Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الكشف عن القيامة في فيفو قبل بيوسينسور كاسباسيتراكير

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

القيامة يمثل تحديا تقنيا للكشف في فيفو للخلايا التي عكسها في عملية موت الخلايا يمكن أن يكون شكلياً لا يمكن تمييزها عن خلايا صحية طبيعية. هنا يصف لنا البروتوكولات لكشف وتعقب الخلايا التي يخضع لها القيامة في الحيوانات الحية باستخدام نظامنا بيوسينسور كاسباسيتراكير المطورة حديثا في فيفو .

Abstract

القيامة (اليونانية عن "ارتفاع إلى الحياة") هي ظاهرة انتعاش خلية مكتشفة حديثا حيث تموت الخلايا يمكن عكس العمليات موت الخلية المرحلة المتأخرة التي يفترض عموما أن يكون جوهريا لا رجعة فيه. تعزيز القيامة يمكن في مبدأ الإنقاذ أو الحفاظ على إصابة الخلايا التي يصعب على استبدال مثل كارديوميوسيتيس أو الخلايا العصبية، وبالتالي تيسير استعادة الأنسجة. على العكس من ذلك، قد قمع القيامة في الخلايا السرطانية، تخضع للمبرمج بعد العلاجات المضادة للسرطان، والتأكد من موت الخلايا السرطان وتقليل فرص تكرار. ومع ذلك، أعيقت هذه الدراسات بعدم وجود أدوات لتتبع مصير الخلايا التي يخضع لها القيامة في الحيوانات الحية. يتمثل التحدي في تحديد الخلايا التي قد عكس عملية الإعدام الخلية على الرغم من مظهرها الطبيعي شكلياً بعد الشفاء. وللتغلب على هذه الصعوبة، قمنا بتطوير أنظمة بيوسينسور كاسباسيتراكير الثدييات التي يمكن تحديد وتعقب بشكل دائم أناستاتيك الخلايا في المختبر أو في الجسم الحيو المورفولوجية . نقدم هنا، في فيفو البروتوكولات لتوليد واستخدام نظام كاسباسيتراكير بيوسينسور المزدوج لكشف وتعقب القيامة في melanogaster المورفولوجية بعد التعرض عابر للمحفزات موت الخلية. بينما أجهزة الاستشعار التقليدية والبروتوكولات يمكن تسمية الخلايا تمر بنشاط موت الخلية أبوبتوتيك، بيوسينسور كاسباسيتراكير بشكل دائم يمكن تسمية الخلايا التي انتعشت بعد تفعيل caspase-من السمات مميزة للمرحلة المتأخرة المبرمج، و في الوقت نفسه تحديد العمليات apoptotic النشطة. كما يمكنك تعقب هذا biosensor استعادة الخلايا التي حاول أشكال أخرى من موت الخلايا التي تنطوي على نشاط caspase مباشرة أو غير مباشرة. ولذلك، هذا البروتوكول تمكننا من تتبع مصير هذه الخلايا وذرياتهم، تسهيل الدراسات المستقبلية الوظائف البيولوجية والآليات الجزيئية، الآثار الفسيولوجية والمرضية، والآثار المترتبة على العلاج بشكل مستمر القيامة. نناقش أيضا عناصر التحكم المناسبة لتمييز الخلايا التي يخضع لها القيامة من تلك التي عرضها غير apoptotic caspase النشاط في فيفو.

Introduction

برمجة موت الخلايا، مثل المبرمج، وتلعب دوراً أساسيا في التنمية الجنينية والتوازن الطبيعي من خلال القضاء على الخلايا غير المرغوب فيها أو إصابة خطيرة في الكائنات الحية متعددة الخلايا1،،من23. يمكن أن يؤدي فقدان التوازن بين موت الخلية والبقاء على قيد الحياة إلى العواقب المميتة مثل السرطان والقلب والمناعة الذاتية وانحطاط4،،من56،،من78. تنشيط الجلاد caspases تقليديا تعتبر "نقطة اللاعودة" في المبرمج9،،من1011، كما أنه يشغل الهدم الخلوية السريعة والواسعة النطاق12، 13،14،،من1516. تتحدى هذه العقيدة العامة، أثبتنا أن مثقف يموت الخلايا الأولية والخلايا السرطانية يمكن استرداد ليس فقط بعد تفعيل caspase، لكن الخلية الهامة التالية أيضا بصمات الموت بما في ذلك بلبينغ غشاء البلازما، انكماش الخلية، المتقدرية التجزؤ، الإفراج عن الفسفرة المتقدرية ج في سيتوسول، النووية والتكثيف الكروماتين، ضرر الحمض النووي، وتجزئة النووية، تعرض الخلية السطحية فوسفاتيديلسيريني (PS)، وتشكيل هيئات apoptotic 17 , 18 , 19 , 20 , 21-ونحن نقترح أن القيامة ظاهرة استعادة خلية مضمن، كما يمكن استرداد خلايا الموت بعد إزالة خلية الموت المحفزات17،،من1819،20، 21-نحن مصطلح "القيامة" (Αναστάσης)18، الذي يعني "ارتفاع للحياة" باللغة اليونانية، إلى وصف هذه الظاهرة استرداد الخلية غير متوقعة. ملاحظتنا للقيامة يتم اعتماد مزيد من الدراسات المستقلة الحديثة التي تكشف أيضا عن استعادة الخلايا بعد فوسفاتيديلسيريني تخريج22،23،24، محدودة المتقدرية الخارجي غشاء بيرميبيليزيشن25والتنشيط من سلالة مختلطة مثل كيناز (ملكل)، و انكماش الخلية26.

وصف الآليات التي تنظم القيامة سيكون تحويل نموذج الآثار الفسيولوجية والمرضية والعلاجية. ويمكن أن تمثل القيامة إليه cytoprotective لم تكن معروفة سابقا لإنقاذ أو الحفاظ على هامة بوستميتوتيك الخلايا والأنسجة التي يصعب على استبدال، وربما الحساب لعكس فشل القلب بتفريغ البطين مع البطين الأيسر مساعدة الأجهزة (لفادس)،من2728، استرداد خلايا مستقبله بعد عابر التعرض المفرط الخفيفة29،،من3031، أو إصلاح الخلايا العصبية بعد إصابة الدماغ32. إذا كان الأمر كذلك تعزيز القيامة يمكن أن يعزز استعادة الخلايا والأنسجة. على العكس من ذلك، يمكن أن تكون القيامة تكتيك هروب غير متوقعة تستخدم الخلايا السرطانية للبقاء على قيد الحياة الذي يحفز موت الخلية والعلاج، يسبب سرطان تكرار17،18. ولذلك، قمع القيامة في موت الخلايا السرطانية أثناء وبعد علاج السرطان يمكن أن يكون رواية استراتيجية علاجية لعلاج السرطان عن طريق منع الانتكاس بها.

أثناء عملية القيامة، وجدنا أن بعض الخلايا المستردة المكتسبة التعديلات الوراثية الدائمة وخضع للتحول النمطان، تكبدت احتمالاً بسبب تلف الحمض النووي أثناء [ابوبتوسس]18،20،21 . عكس عملية موت الخلايا التالفة الحمض النووي يمكن أن يكون إليه توموريجينيسيس، المحتملة الكامنة وراء ملاحظة أن تكرار الإصابة الأنسجة يزيد من خطر الإصابة بالسرطان في مجموعة متنوعة من الأنسجة، مثل الناجم عن الإصابة الحرارية المزمنة في المريء حسب استهلاك المشروبات الساخنة جداً33،،من3435، تلف الكبد بسبب إدمان الكحول36،37، تطور الورم بعد العلاج سمية جينية سرطان38، 39،40، والتنمية من حالات السرطان الجديدة من الأنسجة الطبيعية التي تنشأ خلال الفترات الفاصلة بين دورات العلاج المضادة للسرطان41،42،،من4344 . إذا كانت القيمة true، استهداف القيامة يمكن منع أو اعتقال السرطان التنمية والتقدم. وقد وجدنا أن الخلايا الجرثومية الموت الناجم عن المجاعة الخضوع للقيامة في إعادة تغذية المورفولوجية19.  في حالة حدوث القيامة في الخلايا الجرثومية ذات ضرر الحمض النووي، يمكن أن يكون الحساب لملاحظة أن الإجهاد البيئي لفترات طويلة ويشجع تطور الأمراض الوراثية. على سبيل المثال، تسهم المجاعات في تطور الأمراض القابلة للتوريث تخذها مثل داء السكري وأمراض القلب التاجية45. ولذلك، فهم القيامة يمكن أن يؤدي إلى استراتيجيات للوقاية من الإصابة بأمراض قابلة للتوريث الناجمة عن هذه الآلية المحتملة.

تسخير اكتشاف القيامة وتوجيهها لتطوير علاجات مبتكرة، من الضروري دراسة سببا ونتيجة للقيامة في الحيوانات الحية. ومع ذلك، يمثل تحديا من الناحية التقنية لتحديد وتعقب أناستاتيك الخلايا في الجسم الحي، لتظهر الخلايا التي تم استردادها من عملية موت الخلايا شكلياً لا يمكن تمييزها عن خلايا صحية عادية، ولا أي العلامات البيولوجية للقيامة حددت حتى الآن17،،من1821. لمعالجة هذه المشاكل، وضعنا مؤخرا من جديد في فيفو caspase biosensor عينت19من "كاسباسيتراكير"، لتحديد وتعقب الخلايا التي البقاء على قيد الحياة المبرمج بعد تفعيل caspase19،46، السمة المميزة للمبرمج10،14. يميزه عن أجهزة استشعار العوامل البيولوجية caspase "الوقت الحقيقي" مثل طرد12،47، أبولينير48، كاليفورنيا-بروتينات فلورية خضراء49،18،أبواليرت50، C3AIs51 وإيكاسبير52 التي تكشف عن نشاط caspase الجارية، بيوسينسور كاسباسيتراكير بالإضافة إلى ذلك ميزات القدرة على بشكل دائم تسمية الخلايا هذا النشاط caspase صريحة حتى عابر. ولذلك، تمكن بيوسينسور كاسباسيتراكير تتبع طويل الأجل للقيامة بعد خلية عكس caspase بوساطة عملية الإعدام في فيفو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) إعداد الذباب بيوسينسور كاسباسيتراكير

  1. تخدير الذباب مع CO2، واستخدم الرسام لنقل 7 إلى 10 الحساسة كاسباسي Gal4 (دقفد)19 العذراء الإناث و 7 إلى 10 ز-تتبع53 Gal4 مراسل الشباب الذكور الذباب (أو العكس بالعكس) في القنينة نفسها مع الغذاء يطير ولصق الخميرة الطازجة.
    ملاحظة: سوف تنتج عبر الذباب Gal4 كاسباسي الحساسة (دقفد) وتتبع ز كاسباسيتراكير ذرية الذباب. عبر Caspase-فيالحساسة (دقفا)19 Gal4 والذباب ز-تتبع ستوفر رحلات المراقبة السلبية (انظر المناقشة). لصق الخميرة الطازجة كمصدر البروتين لزيادة إنتاج البيض، حيث أنه يزيد من عدد من ذرية. حدد الإناث العذراء والذباب الذكور الشباب وفقا لما تعمل54.
  2. احتضان الذباب في 18 درجة مئوية (سج) خلال الصليب لمدة 3 إلى 7 أيام، ومن ثم نقل الذباب لقنينة جديدة لإعداد صليب جديدة عند 18 درجة مئوية. الاستمرار في احتضان القنينة الأصلية عند 18 درجة مئوية حتى الذباب ذرية اكلوسي.
    ملاحظة: نقل الذباب الأصل إلى قارورة جديدة لتجنب الاكتظاظ من ذرية في القنينة الأصلية. الذباب الأصل يمكن أن تنتج ذرية مع المواد الغذائية الطازجة ولصق الخميرة في تبديل أولاً من 2 إلى 3 ومن ثم الإنتاجية ستنخفض إلى حد كبير مع مرور الوقت. تربية الذباب 18 درجة مئوية يمكن أن تقلل من الإشارات غير محددة من بيوسينسور كاسباسيتراكير (انظر المناقشة).
  3. تحديد النسل الذباب مع تعمل الصحيح54 للتجارب التالية.
    ملاحظة: المتسلسلات Gal4 caspase-تراعي وتتبع ز هنا تقع على كروموسوم الثاني، متوازنة مع موازن سيو. حدد ذرية الجناح غير مجعد (دون سيو)، التي لديها كلا المتسلسلات Gal4 caspase-تراعي وتتبع ز.

2) التطبيق التعريفي موت الخلية عابر للذباب بيوسينسور كاسباسيتراكير

  1. نقل 10 إلى 20 حديثا أنثى اكلوسيد تسير رحلات إلى قنينة جديدة مع المواد الغذائية الطازجة يطير ولصق الخميرة الطازجة لمدة يوم واحد في 18 درجة مئوية للسماح بإنتاج دائرة البيض تكون البويضات.
    ملاحظة: قد يعزز إبقاء الإناث مع ذكور الذباب البيض دائرة الإنتاج.
  2. للحث على الدوائر البيض على الخضوع للمبرمج بصدمة البرد، نقل الذباب الإناث إلى قنينة فارغة جديدة، ثم وضعت في-7 درجة مئوية ح 1.
    ملاحظة: صدمة البرد يجرح الخلايا بغشاء البلازما تمزق،من5556.
  3. للحث على الدوائر البيض على الخضوع للمبرمج بالمجاعة البروتين، نقل الذباب الإناث إلى قنينة جديدة مع الغذاء أجار السكروز و 1% 8% عند 18 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي إلى تجويع البروتين (بروتين غير الغذائية) الدوائر البيض على الخضوع للمبرمج57،،من5859 وأوتوفاجي60،61. التبديل الذباب إلى قنينة جديدة مع الغذاء أجار السكروز و 1% 8% يوميا للحفاظ على الشرط الأمثل السكروز الغذاء يطير.
  4. نقل الذباب أكد مرة أخرى إلى قنينة جديدة مع المواد الغذائية الطازجة يطير ولصق الخميرة الطازجة لمدة 3 أيام عند 18 درجة مئوية للسماح لهم باسترداد. تشريح جوعاً والذباب جوعاً بين استرداد للحصول على دوائر البيض في المبايض ك وصف62.
    ملاحظة: تشريح المورفولوجية للحصول على المبايض، تخدير الذباب مع CO2، واستخدم 2 زوجاً من الملقط لإزالة رأس ذبابة، واستخدام الملقط سحب قاعدة البطن لإزالة المبايض الذباب.

3) التثبيت وتلطيخ الدوائر البيض تشريح لتصوير

  1. نقل دوائر البيض تشريح جنبا إلى جنب مع حوالي 0.5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى أنابيب الطرد المركزي 1 مل. السماح للبيض أن تستقر.
    ملاحظة: معطف نصائح ماصة بلاستيكية مع 1% البقري ألبومين المصل (BSA) الذائبة في الماء أو برنامج تلفزيوني لمنع الدوائر البيض عصا على سطح البلاستيك من النصائح. تنفيذ الإجراءات التالية في الظلام لتجنب فوتوبليتشينج بروتين الأحمر نيون (طلب تقديم العروض، يعرف أيضا باسم دسريد) والبروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في الدوائر البيض.
  2. إزالة برنامج تلفزيوني بيبيتينج، ثم قم بتطبيق مل 0.5 4% بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لإصلاح الدوائر البيض في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
    ملاحظة: تطبيق استدارة لطيف في هذا المجال وحضانة الخطوات التالية.
  3. إزالة بارافورمالدهيد طريق بيبيتينج، وغسلها ثم قاعة البيض مع 0.5 مل ببست (برنامج تلفزيوني + 0.1% Triton X-100) 3 مرات.
    ملاحظة: يمكن أن يقلل التثبيت طويلة إشارات طلب تقديم العروض والتجارة والنقل.
  4. احتضان دوائر للبيض مع ببست ح 1 إلى 2 في درجة حرارة الغرفة أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف بيرميبيليزي الدوائر البيض.
    ملاحظة: يمكن أيضا تجنب ببست الدوائر البيض على التمسك بسطح البلاستيك المغلفة غير جيش صرب البوسنة.
  5. إزالة ببست بيبيتينج، ثم قم بتطبيق 0.5 مل من 10 ميكروغرام/مل من صبغة هويشت النووية الأزرق في ببست لدوائر البيض ح 1 إلى 2 في درجة حرارة الغرفة وصمة عار لنواة.
    NOTE1: تجنب حضانة طويلة مع الصبغة النووية كما سيؤدي هذا إلى زيادة الإشارات غير محددة.
    NOTE2: نهج بديل لوصمة عار نواة دون هويشت إضافة 200 ميكروليتر مكافحة التبييض عامل تصاعد مع DAPI (انظر المواد) واحتضان63من بين عشية وضحاها، قبل تركيب الأنسجة في كشف غطاء الزجاج كما هو موضح في البروتوكول 3.8.
    NOTE3: أداء تلطيخ والإجراءات التالية في الظلام لتجنب فوتوبليتشينج.
  6. إزالة الصبغة النووية عن طريق بيبيتينج، ثم قم بتطبيق 0.5 مل ببست أن يغسل بدوائر البيض في أنابيب الطرد المركزي 1 مل 3 مرات، مع حضانة 10 إلى 20 دقيقة مع لطيف التناوب بين كل خطوة الغسيل.
  7. إزالة جميع ببست مع غرامة ماصة، ومن ثم تطبيق 200 عامل تصاعد مكافحة تبييض ميكروليتر (انظر مواد) لاحتضان الدوائر البيض في درجة حرارة الغرفة ح 3 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها حتى تغرق الدوائر البيض على الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: الأنسجة التي استوعبت تماما عامل تركيب بالوعة إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  8. جبل الدوائر البيض الملون بتحويلها مع 200 ميكروليتر مكافحة تبييض تصاعد عامل على شريحة زجاج تنظيفها مسبقاً للتصوير بواسطة بيبيتينج، تغطي الدوائر البيض كشف غطاء زجاج تنظيفها قبل 20 x 20 ملم، وختم بكشف الغطاء على شريحة زجاجية عن طريق وضع طلاء الأظافر على حافة بكشف الغطاء.
    NOTE1: قبل تنظيف الشرائح الزجاجية وكشف الغطاء مع الماء أو 70 في المائة من الإيثانول.
    NOTE2: تطبيق هلام البترول بين الشريحة الزجاجية وكشف الغطاء لتجنب تدمير الدوائر البيض قبل أوفيركومبريشن.
  9. صورة الدوائر البيض استخدام الفلورية أو مجهر [كنفوكل]، باستخدام علامة x 20، نا 0.8 هدف الخطة--أبوتشرومات، مع الإثارة الخفيفة طول موجي 405 نانومتر لتلطيخ النووية (الكشف عن الانبعاثات ~ 461 nm)، 561 نيوتن متر لطلب تقديم العروض (caspase الجارية أو الأخيرة النشاط) إشارة ( اكتشاف الانبعاث ~ 590 nm)، و 488 نانومتر للتجارة والنقل (في الماضي نشاط caspase) إشارة (الكشف عن الانبعاثات ~ 518nm).
    ملاحظة: انظر بنا البروتوكولات المنشورة للفحص المجهري20،64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أن الوقت الفاصل بين الخلية حية مجهرية طريقة موثوقة للقيامة المسالك في الخلايا المستزرعة20، فإنها صعبة لتحديد الخلايا التي خضعت للقيامة في الحيوانات، لأن تظهر الخلايا المستردة شكلياً لا يمكن تمييزها من الطبيعي الخلايا السليمة التي حاولت عدم موت الخلية. على سبيل المثال، عرض الخلايا البشرية سرطان عنق الرحم هيلا بصمات المورفولوجية للمبرمج1،2،14، مثل انكماش الخلية والتكثيف النووية بلبينغ غشاء البلازما استجابة لموت الخلايا التحفيز 1µM ستاوروسبوريني17 (الشكل 1A، 1B الرقم i-ii). بعد إزالة خلية الموت حافزا والحضانة في المتوسط الطازجة، خلايا الموت عكس عملية موت الخلايا بالقيامة17،18، كما يتبين من الانتعاش المورفولوجي (الشكل 1B الثالث والرابع)، متبوعاً بانتشار (1B الشكل الخامس-السادس). كما استخدمت دراساتنا السابقة caspase "الوقت الحقيقي" أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، مثل أبواليرت (الدائرة الوطنية للتوظيف-ديفد-يفب-NLS) لإثبات عكس المبرمج بعد تفعيل caspase18،20. هذا biosensor يموضع إلى سيتوسول في الخلايا السليمة (الشكل 1، 1 د وأنا). عند تفعيل caspase فجرتها الإيثانول 3.7% حافز موت الخلية، هذا بيوسينسور على أساس يفب المشقوق من كاسباسيس وذوبانها إلى النواة، حيث يتراكم والأسفار النووية الناتجة عن العلامة يفب يحدد الخلايا مع الجارية نشاط كاسباسي (الشكل 1 ج، د 1 الثاني-الثالث). عرض الخلايا الموت أيضا بصمات المورفولوجية للمبرمج أثناء الإيثانول-التعريفي1،14،18،20، مثل تجزئة الميتوكوندريا أنبوبي، النووية التكثيف وانكماش الخلية، وغشاء البلازما بلبينغ (1 الشكل الثاني-الثالث). من المثير للاهتمام، بعد إزالة حافز موت الخلية، نفس الخلايا يمكن استرداد واستعادة عادية مورفولوجية (1 الرقم الرابع إلى الثامن). جدير بالذكر أن الأسفار النووية من أبواليرت (ملصوق biosensor) ذهب في غضون 1 ساعة في الخلايا المستردة (1 الرقم الرابع إلى الثامن)، ربما بسبب العمليات المماثلة التي تقضي على المكونات التالفة في أناستاتيك الخلايا18 ، مثل ملصوق caspase-3 ونشطت ايكاد المتولدة أثناء [ابوبتوسس]. ولذلك، مطلوب استراتيجية جديدة لتعقب القيامة على مدى فترة زمنية أطول، لا سيما في فيفو.

لتعقب مصير الخلايا أناستاتيك، قمنا بتطوير النظام بيوسينسور كاسباسيتراكير الثدييات، الذي تسميات الخلايا بشكل دائم بعد يجري المشقوق بنشاط caspase الجلاد. يتكون هذا بيوسينسور رتتا كاسباسي الحساسة (عكس تسيطر عليها التتراسيكلين ترانساكتيفاتور)، ومراسل لجنة المساواة العرقية-لوكسب-تعتمد للنشاط رتتا (الشكل 2 أ-ب). في الخلايا السليمة مع أي نشاط كاسباسي، رتتا ترانساكتيفاتور65 مرتبط بغشاء البلازما الارتساء (لين11)66،67، نواة استبعاد الإشارات (متنوعة) من خريطة كيناز كيناز (مابك)68، و مستقبلات الإستروجين البديل (ERT2)69 عن طريق caspase-كليفابل (ديفد)70 linkers المستمدة من تسنى (الشكل 2 أ، 2). كما لا يمكن ترانسلوكاتي رتا المربوطة من سيتوسول إلى النواة، فإنه لا يمكن تنشيط المراسل رتا. ومع ذلك، عند تنشيط استجابة لحافز موت خلية، تنشق caspases linkers ديفد، تحرير رتا ترانسلوكاتي للنواة (الشكل 2). مرة واحدة في النواة، رتا الربط إلى tet استجابة عنصر (TRE) ومشغلات التعبير عابرة من ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية، الأمر الذي يؤدي إلى حدث جزئ لا رجعة فيه أن يزيل كاسيت كودون التوقف بين المروج كاج وتسلسلات الترميز الأحمر نيون البروتين (دسريد). ينتج عن هذا التعبير الدائم عن دسريد (الشكل 2)، الذي يعمل بوصفه علامة نيون الدائم لتلك الخلايا التي يمكن أن تبقى على قيد الحياة بعد قد شهدت نشاط caspase، فضلا عن ذريتهم (الشكل 2).

لاختبار بيوسينسور كاسباسيتراكير الثدييات، نحن أدخلت خلايا هيلا من تعداء عابرة وتعامل الخلايا مع حافز موت خلية (1µM ستوروسبوريني) ويرصدها استعادة الخلايا الوقت الفاصل بين الخلية حية مجهرية [كنفوكل] كما لدينا ووصف20. الدوكسيسيكلين (1µg/mL تركيز النهائي)، الذي يعتبر أساسيا للسماح رتا النشاط65،71، أضيفت إلى مستنبت الخلية لتشغيل biosensor طوال التجربة. واستجابة لحافز موت الخلية، عرض الخلايا المعالجة السمات المميزة للمبرمج، بما في ذلك تقلص الخلية وغشاء البلازما بلبينغ المتوقعة (الشكل 2D i-ثالثا). بعد إزالة حافز موت الخلية، يمكن ملاحظة الشطف القيامة طبقة مرة واحدة، وإضافة المتوسطة ثقافة جديدة، الخلية في الخلايا يحتضر، كما أشار إلى ذلك عودتهم إلى مورفولوجيا عادي (2D الشكل الرابع إلى السابع). دياجنوستيكالي، فقط استرداد خلايا إكسبريس دسريد نيون علامة أثناء وبعد القيامة (2D الشكل الرابع إلى السابع)، تمييزها من الخلايا غير المستردة (2D الشكل الرابع إلى السابع)، والخلايا التحكم لا يتعرض لحافز موت الخلية (الشكل 2E). هذا يدل على التطبيق وفائدة كاسباسيتراكير الثدييات كأداة جديدة مبتكرة لتحديد ووسم الخلايا أناستاتيك يتعافى من تفعيل caspase بشكل دائم، وتوفر وسيلة لتتبع ودراسة مصيرهم الأطول أجلاً.

لكشف وتعقب القيامة في الحيوانات الحية، كاسباسيتراكير بيوسينسور الحيوانات المحورة وراثيا المطلوبة. ولذلك، نحن أولاً melanogaster المورفولوجية نظام نموذجي19، نظراً لأنها كائن وراثيا أصعب مهمة لدراسة التنمية الحيوانية والأمراض التي تصيب الإنسان72،73،74 ،75. المعدلة من بيوسينسور كاسباسيتراكير الثدييات، يمكن تحديد biosensor المزدوج المورفولوجية والتمييز بين "الأخيرة/جارية" من "الماضي" النشاط كاسباسي. هذا biosensor المزدوج يتكون من Gal4 حساسة كاسباسي19، ومراسل Gal4 ز-تتبع53 (الشكل 3A). في الخلايا مع أي نشاط كاسباسي، عامل النسخ الخميرة Gal4 مرتبط بمجال ربط (mCD8) غشاء البلازما من خلال رابط caspase-كليفابل (دقفد) المستمدة من DIAP1 (الشكل 3B)، وبعد طفرة 21NN/GV22 لمنع تدهور من Gal4 بحكم نهاية N عند انشقاق caspase afterAsp20 رابط76، وطفرة D135R بإلغاء وظيفة caspase دريس المثبطة في المجال BIR177. كما لا يمكن ترانسلوكاتي Gal4 المربوطة إلى نواة دون الانقسام وطريق caspase الإفراج عنها، يظل المراسل Gal4 ز-تتبع غير نشط في الخلايا بعد لا نشاط كاسباسي19. عند تفعيل caspase، غير أن تنشق caspases تنشيط رابط دقفد، تحرير Gal4 ترانسلوكاتي إلى نواة لتنشيط مراسل (الشكل 3A) ز-تتبع19. Gal4 بربط محددة المنبع تنشيط تسلسل (UAS) لتشغيل النسخ عابرة والتعبير عن طلب تقديم العروض، ثم تعمل كمراسل فلورسنت النشاط caspase الأخيرة أو الحالية حتى Gal4 توقف النشاط (caspase) ومن ثم طلب تقديم العروض البروتين المتدهورة. Gal4 يؤدي أيضا التعبير عن حزب العمل الفيجي recombinase من التحوير، مما يؤدي إلى حدث جزئ الذي يزيل كاسيت كودون التوقف بين مروج ubiquitin (يو بي أي)، وتسلسل ترميز لاستهداف نواة التجارة والنقل (نوكجفب). ينتج عن هذا التعبير الدائم من نوكجفب، الذي يعمل بوصفه علامة دائمة لتلك الخلايا التي شهدت نشاط كاسباسي والبقاء على قيد الحياة.

لاختبار بيوسينسور كاسباسيتراكير المورفولوجية للكشف عن المبرمج والقيامة في فيفو، كاسباسيتراكير أنثى الذباب تعرضوا للإجهاد الفسيولوجية (الشكل 3)، مثل صدمة الباردة19، التي يمكن أن كفاءة الزناد موت الخلايا، بما في ذلك المبرمج كما هو مبين بتفعيل caspase والتكثيف النووية وخلية انكماش19،78، وأيضا نخر بسبب تقشعر لها اﻷبدان التي تسبب فقدان سلامة الغشاء والتسرب من هيولى محتويات55،56. وكما كان متوقعا، لم يتم تنشيط كاسباسيتراكير في البيض الدوائر مراقبة الذباب ليس فيها موت الخلايا المتصلة بالإجهاد الناجم عن (3D الشكل). وفي المقابل، الدوائر البيض من الذباب وأكد أظهرت يوم واحد بعد الصدمة الباردة ليس فقط انكماش الخلية apoptotic المميزة والتكثيف النووية، ولكن أيضا طلب تقديم العروض والتجارة والنقل التعبير وتشير إلى وجود الأخيرة أو الجارية (RFP +) والماضية (بروتينات فلورية خضراء +) كاسباسي النشاط (رقم 3E). ومع ذلك، في 3 أيام بعد عودته الذباب أكد إلى حالة طبيعية غير مؤكدا، التجارة والنقل، ولكن لا يوجد طلب تقديم العروض، تم الكشف عن التعبير في الدوائر البيض المستردة (3F الشكل). يشير هذا إلى أن الدوائر البيض التي أعربت عن نشاط caspase أثر الإجهاد تمكنوا من التغلب على عملية موت الخلايا والبقاء على قيد الحياة.

كذلك اختبار إمكانية الرجوع لعملية موت الخلايا في الدوائر البيض19، تم التشديد على الذباب الإناث كاسباسيتراكير جوعاً البروتين بعد تغذيتها السكروز 8% في أجار 1% لمدة 3 أيام. وأظهرت دراسات سابقة أن المجاعة البروتين يمكن أن تؤدي وساطة caspase المبرمج وأوتوفاجي في الأنسجة مع جسدية والخلايا الجرثومية، بما في ذلك البيض الدوائر57،،من6061. كما كان متوقعا، تم تفعيل كاسباسيتراكير في الدوائر البيض بعد 3 أيام من البروتين المجاعة (الشكل 3). أظهرت الدوائر البيض الموت مورفولوجيس أبوبتوتيك والتعبير طلب تقديم العروض والتجارة والنقل بيوسينسور علامات، مشيرة إلى الأخيرة أو الحالية (RFP +) والماضي caspase نشاط (بروتينات فلورية خضراء +) (الشكل 3). لإثبات أن كاسباسيتراكير يمكن أن تعقب الخلايا المستردة التي تعرضت سابقا لتفعيل caspase بعد حافز موت، ثم نقل الذباب المتعطشة إلى الغذائية يطير المعتادة التي تحتوي على البروتين. كما هو متوقع، تفتقر إلى دوائر البيض المستردة هذه الذباب إعادة تغذية المراسل caspase عابر طلب تقديم العروض، مما يشير إلى أي نشاط caspase الأخيرة أو الجارية (ح الشكل 3). ومع ذلك، قد نقضت بدوائر البيض في هذه الذباب بعد تخفيف التوتر قبل إعادتهم إلى الغذاء العادي عرض المراسل caspase التجارة والنقل (الشكل 3 ح)، مما يدل على أن الخلايا في هذه الدوائر البيض عملية الإعدام بدأت الخلية عند نقطة بعد تفعيل caspase. تم الحصول على التحقق أن النشاط بيوسينسور كاسباسيتراكير الذي تم تشغيله من قبل كاسباسي باستبدال تسلسل الانقسام دقفد بتسلسل دقفا، كاسباسي الذي هو غير قادر على تنشق والتي تلغي النشاط بيوسينسور (الشكل 3B، 3I ).

بعد استرداد كاسباسيتراكير المورفولوجية جوعاً البروتين، وجدنا أن أنواع متعددة من الخلية في الدوائر البيض، مثل خلايا جسدية (جريب) والخط الخلايا (خلايا ممرضة وبويضات)، عرض فقط التجارة والنقل، ولكن عدم طلب تقديم العروض (3J الشكل )19، مما يشير إلى أن هذه الخلايا يمكن أن يخضع القيامة بعد تفعيل caspase. من المثير للاهتمام، المسمى التجارة والنقل أيضا الخلايا في جيرماريوم (3J الشكل)19، التي تحتوي على الخلايا الجذعية، جنبا إلى جنب مع دوائرها البيض المرتبطة بها في نفس السلسلة أوفاريولي. ولذلك هذه الدوائر البيض الحاملات للتجارة والنقل قد استخلصت الخلايا الجذعية التي انتعشت من عملية موت الخلايا بعد تفعيل caspase. الأهم من ذلك، الذباب جوعاً وإعادة تغذية الأنثى وضع البيض الخصبة التي يمكن أن تنتج بروتينات فلورية خضراء-الإعراب عن ذرية الذباب19، مما يوحي بأنه يحتمل أن تكون الخلايا عكس عملية موت الخلايا بعد تفعيل caspase يمكن استعادة وظيفة طبيعية على ما يبدو. الدراسات المستقبلية مطلوبة لتحديد إذا كان الذباب ذرية أن البقاء على قيد الحياة نتيجة القيامة يحمل عقابيل دائمة.

Figure 1
الشكل 1 . استرداد هيلا الخلايا بعد التعريفي موت الخلية.
(أ) رسم تخطيطي للنهج للحث على موت الخلايا وبعد ذلك السماح بموت الخلايا لاسترداد بعد إزالة محفز موت الخلية.
(ب) الوقت الفاصل بين الخلايا الحية DIC الفحص المجهري لخلايا هيلا صحية (أنا)، ونفس المجموعة من الخلايا بعد علاج مع staurosporine 1µM (ثانيا)، ثم غسلها وكذلك المحتضنة مع المتوسطة ثقافة جديدة لإزالة ستوروسبوريني ( الثالث-السادس). ويشير السهم الأبيض إلى خلية تقسيم.
(ج) رسم تخطيطي للبروتين الانصهار biosensor caspase الدائرة الوطنية للتوظيف-ديفد-يفب-NLS، وتوطين سوبسيلولار يفب خلال الاستقراء موت الخلية وبعد القيامة.
(د) الوقت الفاصل بين الخلية حية مجهرية [كنفوكل] من خلية واحدة هيلا معربا عن البروتين الانصهار biosensor caspase الدائرة الوطنية للتوظيف-ديفد-يفب-NLS قبل (أنا)، أثناء التعرض إلى 3.7 ٪ الإيثانول (الثاني - الثالث)، وبعد إزالة الإيثانول من الثقافة المتوسطة (الرابع - الثامن). يظهر هنا صور biosensor caspase فقط (الفلورية الخضراء، الصف العلوي)؛ دمج الصور الملطخة هويشت نواة (الفلورية الزرقاء) والميتوكوندريا (أحمر الأسفار) (الصف الأوسط)، وكذلك دمج الصور في الصف الأوسط DIC الصور (الصف السفلي). تشير الأسهم البيضاء الموجودة في الصف العلوي يفب المترجمة النووية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . نظام بيوسينسور كاسباسيتراكير الثدييات.
(أ) رسم تخطيطي رتا caspase الحساسة.
(ب) رسم تخطيطي للنظام بيوسينسور رتا كاسباسيتراكير الثدييات.
(ج) مخطط انسيابي لاستخدام نظام biosensor رتا كاسباسيتراكير للكشف عن القيامة. المثلث الأحمر/الأصفر (تطبيق محفز موت الخلية)، ورموز أخضر/أزرق (محفز يغسل قبالة) كما هو الحال في الشكل 1A.
(د) الوقت الفاصل بين الخلايا الحية مجهرية [كنفوكل] مجموعة من خلايا هيلا معربا عن بيوسينسور كاسباسيتراكير الثدييات على رتا قبل (أنا)، ومن خلال التعرض إلى 1µM ستوروسبوريني (الثاني - الثالث)، وبعد إزالة ستوروسبوريني من الثقافة المتوسطة (الرابع - السابع). الصور المدمجة إشارات DIC ودسريد. الأسهم تشير إلى الخلية 1 (أصفر) وخلية 2 (أخضر).
(E) الخلية الحية الوقت الفاصل بين [كنفوكل] مجهرية من الخلايا غير المعالجة هيلا معربا عن بيوسينسور. الصور المدمجة إشارات DIC ودسريد. وتشير الأسهم البيضاء إلى تقسيم الخلايا.
الدوكسيسيكلين (1ug/mL) كان حاضرا في المتوسط خلال التجارب التي تظهر في لوحات (د) و (ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . المورفولوجية النظام المزدوج بيوسينسور كاسباسيتراكير. (اعتمد مع الإذن من تانغ et al., 2015 التقارير العلمية، 9:9015 19 ).
(أ) رسم تخطيطي للنظام بيوسينسور Gal4 كاسباسيتراكير المورفولوجية .
(ب) رسم تخطيطي caspase الحساسة (دقفد) والتحكم غير متحسسة caspase (دقفا) Gal4.
(ج) التخطيطي المبيض المورفولوجية ، ومخطط انسيابي لخلية الموت-التعريفي في الذباب عمرها 1 يوم، متبوعاً باسترداد 3 أيام في حالة طبيعية. الصورة المورفولوجية المقدمة من دارين أوبارد.
(د) صورة [كنفوكل] الممثل من الدوائر البيض من المبيض من ذبابة بيوسينسور الإناث تتغذى على الطعام يطير العادي لمدة 6 أيام (دون علاج).
(ه) ممثل الصورة [كنفوكل] الدوائر البيض من المبيض من ذبابة بيوسينسور الإناث الصدمة الباردة وضعت في-7 درجة مئوية ح 1 وثم تحولت إلى حالة الثقافة العادية لمدة يوم واحد (الصدمة الباردة، CS).
(و) مثل لوحة ه ما عدا الذباب الصدمة الباردة تحولت إلى حالة الثقافة العادية لمدة 3 أيام (مسترد بعد CS).
(ز) ممثل الصورة [كنفوكل] من البيض يطير الدوائر من المبيض من بيوسينسور الإناث المتعطشة تتغذى على السكروز 8% في أجار 1% دون البروتين لمدة 3 أيام (المجاعة).
(ح) مثل لوحة ز إلا الذباب المعالجة تحولت إلى الطعام يطير العادي لمدة 3 أيام بعد العلاج المجاعة البروتين (إعادة تغذية).
(ط) مثل لوحة ز ما عدا عرض تجويع كاسباسي فيكاسباسيتراكير (دقفا) الحساسة biosensor الإناث الذباب، كانت بمثابة مراقبة سلبية.
(ي) الصورة [كنفوكل] ممثل لدوائر البيض من الإناث جوعاً وإعادة تغذية المورفولوجية. تشير الأسهم إلى التجارة والنقل النووي معربا عن الخلايا ممرضة (أسود) وبويضات (أبيض) والخلايا جريب (أصفر) من الدوائر البيض، وفي جيرماريوم (أخضر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . الآثار الفسيولوجية والمرضية والعلاجية للقيامة. (اعتمد مع الإذن من تانغ et al., F1000Res 2017، 06:43 21 ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النظام المزدوج بيوسينسور كاسباسيتراكير هو أداة فريدة من نوعها تتيح كشف مؤخرا ورواية أو نشاط caspase الجارية، وتتبع الخلايا التي عكسها موت الخلايا عملية، والبقاء على قيد الحياة بعد أن شهدت caspase النشاط في الجسم الحي. بينما قد افترض caspase النشاط تقليديا كسمة مميزة للمبرمج، وتكشف الدراسات المتزايدة أن النشاط غير apoptotic caspase يلعب الأدوار المحتملة في وظائف الخلية الطبيعية المتنوعة، مثل تنظيم نشاط الخلايا العصبية79، 80، والتعلم والذاكرة81،82،،من8384، قمع نيكروبتوتيك خلية الموت85،86،، النطف تفريد87 88, ميكرورنا تجهيز89، وانتشار الخليوي90، ومصير الخلية الزخرفة91. بالإضافة إلى المبرمج والقيامة، ولذلك يمكن اكتشاف النظام بيوسينسور كاسباسيتراكير غير أبوبتوتيك كاسباسي النشاط، التي موجودة في الدماغ والفصوص البصرية، فؤاد، القناة الهضمية، Malpighian الأنابيب، القصبة الهوائية، والعضلات والأنسجة الأخرى من المورفولوجية19،،من4664. يمكن أن تمثل هذه الإشارات بيوسينسور أيضا بنشاط أناستاتيك الحالية أو الماضية أثناء وضع الجنين أو التوازن الطبيعي في هذه الأنسجة. دراسة القيامة بعد خلية عابر الذي يحفز الموت الإجهاد البيئي في الحيوانات الحية، من الأهمية بمكان اختيار الأنسجة مع الخلايا التي يحمل أي نشاط بيوسينسور كاسباسي تحت ظروف فيزيولوجية طبيعية، ولكن التي يمكن أن يتسبب الخضوع كاسباسي التنشيط بواسطة الاستقراء موت الخلية عابرة. الدوائر البيض مثالية لهذا الغرض، لأن لديهم أي نشاط caspase من جيرماريوم إلى المرحلة 10 عادة أثناء تكون البويضات58،،من5992.

تعريض الإناث المورفولوجية للضغوط البيئية عابرة، مثل بروتين التجويع والصدمة الباردة، يمكن أن كفاءة تؤدي إلى تفعيل caspase وموت الخلايا في البيض الدوائر19،،من5758، 78. وتشمل الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول تجنب خلية طويلة الموت التعريفي للذباب. الشروط الأمثل من البروتين المجاعة (السكروز 8% في 1% أجار لمدة 3 أيام) وصدمة البرد (ح 1 في-7 سج) الذباب الإناث يمكن أن تؤدي عملية الإعدام caspase-تنشيط خلية في الدوائر البيض، وتسمح لهم باسترداد بعد الذباب أكد يتم إرجاعها إلى حالة طبيعية19. يمكن أن يؤدي العلاج المطول مع حافز موت خلية أكثر الدوائر البيض على الخضوع لعملية موت الخلية، ولكن الانتعاش هو أيضا انخفاض المعدل يفترض أنه نظراً لأن الدوائر البيض الموت تجربة أضرار جسيمة بعد إصلاح.

خطوة حاسمة إضافية في هذا البروتوكول خفض الإشارات الخلفية كاسباسيتراكير في الدوائر البيض بعبور، ورفع والحفاظ كاسباسيتراكير الذباب في انخفاض درجة حرارة، مثل 18 ياجيم في حين أن غالبية الدوائر البيض من تربيتها على النحو الأمثل الذباب لا تعرض النشاط كاسباسي في جيرماريوم من خلال المرحلة 10 أثناء تكون البويضات58، يمكن أن يحمل حوالي 1 في المائة دوائر البيض caspase biosensor النشاط دون الاستقراء موت الخلية19 . وهذا قد يعكس معدل التناقص الطبيعي بسبب أخطاء فطرية أو يمكن أن تسبب عن غير قصد أثناء تكون البويضات من ظروف المختبر القياسية. كما يعرض Gal4 نشاط أقل في الذباب في درجة حرارة منخفضة93، تربية الذباب في 18 سج وليس في درجة حرارة الغرفة، يمكن أن تقلل من الإشارات الذاتية التي ينشط فيها نظام كاسباسيتراكير. بدلاً من ذلك، التحول الذباب إلى درجة حرارة أعلى، مثل 29 سج، يمكن زيادة حساسية نظام كاسباسيتراكير، والواجب لزيادة في نشاط Gal493، وأخرى يحتمل أن تكون درجة الحرارة-تعتمد الذاتية الانزيمية الأنشطة.

من المهم التمييز بين الخلايا كاسباسيتراكير الإيجابية التي تخضع لعملية موت الخلايا أو القيامة من الخلايا التي يحمل النشاط كاسباسي غير أبوبتوتيك. الخلايا Apoptotic الإعراب عن طلب تقديم العروض (العلامة عابر لنشاط caspase الجارية أو الأخيرة)، وغالباً ما التجارة والنقل (صانع الدائمة للماضي كاسباسي النشاط) في معاملة التعريفي المبرمج، وهذه تموت الخلايا يكون النشاط الجاري كاسباسي Gal4 أن تهزم المنشط، ثم ينشط عابرة (RFP تعتمد على النشاط Gal4) والدائمة (آثار Gal4 فلبس-FRT وساطة بروتينات فلورية خضراء) الصحفيين نظام التتبع ز. المبرمج لهذه الخلايا يمكن أن تؤكده المورفولوجية والبيوكيميائية بصمات هذه الولايات المتحدة النووية التكثيف الكشف عنها بواسطة تلطيخ الأصباغ النووية14،،من1958، وانشقاق caspase الكشف عنها بواسطة 19،إيمونوستينينج94. تعرض الخلايا التي مرت بالفعل القيامة التعبير بروتينات فلورية خضراء دائمة بسبب هذا الحدث فلبس بوساطة جزئ ز-تتبع نظام. هذه الخلايا أن أعرب عن لا طلب تقديم العروض لديهم أي نشاط caspase مستمرة، ولا غيرها من السمات المميزة للمبرمج19. كما عرض هذه الخلايا مورفولوجيا النووية العادية. الخلايا لها جارية غير apoptotic caspase النشاط غالباً عرض التعبير طلبات تقديم العروض والتجارة والنقل، ولها أيضا مورفولوجيا نووية عادية19.

يمكن أن يكون من الصعب تمييز الخلايا التي شهدت القيامة من تلك الخلايا التي كانت في الماضي غير apoptotic caspase النشاط، لأن كليهما عرض فقط بروتينات فلورية خضراء وقد لا توجد سمة مميزة لموت الخلايا. ولذلك، يجب أن تكون حذراً مراقبة تجارب شملت19. للحصول على أمثلة، لدراسة القيامة في الدوائر البيض، من الضروري دراسة تعبير بروتينات فلورية خضراء في أكد تعافي الذباب والذباب غير أكد (مراقبة سلبية). يجب أن تظهر الذباب تعافي خلايا معربا عن التجارة والنقل أكثر من الذباب بهيج، إذا حدث القيامة بعد تفعيل caspase. من المهم أيضا التمييز بين إشارات الفلورسنت كاسباسيتراكير من الأسفار السيارات غير محدد، كما لاحظ في بشرة، والصبغات، وهيئات الدهون19. نحن تولدها المراقبة السلبية biosensor الذباب تحور caspase الانقسام وموقع بيوسينسور (دقفد) إلى تسلسل غير كليفابل (دقفا) ومما جعل بيوسينسور عنصر التحكم غير المستجيبة ل النشاط كاسباسي19. الإشارة اكتشاف في كاسباسي الحساسة (دقفد) ولكن ليس في الذباب biosensor المراقبة السلبية (دقفا) من إشارة ذات الاهتمام، والناجمة عن النشاط caspase، بدلاً من السيارات-الأسفار.

يمكن تحديد جهودنا الحالية المورفولوجية المزدوج كاسباسيتراكير بيوسينسور الخلايا ذات النشاط caspase "الأخيرة" بالتعبير عن طلب تقديم العروض، والخلايا ذات النشاط caspase "الماضية" حسب تعبير بروتينات فلورية خضراء19. ونلاحظ أن طلب تقديم العروض لا مؤشر نشاط caspase "الوقت الحقيقي"، لأنه يأخذ بضع ساعات من وقت رد الفعل ل Gal4 محرك التعبير عن طلب تقديم العروض استجابة للنشاط كاسباسي. لإضافة دالة "وقت الحقيقي"، بيوسينسور كاسباسيتراكير المورفولوجية يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع بيوسينسور إيكاسبير وضعت مؤخرا52، "الوقت الحقيقي" و "الظلام إلى مشرق" في فيفو بيوسينسور الذي يظهر به إشارة استعملنا فقط عندما يكون المشقوق من كاسباسيس.

وبصرف النظر عن المبرمج، كاسباسيتراكير يمكن أن يحتمل أيضا تنشيط خلال الأنواع البديلة لموت الخلايا كخلايا يمكن التبديل مسارات موت الخلية خلال دورتهم مباشر أو غير مباشر ويشمل تفعيل caspase، مثل أوتوفاجي بعد المجاعة95،96، نخر غشاء البلازما الباردة الناجمة عن صدمة تمزق19،،من5556،78، والناجمة عن ستاوروسبوريني نيكروبتوسيس97، 98. أظهرت دراساتنا السابقة والحالية أن أجهزة الاستشعار كاسباسيتراكير يمكن تسمية الخلايا المستردة من هذه الخلية الموت الحث في المختبر أو في فيفو17،،من1819 , 20 , 21-كما يمكن تنشيط هذه الخلية الموت الحث وحدها في نفس الوقت خلية الموت مسارات متعددة في نفس الخلايا، استرداد هذه تموت الخلايا يوحي بأن القيامة هي ظاهرة انتعاش خلية عامة التي يمكن عكس موت الخلايا المختلفة العمليات بما في ذلك المبرمج، أوتوفاجي، ونخر ونيكروبتوسيس، بصورة فردية أو في وقت واحد.

بيوسينسور كاسباسيتراكير في فيفو سييسر السعي إلى وظائف غير معروفة حتى الآن، والآليات، والآثار العلاجية للقيامة (الرقم 4)21. للكشف عن التوقيع الجزيئي للقيامة، أجرينا دراسات ميكرواري التعبير المورثات الجينوم كل الوقت-الدورة التدريبية لتحليل خلايا الكبد الأولية الماوس أثناء عكس المبرمج الناجمة عن الإيثانول، ومن المثير للاهتمام، وجدت تغييرات ملفتة للنظر في نسخ جينات المشتركة في مسارات متعددة بما في ذلك استجابة تلف الحمض النووي الموالية البقاء على قيد الحياة، والمضادة الأكسدة، هستون تعديل، والأوعية، والخلية والهجرة والتحول18،21. هذا الاستنتاج تدعمه دراستنا التحقق من استعادة الخلايا البشرية سرطان الكبد HepG2 من المبرمج18،21، وكذلك دراسة مستقلة حديثة تسلسل الحمض النووي الريبي خلايا هيلا في الانتعاش من المبرمج99. من المثير للاهتمام، ومتابعة تنظيم بعض العوامل المؤيدة البقاء على قيد الحياة في خلايا أناستاتيك أيضا لوحظت في عكس قصور القلب، وتطور الورم والسرطان تكرار100،،من101102، مما يشير إلى مشاركة محتملة للقيامة. لدراسة إمكانات القيامة الفسيولوجية والمرضية والعلاجية، من المهم تحديد الخلايا أناستاتيك وتتبع مصيرهم في الحيوانات الصغيرة، كما ستمكن هذه الدراسات الميكانيكية والعلاجية. لدينا المورفولوجية والثدييات كاسباسيتراكير أجهزة استشعار العوامل البيولوجية سوف تكون أدوات مفيدة لاختبار المساهمات المحتملة للقيامة في التطور الطبيعي والتوازن واستعادة الأنسجة، تطور الورم، تكرار سرطان وخبيث. الاستنتاج من هذه الدراسات سوف زيادة فهمنا لدور القيامة الطبيعية، وتوفر إمكانية لتحديد النهج العلاجية الجديدة الثورية للأمراض المستعصية بالتوسط موت الخلية والبقاء على قيد الحياة من خلال السيطرة على القيامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر أوبارد دارين للصورة المورفولوجية في الشكل 3، وفي المخطوطة الفيديو؛ ج. هردويك ماري ووأد جيبسون هيذر م. لامب لمناقشة قيمة من هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل قبل السير إدوارد ينادي التذكارية زمالة (H.L.T.)، الدكتور والتر سيتو التذكارية المنح الدراسية (H.L.T.)، منح فولبرايت 007-2009 (H.L.T.)، منح زمالة "مؤسسة بحوث علوم الحياة" (H.L.T.)، ولجنة التحقيق الوطنية K22 CA204458 (H.L.T.). وكان "تانغ لام هو" شورل وزميل مؤسسة كورتشي كاي مؤسسة بحوث علوم الحياة (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

الطب، 132 قضية، القيامة، المبرمج، أوتوفاجي، بيوسينسور، كاسباسي، كاسباسيتراكير، نخر، نيكروبتوسيس، برمجة موت الخلايا، عكس المبرمج
الكشف عن القيامة <em>في فيفو</em> قبل بيوسينسور كاسباسيتراكير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter