geçici hücre ölüm indüksiyon tarafından harekete geçirmek. Onlar genellikle germarium sahne 10 yok caspase faaliyete oogenesis58,59,92sırasında çünkü yumurta chambers bu amaç için idealdir.

Kadın Drosophila geçici çevresel stresleri için açığa, protein açlık ve soğuk şok gibi verimli bir şekilde caspase harekete geçirmek ve yumurta odaları19,57,58hücre ölümü tetikleyebilir, 78. Uzun süreli hücre ölüm indüksiyon Sineklerin kaçınarak iletişim kuralına kritik adımlar içerir. Protein açlık (%1 agar 3 gün için % 8 Sükroz) ve soğuk şok (1-7 oC h) dişi sinekler için en iyi duruma getirilmiş koşulları, yumurta odalarında caspase aktif hücre ölüm işlemleri tetikleyecek ve stresli sinekler için döndükten sonra kurtarmak izin normal durum19. Bir hücre ölüm uyarıcı ile uzun süreli tedavi hücre ölüm sürecinden geçmeleri için daha fazla yumurta chambers tetikleyebilir, ama ölmek üzere olan yumurta odaları tamir edilemeyecek kadar büyük hasara deneyim çünkü iyileşme oranı da, muhtemelen azalır.

Bu iletişim kuralı ek bir kritik adım geçiş, Hayvancılık ve CaspaseTracker gibi 18 oC. daha düşük bir sıcaklıkta uçar Bakımı tarafından CaspaseTracker arka plan sinyal yumurta odalarında azaltmaktır Yumurta odaları çoğunluğu en iyi şekilde yetiştirilen sinekler caspase faaliyet germarium sahne 10 içinde oogenesis58sırasında görüntülenmez, yumurta chambers yaklaşık % 1'i caspase Biyoalgılayıcı etkinliği hücre ölüm indüksiyon19 olmadan sergilemek verebilir . Bu doğuştan gelen hatalar nedeniyle normal aşınma oranı yansıtıyor olabilir veya istemeden oogenesis sırasında standart laboratuvar koşulları tarafından tetiklenebilir. Gal4 daha az aktivite sinekler düşük sıcaklık93görüntüler gibi sinekler 18 oC, yerine oda sıcaklığında yetiştirme CaspaseTracker sistem etkinleştirir endojen sinyali azaltabilir. Alternatif olarak, sinekler gibi 29 oC, daha yüksek bir sıcaklık geçiş CaspaseTracker sisteminin hassasiyeti nedeniyle Gal4 aktivite93ve potansiyel olarak diğer endojen sıcaklık bağımlı enzimatik artırmak için artırabilir faaliyetleri.

Hücre ölüm işlem veya anastasis apoptotik sigara caspase faaliyet gösteren hücrelerden meydana CaspaseTracker pozitif hücreleri ayırt etmek önemlidir. Bunlar hücreler ölüyor o ayırmak-harekete geçirmek Gal4 devam eden caspase aktivite gibi apoptotik hücreler RFP (devam veya son caspase etkinliği için geçici marker) ve sık sık GFP (son caspase etkinliği için kalıcı maker) tedavisinde apoptosis indüksiyon, hızlı, daha sonra geçici (Gal4 etkinliği-bağımlı RFP) ve kalıcı etkinleştirir (Gal4 FLPase-FRT tetiklenen GFP aracılı) gazetecilere G-izleme sistemi. Apoptosis bu hücreler tarafından morfolojik ve biyokimyasal böyle ABD ile nükleer boyalar14,19,58boyama tarafından algılanan nükleer yoğunlaşma ve caspase bölünme tarafından algılanan hallmarks onaylanabilir immunostaining19,94. Zaten anastasis uğramıştır hücreler G-izleme sisteminin FLPase-aracılı rekombinasyon olay nedeniyle kalıcı GFP ifade görüntüler. Onlar devam caspase hareket yok, ne de diğer işaretlerinden apoptosis19gibi bu hücreler yok RFP hızlı. Bu hücreler aynı zamanda normal nükleer Morfoloji görüntüler. Hücreleri genellikle RFP ve GFP ifade görüntülemek ve ayrıca normal nükleer Morfoloji19var devam apoptotik sigara caspase etkinliğine sahip.

Çünkü her ikisi de sadece GFP görüntülemek ve hücre ölümü hiçbir hallmark apoptotik sigara caspase aktivite, bu hücrelerden anastasis deneyimli hücreleri ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle, dikkatli kontrol deneyleri dahil19olmalıdır. Örnekler için anastasis yumurta odalarında, eğitim için bu vurguladı olarak kurtarılan sinek ve sinek (negatif kontrol) sigara vurguladı GFP ifadede incelemek için esastır. Anastasis caspase harekete geçirmek sonra oluştuysa kurtarılan sinekler vurgusuz sinekler, daha fazla GFP ifade hücre göstermelidir. CaspaseTracker floresan sinyallerini nonspesifik auto-Floresan, Manikür, pigmentler ve yağ organları19gözlenen olarak ayırt etmek önemlidir. Negatif kontrol Biyoalgılayıcı sinekler yarilabilir sıra (DQVA) Biyoalgılayıcı (DQVD) caspase bölünme sitenin mutasyona ve böylece kontrol Biyoalgılayıcı non-yanıt veren caspase etkinlik19oluşturma tarafından üretilen. Sinyal içinde caspase duyarlı (DQVD) tespit ama sinyal otomatik Floresans yerine caspase etkinliği tarafından tetiklenen ilgi değil negatif kontrol (DQVA) Biyoalgılayıcı sinekli.

Bizim şu anki Drosophila ikili CaspaseTracker Biyoalgılayıcı hücreleri RFP ifade tarafından "yeni" caspase aktivite ile ve hücreleri ile "geçmiş" caspase aktivitesini GFP19ifadeye göre tanımlayabilirsiniz. Tepki süresi RFP ifade caspase etkinliği yanıttaki sürmeyi Gal4 için bir kaç saat alır çünkü RFP "gerçek zamanlı" caspase etkinlik göstergesi olmadığını unutmayın. "Gerçek zamanlı" işlev eklemek için Drosophila CaspaseTracker Biyoalgılayıcı son zamanlarda geliştirilen iCasper Biyoalgılayıcı52ile kombine edilebilir bir "gerçek zamanlı" ve o zaman sadece far-red sinyallerini gösteren "için parlak koyu" in vivo Biyoalgılayıcı caspases tarafından i ciddi.

Apoptozis dışında potansiyel olarak CaspaseTracker olabilir de aktif hücre ölümü sırasında alternatif türleri gibi hücreleri hücre ölüm yolları doğrudan veya dolaylı olarak caspase harekete geçirmek, sonra autophagy gibi içerir onların ders sırasında geçiş yapabilirsiniz açlık95,96, soğuk şok kaynaklı plazma zarı yırtılması19,55,56,78ve staurosporine kaynaklı necroptosis97nekroz, 98. Bizim şimdiki ve önceki çalışmalar CaspaseTracker biyosensörler bu hücre ölüm indüksiyon vitro veya vivo içinde17,18,19 kurtarılan hücreleri etiketleyebilirsiniz gösterdi , 20 , 21. bu hücre ölüm indüksiyon yalnız aynı anda birden çok hücre ölüm yolları aynı hücrelerdeki etkinleştirmek gibi kurtarma bu hücreler ölüyor o anastasis farklı hücre ölümü tersine çevirebilirsiniz bir genel hücre kurtarma fenomen olduğunu göstermektedir Apoptozis, autophagy, nekroz ve necroptosis, dahil olmak üzere ayrı ayrı veya aynı anda işler.

Vivo CaspaseTracker Biyoalgılayıcı henüz bilinmeyen işlevleri, mekanizmaları ve tedavi edici etkileri anastasis ()şekil 4)21kolaylaştıracaktır. Biz fare birincil karaciğer hücreleri ters etanol kaynaklı apoptoz kaydetme sırasında analiz ve ilginçtir, çarpıcı değişimler buldum zamanlı Kurs bütün-genom gen ifade Mikroarray çalışmaları gerçekleştirilen anastasis moleküler imza ortaya çıkarmak için Transkripsiyon genlerin yanlısı survival, Anti-oksidasyon, DNA hasarı yanıt, Histon modifiye, anjiogenez, hücre geçiş ve dönüşüm18,21de dahil olmak üzere birden çok yollar dahil. Bu bulgu doğrulama çalışmamız insan karaciğer kanseri HepG2 hücreleri kurtarma apoptosis18,21ve aynı zamanda yeni bir bağımsız RNA-sıralama çalışma kurtarma apoptosis99HeLa hücreleri tarafından desteklenmektedir. İlginçtir, up-yönetmelik anastatic hücrelerde bulunan bazı yanlısı hayatta kalma faktörlerin da gözlenen kalp yetmezliği tersine, tümör ilerleme ve kanser nüks100,101,102, düşündüren anastasis potansiyel katılımı. Bu mekanik ve tedavi edici çalışmalar sağlayacaktır olarak anastasis fizyolojik, patolojik ve terapötik potansiyelleri çalışmaya, bu anastatic hücrelerini tanımlamak ve kaderlerini küçük hayvanlarda izlemek önemlidir. Bizim Drosophila ve memeli CaspaseTracker biyosensörler anastasis potansiyel katkıları normal gelişim, Homeostazı, doku kurtarma, tümör evrim, kanser nüks ve metastaz test etmek için yararlı araçları olacaktır. Bu çalışmalar bulgu anastasis doğal rolü bilgimizi artırmak ve hücre ölümü ve hayatta kalma anastasis kontrol aracılığıyla arabuluculuk dirençli hastalıklar için devrimci yeni tedavi yaklaşımları tanımlamak için potansiyel sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Drosophila görüntü şekil 3 c ve video el yazması için Darren Obbard teşekkür ederim; J. Marie Hardwick, Wade Gibson ve Heather M. kuzu bu el yazması değerli tartışılması için. Bu eser bir efendim Edward Youde Memorial Bursu (H.L.T. tarafından), Dr. Walter Szeto'yu Memorial Bursu (H.L.T.), desteklenen Fulbright hibe yaşam Bilim Araştırma Vakfı Bursu (H.L.T.) ve ncı K22 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), verin. Ho Tang Lam bir Shurl ve Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı (2014-2017) Kay Curci Vakfı üyesi oldu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

Tıp sayı 132 Anastasis Apoptozis autophagy Biyoalgılayıcı caspase CaspaseTracker nekroz necroptosis programlanmış hücre ölümü Apoptozis iptali
Anastasis <em>Vivo içinde</em> CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter