Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Abstract

Anastasis (Grieks voor "stijgen tot leven") is een recent ontdekte cel herstel fenomeen waarbij cellen sterven kunt omkeren alsnog cel dood processen die in het algemeen wordt verondersteld dat zijn intrinsiek onomkeerbaar. Bevordering van anastasis kan in principe reddings- of behouden gewond cellen die moeilijk te vervangen zoals cardiomyocytes of neuronen, teneinde het herstel van het weefsel. Omgekeerd, onderdrukken van anastasis in kankercellen, apoptosis na anti-kanker therapieën, ondergaan kan zorgen voor de dood van de cel van de kanker en verminderen de kans op herhaling. Echter, deze studies hebben belemmerd door het ontbreken van hulpmiddelen voor het bijhouden van het lot van de cellen die u ondergaan anastasis in levende dieren. De uitdaging is het identificeren van de cellen die de cel dood proces ondanks hun morfologisch normale uiterlijk na herstel hebben omgekeerd. Om deze moeilijkheid te overwinnen, hebben wij ontwikkeld Drosophila en zoogdieren CaspaseTracker biosensor systemen die kunnen identificeren en de anastatic cellen in vitro of in vivopermanent kan bijhouden. Hier presenteren we in vivo protocollen voor de generatie en het gebruik van het systeem van de dubbele biosensor CaspaseTracker op te sporen en het bijhouden van anastasis bij Drosophila melanogaster na voorbijgaande blootstelling aan cel dood prikkels. Terwijl conventionele biosensoren en protocollen cellen actief ondergaat apoptotic celdood etiketteren kunnen, de CaspaseTracker biosensor kan permanent het label van cellen die zijn hersteld na activering van caspase - een waarmerk van laat-stadium apoptosis, en om actieve apoptotic processen gelijktijdig te identificeren. Deze biosensor kan ook het herstel van de cellen die geprobeerd andere vormen van dood van de cel die direct of indirect caspase-activiteiten betrokken bijhouden. Daarom dit protocol stelt ons in staat om continu bijhouden van het lot van deze cellen en hun nakomelingen, vergemakkelijking van toekomstige studies van de biologische functies, moleculaire mechanismen, fysiologische en pathologische gevolgen en therapeutische implicaties van Anastasis. We bespreken ook de nodige controles om te onderscheiden van de cellen die u ondergaan van anastasis uit die het weergeven van niet-apoptotic caspase activiteit in vivo.

Introduction

Geprogrammeerde celdood, zoals apoptosis, speelt een essentiële rol in de embryonale ontwikkeling en normale homeostase door het elimineren van ongewenste, gewonde of gevaarlijke cellen in meercellige organismen1,2,3. Het verlies van evenwicht tussen celdood en overleving kan leiden tot fatale gevolgen hebben, zoals kanker, hartfalen, auto-immuniteit en degeneratie4,5,6,7,8. Activering van de beul caspases heeft traditioneel beschouwd als de "point of no return" in apoptosis9,10,11, zoals het snelle en massale cellulaire sloop12, triggers 13,14,15,16. Uitdagend deze algemene dogma, we laten zien dat kunnen gekweekte stervende primaire cellen en kankercellen dood kenmerken waaronder plasmamembraan blebbing, cel krimp, herstellen aan niet alleen na activering van caspase, maar ook volgende belangrijke cel mitochondriale fragmentatie, introductie van mitochondriale cytochroom c in het cytosol, nucleaire en condensatie van de chromatine, DNA-beschadiging, nucleaire fragmentatie, mobiele oppervlakte blootstelling van fosfatidylserine (PS), en de vorming van apoptotic organen 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Wij stellen voor dat anastasis is een intrinsieke cel herstel fenomeen, zoals stervende cellen na verwijdering van cel dood stimuli17,18,19,20, herstellen kunnen 21. wij bedacht de term "Anastasis" (Αναστάσης)18, wat betekent "rising tot leven" in het Grieks te beschrijven dit onverwachte cel herstel verschijnsel. Onze waarneming van de anastasis wordt verder ondersteund door recente onafhankelijke studies die ook herstel van cellen onthullen na fosfatidylserine externalization22,23,24, mitochondriale beperkt buitenste membraan permeabilization25, activering van gemengde afkomst kinase-achtige (MLKL) en cel krimp26.

Karakterisering van de mechanismen tot regeling van de anastasis, worden de paradigma-shifting fysiologische, pathologische en therapeutische gevolgen zal hebben. Anastasis kon vertegenwoordigen een voorheen onbekende cytoprotective mechanisme te redden of te bewaren van belangrijke postmitotic cellen en weefsels die moeilijk te vervangen, en eventueel rekening voor hartfalen omkering door ventriculaire lossen met links ventriculaire apparaten (LVADs)27,28, herstel van fotoreceptor cellen na voorbijgaande blootstelling van buitensporige lichte29,30,31, of reparatie van neuronen helpen na hersenen letsel32. Als dus het bevorderen van anastasis cel- en weefseltransplantaties herstel versterken kan. Daarentegen zou anastasis een tactiek van de onverwachte ontsnappen door kankercellen gebruikt om te overleven van cel-dood-inducerende therapie, veroorzaakt kanker herhaling17,18. Dus, het onderdrukken van anastasis in het sterven van kankercellen tijdens en na de kankerbehandeling zou een nieuwe therapeutische strategie om te genezen van kanker door te voorkomen dat hun herval.

Tijdens het proces van anastasis, hebben we gevonden dat sommige herstelde cellen verworven permanente genetische veranderingen en onderging oncogene transformatie, waarschijnlijk te wijten aan DNA-schade opgelopen tijdens apoptosis18,20,21 . Omkeren van het proces van de dood van DNA-beschadigde cellen zou een mechanisme van tumorvorming, potentieel ten grondslag liggen aan de observatie dat herhaald weefsel schade verhoogt het risico van kanker in een verscheidenheid van weefsels, zoals chronische thermische verwonding in de slokdarm geïnduceerde door de consumptie van zeer warme dranken33,34,35, leverschade als gevolg van alcoholisme36,37, tumor evolutie na genotoxische kanker therapie38, 39,40, en ontwikkeling van nieuwe kankergevallen van normale weefsels die zich tijdens de interval tussen de cycli van de anti-kanker therapie41,42,43,44 voordoen . Als de waarde true is, kon gericht op anastasis voorkomen of arresteren van de ontwikkeling van kanker en de progressie. We hebben gevonden dat stervende kiemcellen honger geïnduceerde anastasis in opnieuw gevoed Drosophila19ondergaan.  Als anastasis in geslachtscellen met DNA-beschadiging optreedt, zou het account voor de observatie dat verlengd milieudruk bevordert de ontwikkeling van genetische ziekten. Bijvoorbeeld, bijdragen hongersnoden tot de ontwikkeling van transgenerationele overneembare ziekten zoals diabetes en hart-vaatziekten45. Daarom kan begrip anastasis leiden tot de strategieën voor de preventie van het ontwikkelen van overneembare ziekten veroorzaakt door dit potentiële mechanisme.

Om te profiteren van de ontdekking van anastasis en direct te ontwikkelen innovatieve therapieën, is het essentieel om te bestuderen van de oorzaak en het gevolg van anastasis in levende dieren. Het is echter technisch uitdagend om te identificeren en te volgen anastatic cellen in vivo, omdat de cellen die verhaald van cel dood proces morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen weergegeven, en er geen biomerker voor anastasis is geïdentificeerd nog2118,17,. Om deze problemen aanpakken, ontwikkelden we onlangs een nieuwe in vivo caspase biosensor aangewezen "CaspaseTracker"19, identificeren en traceren van cellen die apoptosis na caspase activering19,46 overleven, de kenmerk van apoptosis10,14. Onderscheiden van de 'real-time' caspase-biosensoren zoals SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 en iCasper52 dat sporen gaande caspase activiteit, de CaspaseTracker biosensor bovendien wezenstrek naar de vermogen voor permanent label cellen die uitdrukkelijke caspase-activiteit zelfs Transient. Daarom wordt het de CaspaseTracker biosensor lange termijn bijhouden ingeschakeld voor anastasis na omkering van caspase-gemedieerde cel dood proces in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) voorbereiding van CaspaseTracker Biosensor vliegen

  1. Anesthetize vliegen met CO2, en een penseel gebruiken voor het overbrengen van 7 tot en met 10 caspase-gevoelige Gal4 (DQVD)19 Maagd vrouwtjes en 7 naar 10 G-Trace53 Gal4 verslaggever jonge mannelijke vliegen (of vice versa) in de dezelfde flacon met vliegen eten en verse gist plakken.
    Opmerking: Kruis van Caspase-gevoelige (DQVD) Gal4 en G-Trace vliegen zal produceren CaspaseTracker nageslacht vliegen. Kruis van Caspase -ingevoelige (DQVA)19 Gal4 en G-Trace vliegen zorgt voor negatieve controle vliegt (zie discussie). Verse gist plakken fungeert als eiwitbron ter verbetering van de eiproductie, dus dat aantal nakomelingen vergroot. Selecteer Maagd vrouwtjes en jonge mannelijke vliegen volgens hun fenotypen54.
  2. De vliegen bij 18 graden Celsius (oC) tijdens het Kruis Incubeer gedurende 3 tot 7 dagen, en vervolgens de vliegen overbrengen in een nieuwe flacon instellen van een nieuwe Kruis bij 18 ° C. Blijven de oorspronkelijke flacon bij 18 ° C incuberen tot nakomelingen eclose vliegt.
    Opmerking: De bovenliggende vliegen naar nieuwe flesjes om te voorkomen dat de overbevolking van de nakomelingen op de oorspronkelijke flacon overbrengen. Bovenliggende vliegen kunnen produceren nakomelingen met vers voedsel en gist plakken op de eerste 2 tot 3 schakelaars, en vervolgens de productiviteit aanzienlijk zal dalen met de tijd. Verhogen van vliegen 18 ° C aspecifieke signaal van CaspaseTracker biosensor kan verminderen (zie discussie).
  3. Selecteer nakomelingen vliegt met juiste fenotypen54 voor volgende experimenten.
    Opmerking: De transgenen van zowel de Gal4 als de G-Trace caspase-gevoelige hier bevinden zich op de tweede chromosoom, in balans met CyO balancer. Selecteer de nakomelingen van de niet-krullend vleugel (zonder CyO), die beide transgenen van caspase-gevoelige Gal4 en G-Trace heeft.

2) toepassing van voorbijgaande cel dood inductie to CaspaseTracker Biosensor Flies

  1. Overdracht van 10 tot 20 nieuw eclosed vrouwtje naar een nieuwe flacon met verse vliegen eten en verse gist plakken voor 1 dag bij 18 ° C vliegt tot kamer eiproductie toestaan door oögenese.
    Opmerking: Het vrouwtje met mannelijke vliegen houden kan verbeteren eiproductie kamer.
  2. Om te induceren ei chambers apoptosis ondergaan door koude schok, overdracht vliegt het vrouwtje naar nieuwe lege flacon, die vervolgens wordt geplaatst bij-7 ° C gedurende 1 uur.
    Opmerking: koude schok verwondt cellen door inducerende plasmamembraan breuk55,56.
  3. Om te induceren ei chambers apoptosis ondergaan door eiwit verhongering, overbrengen in de vrouwelijke vliegen een nieuwe flacon met 8% sucrose en 1% agar voedsel bij 18 ° C gedurende 3 dagen.
    Opmerking: Eiwit honger (niet-eiwit voedsel) kan leiden tot ei kamers te ondergaan apoptosis57,58,59 en autophagy60,61. Schakelaar vliegt naar een nieuwe flacon met 8% sucrose en 1% agar voedsel elke dag optimale conditie van de sucrose vliegen om voedsel te houden.
  4. De gespannen vliegen ook terug overzetten naar een nieuwe flacon met verse vliegen eten en verse gist plakken voor 3 dagen bij 18 ° C te laten herstellen. Ontleden de uitgehongerd en de uitgehongerd-hersteld vliegt naar ei chambers op eierstokken is verkrijgbaar als beschreven62.
    Opmerking: Om te ontleden Drosophila om te verkrijgen van de eierstokken, anesthetize vliegen met CO2, 2 paren van pincet gebruiken om te vliegen hoofd verwijderen en gebruik van de verlostang om te trekken van de basis van de buik te verwijderen van de eierstokken van de vliegen.

3) fixatie en kleuring van ontleed ei kamers voor Imaging

  1. De kamers van de ontleed ei samen met rond 0,5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) overbrengen in 1 mL centrifuge buizen. Laat de eieren om te settelen.
    Opmerking: Coat de plastic pipet tips met 1% bovien serumalbumine (BSA) zijn opgelost in water of PBS om te voorkomen dat het ei kamers te houden op het plastic oppervlak van de tips. De volgende procedures uitvoeren in donker te vermijden photobleaching rood fluorescerende eiwit (RFP, ook bekend als DsRed) en groen fluorescente proteïne (GFP) in de ei-kamers.
  2. Verwijder de PBS door pipetteren en vervolgens toepassen 0,5 mL 4% paraformaldehyde in PBS de ei kamers bij kamertemperatuur in donker gedurende 20 tot 30 minuten vast te stellen.
    Opmerking: Zachte rotatie in dit en de volgende stappen van de incubatie van toepassing.
  3. Verwijder de paraformaldehyde door pipetteren, en vervolgens gewassen de ei-zaal met 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) voor 3 keer.
    Opmerking: Langdurige fixatie kan verminderen de RFP en GFP signalen.
  4. Incubeer de ei-kamers met PBST gedurende 1 tot 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C met zachte rotatie naar permeabilize van de ei-kamers.
    Opmerking: PBST ook ei chambers vast te houden aan het niet-BSA gecoate plastic oppervlak kunt vermijden.
  5. De PBST door pipetteren verwijderen, en vervolgens het toepassen van 0,5 mL 10 μg/mL blauw nucleaire Hoechst kleurstof in PBST op ei kamers voor 1 tot en met 2 h bij kamertemperatuur aan voor nucleus vlek.
    NOTE1: Vermijd langdurige incubatie met nucleaire kleurstof omdat dit niet-specifieke signaal zal verhogen.
    NOTE2: Alternatieve aanpak van nucleus zonder Hoechst vlek is het toevoegen van 200 μL anti-bleken montage agent met de DAPI (Zie materiaal) en overnachting63, vóór de montage van de weefsels op glas cover slip zoals beschreven bij protocol 3.8 uit te broeden.
    NOTE3: het uitvoeren van de kleuring en de volgende procedures in donker te vermijden photobleaching.
  6. Verwijderen van de nucleaire kleurstof door pipetteren, en vervolgens toepassen 0,5 mL PBST te wassen van de ei-kamers in het 1 mL centrifuge buizen voor 3 keer, met 10 tot 20 min incubatie met zachte rotatie tussen elke stap wassen.
  7. Verwijder alle PBST met fijne pipet en past u vervolgens 200 μl anti-bleken montage agent (Zie materiaal) aan het broeden van de ei kamers bij kamertemperatuur gedurende 3 uur of 's nachts bij 4 ° C, totdat de kamers ei naar de bodem van de buis zinken.
    Opmerking: weefsels die hebben volledig geabsorbeerd de montage agent zinken naar de bodem van de buis.
  8. De kamers gekleurd ei door het overbrengen van hen met 200 μl anti-bleken Mount montage agent op een vooraf gereinigd glasplaatje voor beeldvorming door pipetteren, dekking van de ei-kamers met een 20 x 20 mm vooraf schoongemaakte glazen cover slip, en verzegel de cover slip op glasplaatje doordat nagellak aan de rand van de slip van de cover.
    NOTE1: Vooraf reinigen het glasplaatje en cover slip met water of 70% ethanol.
    NOTE2: Solliciteer vaseline tussen het glasplaatje en de cover slip te voorkomen vernietiging van de kamers van het ei door overcompression.
  9. Afbeelding van de ei-kamers met behulp van fluorescentie- of confocal microscoop, met behulp van een 20 x, NA 0,8 Plan-Apochromat doel met excitatie licht golflengte van 405 nm voor nucleaire kleuring (detect emissie ~ 461 nm), 561 nm voor RFP (lopende of recente caspase activiteit) signaal ( Detect emissie ~ 590 nm), en 488 nm voor GFP (verleden caspase-activiteit) signaal (detecteren emissie ~ 518nm).
    Opmerking: Zie onze gepubliceerde protocollen voor microscopie20,64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Terwijl time-lapse levende cel microscopie een betrouwbare methode om de tractus anastasis in gekweekte cellen20 is, is het uitdagend om te identificeren welke cellen hebben ondergaan anastasis in dieren, omdat de herstelde cellen morfologisch te onderscheiden verschijnen van normale gezonde cellen hebben dat niet geprobeerd celdood. Bijvoorbeeld weergeven menselijke baarmoederhalskanker HeLa cellen morfologische kenmerken van apoptosis1,2,14, zoals cel krimp, nucleaire condensatie en plasmamembraan blebbing in reactie op de dood van de cel stimulans van 1µM staurosporine17 (figuur 1A, figuur 1B i-ii). Na het verwijderen van de cel dood stimulus en incubatie in verse medium, ongedaan de stervende cellen maken het proces van cel dood door anastasis17,18, zoals aangegeven door morfologische Herstel (figuur 1B iii-iv), gevolgd door proliferatie (figuur 1B v-vi). Onze vorige studies hebben ook gebruik gemaakt van "real-time" caspase biosensoren, zoals ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) om aan te tonen van de omkering van apoptosis na caspase activering18,20. Deze biosensor lokaliseert aan het cytosol in gezonde cellen (Figuur 1 c, 1 D ik). Bij activering van caspase getriggerd door de cel dood stimulans 3,7% ethanol, is deze YFP gebaseerde biosensor gekloofd door caspases en translocated naar nucleus, waar het zich ophoopt en de resulterende nucleaire fluorescentie van de tag YFP identificeert cellen met gaande Caspase-activiteit (Figuur 1 C, 1 D ii-iii). De stervende cellen ook weergeven morfologische kenmerken van apoptosis tijdens ethanol-inductie1,14,18,20, zoals fragmentatie van buisvormige mitochondriën, nucleaire condensatie, cel krimp en plasmamembraan blebbing (Figuur 1 d ii-iii). Interessant, na verwijdering van de cel dood stimulus, kunnen dezelfde cellen herstellen en herwinnen van normale morfologie (Figuur 1 d iv-viii). Met name de nucleaire fluorescentie van de ApoAlert (gekloofd biosensor) is verdwenen binnen 1 uur in de herstelde cellen (Figuur 1 d iv-viii), mogelijk als gevolg van soortgelijke processen die elimineren van beschadigde onderdelen in de anastatic cellen18 , zoals gekloofd caspase-3, PARP en ICAD gegenereerd tijdens apoptosis. Daarom is een nieuwe strategie is vereist voor het bijhouden van anastasis over een langer tijdsbestek, met name in vivo.

Voor het bijhouden van het lot van anastatic cellen, ontwikkelden we de zoogdieren CaspaseTracker biosensor systeem, waarmee de cellen permanent de labels na gekloofd wordt door de beul caspase activiteit. Deze biosensor bestaat uit een caspase-gevoelige rtTA (omgekeerde tetracycline-gecontroleerde transactivator), en een Cre-LoxP-gebaseerde verslaggever voor rtTA activiteit (figuur 2A-B). In gezonde cellen zonder caspase-activiteit, de transactivator rtTA65 is vastgebonden aan het plasmamembraan anker (Lyn11)66,67, nucleus uitsluiting signaal (NES) van kaart Kinase Kinase (MAPKK)68, en oestrogeen receptor variant (ERT2)69 via caspase-cleavable (DEVD)70 linkers afgeleid van PARP (figuur 2A, 2B). Zoals vastgebonden rtTA kan niet aan de kern van het cytosol translocate, activeren niet het de verslaggever van de rtTA. Na activatie in reactie op een prikkel van cel dood klieven caspases echter de DEVD linkers, bevrijden van de rtTA naar translocate aan de kern (figuur 2B). Eenmaal in de kern, de rtTA bindt aan de tet respons-element (TRE) en triggers voorbijgaande uitdrukking van Cre recombinase, die leidt tot een onomkeerbare recombinatie evenement dat de stop codon cassette tussen de CAG-promotor en de codering reeksen verwijdert rood fluorescerend eiwit (DsRed). Dit resulteert in permanente uitdrukking van DsRed (figuur 2B), die als permanente fluorescerende markering van deze cellen dat blijven leven dient kan nadat ze hebben ervaren caspase-activiteit, evenals hun nakomelingen (figuur 2C).

Om te testen de zoogdieren CaspaseTracker biosensor, we binnengebracht op het HeLa cellen door voorbijgaande transfectie, de cellen met een cel dood stimulans (1µM staurosporine) behandeld en gecontroleerd van herstel van de cellen door time-lapse levende cel confocale microscopie, zoals we hebben beschreven20. Doxycycline (1µg/mL eindconcentratie), die essentieel is voor het toestaan van rtTA activiteit65,71, werd toegevoegd aan het kweekmedium cel inschakelen de biosensor gedurende het gehele experiment. In reactie op de cel dood stimulus weergeven de behandelde cellen kenmerken van apoptosis, met inbegrip van cel krimp en plasmamembraan blebbing als verwachte (figuur 2D i-iii) Na het verwijderen van de cel dood stimulus, kan spoelen de cel laag eenmaal, en toe te voegen verse kweekmedium, anastasis worden waargenomen in de stervende cellen, zoals aangegeven door hun terugkeer naar een normale morfologie (figuur 2D iv-vii). Diagnostisch, hersteld alleen cellen express de DsRed fluorescerende markering tijdens en na anastasis (figuur 2D iv-vii), onderscheiden van zowel niet-teruggewonnen cellen (figuur 2D iv-vii) en cellen niet blootgesteld aan de cel dood stimulus (figuur 2E). Dit toont aan de toepassing en het nut van de zoogdieren CaspaseTracker als een roman nieuw hulpmiddel voor de identificatie en etikettering permanent anastatic cellen herstellen van caspase-activering, en biedt een manier om te volgen en bestuderen van hun langere lot.

Voor het detecteren en bijhouden van anastasis in levende dieren, zijn CaspaseTracker biosensor transgene dieren vereist. Dus, we eerst gebruikten Drosophila melanogaster als een model systeem19, omdat aangezien er een belangrijk genetisch hanteerbare organisme voor studie van dierlijke ontwikkeling en ziekten bij de mens72,73,74 ,75. Als aangepast ten opzichte van de zoogdieren CaspaseTracker biosensor, kan de Drosophila dual biosensor identificeren en onderscheid "recente/on-going" uit "verleden" caspase-activiteit. Deze dubbele biosensor bestaat uit een caspase-gevoelige Gal419, en de Gal4 verslaggever G-Trace53 (figuur 3A). In cellen met geen caspase-activiteit, de gist transcriptiefactor Gal4 is vastgebonden aan een plasmamembraan anker (mCD8) domein via een caspase-cleavable linker (DQVD), afgeleid van DIAP1 (figuur 3B), met een 21NN/GV22-mutatie ter voorkoming van aantasting van Gal4 door de N-einde regel op caspase splitsing van de linker afterAsp2076, en een D135R mutatie af te schaffen de remmende drICE caspase-functie in de BIR1 domein77. Zoals vastgebonden Gal4 kan niet naar nucleus zonder splijten door caspase vrij te geven translocate, blijft de verslaggever van de Gal4 G-Trace inactief in de cellen hebben geen caspase activiteit19. Bij activering van caspase klieven geactiveerde caspases echter de DQVD linker, bevrijden van Gal4 naar translocate in de kern te activeren van de G-Trace verslaggever (figuur 3A)19. Gal4 bindt aan specifieke stroomopwaarts activeren sequenties (UAS) om te leiden tot voorbijgaande transcriptie en expressie van RFP, die dan fungeert als een TL verslaggever van recent of actueel caspase-activiteit tot de Gal4 (caspase) activiteit stopt en dan RFP eiwit gedegradeerd. Gal4 activeert ook uitdrukking van FLP recombinase uit de transgenic, wat leidt tot een recombinatie gebeurtenis die Hiermee verwijdert u de stop codon cassette tussen de promotor van een ubiquitin (Ubi) en een codering volgorde voor nucleus-gerichte GFP (nucGFP). Dit resulteert in permanente uitdrukking van nucGFP, die fungeert als de permanente markering van de cellen die hebben ervaren caspase-activiteit en levend blijven.

Als u wilt testen de Drosophila CaspaseTracker biosensor voor het opsporen van apoptosis en anastasis werden in vivo, CaspaseTracker vrouw vliegt onderworpen aan fysiologische stress (afbeelding 3 c), zoals koude schok19, die kan efficiënt trigger celdood, apoptosis, zoals aangegeven door de activering van caspase nucleaire condensatie en cel krimp19,78, en ook necrose als gevolg van koelen, dat leidt verlies van de membraan integriteit en lekkage van cytoplasmatische tot inhoud55,56. Zoals verwacht, CaspaseTracker is niet geactiveerd in het ei kamers van controle vliegen waar stressgerelateerde celdood niet was geïnduceerde (figuur 3D). Daarentegen de ei-kamers van gestresste vliegen één dag na de koude schok toonde aan niet alleen karakteristieke apoptotic cel krimp en nucleaire condensatie, maar ook RFP en GFP expressie, met vermelding van de aanwezigheid van recente of gaande (RFP +) en verleden (GFP +) caspase activiteit (figuur 3E). Nochtans, 3 dagen na de beklemtoonde vliegen terug te keren naar normale niet-benadrukkend voorwaarde, GFP, maar geen RFP, expressie was gedetecteerd in de herstelde ei kamers (figuur 3F). Dit geeft aan dat ei kamers dat caspase activiteit na stress had uitgedrukt konden overwinnen van de cel dood proces en overleven.

Als u wilt verder testen omkeerbaarheid van cel dood proces in ei kamers19, CaspaseTracker vrouwelijke vliegen benadrukt door eiwit verhongering na gevoed 8% sucrose in 1% agar voor 3 dagen. Vorige studies aangetoond dat eiwitten honger leiden caspase-gemedieerde apoptosis en autophagy in weefsels met somatische tot kan en germinale cellen, met inbegrip van ei chambers57,60,,61. Zoals verwacht, werd CaspaseTracker geactiveerd in ei kamers na 3 dagen van eiwit honger (Figuur 3 g). De stervende ei kamers tentoongesteld zowel apoptotic morphologies en expressie van de RFP en GFP biosensor markers, met vermelding van recente of lopende (RFP +) en verleden (GFP +) caspase activiteit (Figuur 3 g). Om aan te tonen dat CaspaseTracker herstelde cellen die eerder caspase activeren na een overlijden stimulans ervaren kunt bijhouden, werden de uitgehongerd vliegen vervolgens overgedragen aan normale eiwithoudende vliegen voedsel. Zoals verwacht, ontbreken de herstelde ei kamers van deze opnieuw gevoed vliegen de RFP voorbijgaande caspase-verslaggever, die aangeeft geen recente of lopende caspase-activiteit (Figuur 3 H). Echter had de ei kamers in deze vliegen nadat het verlichten van stress door hen terug te keren naar normale voedsel in deze ei-kamers op de GFP caspase verslaggever (Figuur 3 H), waaruit blijkt dat de cellen weergegeven omgedraaid het proces ingeleid cel dood op een punt na activering van caspase. Verificatie dat de CaspaseTracker biosensor activiteit wordt geactiveerd door caspase werd verkregen door de splitsingsproducten volgorde DQVD vervangen door de volgorde van de DQVA, welke caspase is kunnen klieven en die biosensor activiteit (figuur 3B, 3I af te schaffen ).

Nadat de CaspaseTracker Drosophila hersteld door eiwit honger, vonden we dat meerdere soorten van de cel in de ei-kamers, zoals somatische (follikel) cellen en germline cellen (cellen van de verpleegkundige en eicellen), weergegeven GFP, maar niet RFP (figuur 3J )19, die aangeeft dat deze cellen anastasis na activering van caspase kunnen ondergaan. Interessant is dat label de GFP ook cellen in de germarium (figuur 3J)19, waarin de cellen van de stam, samen met de bijbehorende ei kamers in dezelfde ovariole keten. Daarom kunnen deze GFP-positieve ei kamers zijn afgeleid van stamcellen die na activering van caspase van cel dood proces zijn hersteld. Nog belangrijker is, vliegt het uitgehongerd en opnieuw gevoed vrouwtje lag vruchtbare eieren die kunnen produceren GFP-uiten nakomelingen vliegen19, suggereren dat potentieel de cellen omgekeerd proces van de dood van de cel na activering van caspase blijkbaar normale functie kan herwinnen. Toekomstige studies zijn nodig om te bepalen als nakomelingen vliegen die als gevolg van anastasis overleven permanente gevolgen vertonen.

Figure 1
Figuur 1 . Herstel van HeLa cellen na cel dood inductie.
(A) schematisch diagram van de aanpak van celdood te veroorzaken en vervolgens toestaan cellen te herstellen na verwijdering van cel dood inductor sterven.
(B) Time-lapse levende cel DIC microscopie van gezonde HeLa cellen (ik), dezelfde groep cellen na behandeling met 1µM staurosporine (ii), en vervolgens gewassen en verdere geïncubeerd met verse voedingsbodem te verwijderen van de staurosporine ( III-vi). Witte pijl geeft een scheidslijn cel.
(C) schematisch diagram van caspase biosensor fusieproteïne NES-DEVD-YFP-NLS, en de subcellular localisatie van YFP tijdens de cel dood inductie en na anastasis.
(D) Time-lapse levende cel confocale microscopie van één HeLa cel uiten de caspase biosensor fusieproteïne NES-DEVD-YFP-NLS voordatik, tijdens de blootstelling aan 3,7% ethanol (ii - iii), en na het verwijderen van ethanol uit het kweekmedium (iv - viii). Hier zijn beelden van de caspase biosensor alleen (groene fluorescentie, bovenste rij); beelden van de Hoechst gebeitste nucleus (blauwe fluorescentie)- en mitochondriën (rode fluorescentie) samengevoegd (middelste rij), en afbeeldingen in de middelste rij verder samengevoegd met DIC beelden (onderste rij). Witte pijlen in de bovenste rij geven aan nucleaire gelokaliseerde YFP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Zoogdieren CaspaseTracker biosensor systeem.
(A) schematisch diagram van de caspase-gevoelige rtTA.
(B) schematisch diagram van de zoogdieren CaspaseTracker rtTA biosensor systeem.
(C) stroomdiagram van het gebruik van het CaspaseTracker rtTA biosensor systeem om op te sporen van anastasis. Rood/gele driehoek (cel dood inductor van de toepassing) en groen/blauw (wassen inductor van)-symbolen zijn zoals in figuur 1A.
(D) time-lapse levende cel confocale microscopie van een cluster van HeLa cellen uiten van de zoogdieren CaspaseTracker rtTA biosensor vóór (ik), en tijdens de blootstelling aan 1µM staurosporine (ii - iii), en na het verwijderen van staurosporine van het kweekmedium (iv - vii). Samengevoegde afbeeldingen van DIC en DsRed signalen. Pijlen geven de cel 1 (geel) en cel 2 (groen).
(E) time-lapse levende cel confocale microscopie van de onbehandelde biosensor-uiten HeLa cellen. Samengevoegde afbeeldingen van DIC en DsRed signalen. Witte pijlen geven aan scheidslijn cellen.
Doxycycline (1ug/mL) was aanwezig in het medium in de experimenten in panelen (D) en (E)weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Drosophila CaspaseTracker dual biosensor systeem. (Aangenomen met toestemming van Tang et al., wetenschappelijke rapporten 2015, 9:9015 19 ).
(A) schematisch diagram van de Drosophila CaspaseTracker Gal4 biosensor systeem.
(B) schematisch diagram van het caspase-gevoelige (DQVD) en de caspase-ongevoelig controle (DQVA) Gal4.
(C) Schematische voorstelling van Drosophila eierstok, en een stroomdiagram voor de cel dood-inductie in 1-dag oud vliegen, gevolgd door 3-daags herstel in normale toestand. Drosophila afbeelding geboden door Darren Obbard.
(D) vertegenwoordiger confocal afbeelding van ei kamers van het ovarium van een vrouwelijke biosensor vliegen gevoed met normale vliegen voedsel 6 dagenlang (onbehandeld).
(E) vertegenwoordiger confocal beeld van ei kamers van het ovarium van een koud geschokt vrouwelijke biosensor vliegen geplaatst bij-7 ° C gedurende 1 h en vervolgens overgeschakeld op normale cultuur voorwaarde voor 1 dag (koude schok, CS).
(F) als paneel E behalve de koude geschokt vliegen werden overgeschakeld naar normale cultuur voorwaarde voor 3 dagen (hersteld na CS).
(G) vertegenwoordiger confocal afbeelding van ei kamers van het ovarium van een uitgehongerd vrouwelijke biosensor vliegen gevoed met 8% sacharose in 1% agar zonder eiwitten voor 3 dagen (Starved).
(H) als paneel G met uitzondering van de behandelde vliegen werden overgeschakeld naar normale vliegen voedsel voor 3 dagen na eiwit honger behandeling (opnieuw gevoed).
(I) als G behalve het tonen van de honger van caspase ingevoelige CaspaseTracker (DQVA) vrouwelijke biosensor vliegen, die als negatieve controle diende paneel.
(J) representatieve confocal beeld van ei kamers van een uitgehongerd en opnieuw gevoed vrouwelijke Drosophila. Pijlen geven aan nucleaire GFP uiten in de verpleegkundige cellen (zwart), de eicellen (wit) en het follikel cellen (geel) van ei kamers en in de germarium (groen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Fysiologische en pathologische therapeutische implicaties van anastasis. (Aangenomen met toestemming van Tang et al., F1000Res 2017, 6:43 21 ). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het systeem van de dubbele biosensor CaspaseTracker is een roman en uniek instrument dat maakt de ontdekking van recente of lopende caspase-activiteit, en het bijhouden van cellen die zijn omgekeerd celdood verwerken en overleven na het ervaren van caspase activiteit in vivo. Terwijl caspase activiteit traditioneel als een stempel van apoptosis aangenomen is, openbaren groeiende studies dat niet-apoptotic caspase activiteit potentiële rollen in uiteenlopende normale cel functies, zoals regulering van neuronale activiteit79, speelt 80, leren en geheugen81,82,83,84, onderdrukking van necroptotic cel dood85,86, spermatid individualisering87, 88, microRNA verwerking89, cel proliferatie90, en het lot van de cel patronen91. Naast apoptosis en anastasis, kan het CaspaseTracker biosensor systeem dus detecteren non-apoptotic caspase activiteit, die aanwezig is in de hersenen en optische kwabben, cardia, gut, Malpighian tubuli, luchtpijp, spieren en andere weefsels van Drosophila19,46,64. Dit signaal biosensor kan ook de activiteit van de huidige of vroegere anastatic vertegenwoordigen tijdens de embryo-ontwikkeling of normale homeostase in deze weefsels. Studeren anastasis na voorbijgaande cel dood-inducerende-milieudruk in levende dieren, is het van cruciaal belang om te kiezen van weefsels met cellen die geen caspase biosensor activiteit onder normale fysiologische omstandigheden vertonen, maar die kan worden opgewekt om te ondergaan caspase activering door voorbijgaande cel dood inductie. Ei kamers zijn ideaal voor dit doel, omdat ze meestal geen caspase-activiteiten van germarium naar fase 10 tijdens de oögenese58,59,92 hebt.

Bloot vrouwelijke Drosophila om voorbijgaande milieu benadrukt, zoals eiwit honger en koude schok, kan efficiënt leiden tot activering van caspase en celdood in ei kamers19,57,58, 78. Kritische stappen binnen het protocol omvatten het vermijden van langdurige cel dood inductie te vliegen. De geoptimaliseerde eiwit honger (8% sacharose in 1% agar voor 3-dagen) en koude schok (1 h bij-7 oC) voor vrouwelijke vliegen kunnen leiden tot caspase-geactiveerde cel dood proces in ei kamers en -voorwaarden laten herstellen nadat de gestresste vliegen keert terug naar normale toestand19. Langdurige behandeling met een cel dood stimulans kan leiden tot meer ei kamers om de cel dood proces te ondergaan, maar de opbrengst is ook verminderd, vermoedelijk omdat de stervende ei kamers enorme schade onherstelbaar ervaren.

Een extra kritische stap in dit protocol is het verminderen van de CaspaseTracker achtergrond signaal in ei kamers door kruising, verhogen en het onderhoud van dat de CaspaseTracker vliegt bij een lagere temperatuur, zoals 18 oC. Terwijl de meerderheid van de kamers van het ei van optimaal gefokt vliegen niet weergegeven caspase-activiteit in de germarium door fase 10 tijdens de oögenese58, ongeveer 1% van de kamers van de ei kon vertonen caspase biosensor activiteit zonder cel dood inductie19 . Dit kan duiden op het tarief van de normale slijtage als gevolg van aangeboren fouten of onbedoeld tijdens de oögenese kan worden geactiveerd door standaard laboratoriumomstandigheden. Als Gal4 wordt minder activiteit in vliegt op lage temperatuur93 weergegeven, kan verhogen van vliegen bij 18 oC, in plaats van bij kamertemperatuur, verminderen het endogene signaal dat hiermee activeert u het CaspaseTracker-systeem. U kunt ook kan vliegen over te schakelen naar een hogere temperatuur, zoals 29 oC, oplopen de gevoeligheid van CaspaseTracker systeem, verschuldigde tot toename van de activiteit van Gal493, en mogelijk andere endogene temperatuur-afhankelijke enzymatische activiteiten.

Het is belangrijk om te onderscheiden van de CaspaseTracker-positieve cellen die een proces van de dood van de cel- of anastasis uit cellen die niet-apoptotic caspase activiteit vertonen ondergaan. Apoptotic cellen geven RFP (voorbijgaande marker voor gaande of recente caspase-activiteit) en vaak GFP (permanente maker voor vroegere caspase-activiteiten) in behandeling van apoptose inductie, omdat deze cellen sterven zijn lopende caspase-activiteit die klieven-geactiveerde Gal4, die vervolgens activeert de voorbijgaande aard (Gal4 activiteit-afhankelijke RFP) en de permanente (Gal4 geactiveerd FLPase-FRT gemedieerde GFP) verslaggevers van het G-Trace systeem. Apoptosis van deze cellen kan worden bevestigd door morfologische en biochemische kenmerken deze Amerikaanse nucleaire condensatie gedetecteerd door kleuring met nucleaire kleurstoffen14,19,58, en caspase decolleté gedetecteerd door immunokleuring19,94. Cellen die anastasis al ondergaan hebben weergeven permanente GFP expressie toe te schrijven aan de gebeurtenis FLPase-gemedieerde recombinatie van G-Trace systeem. Deze cellen express geen RFP zoals zij geen gaande caspase-activiteit, noch andere kenmerken van apoptosis19 hebben. Deze cellen geven ook weer normale nucleaire morfologie. Cellen hebben aan de gang zijnde niet-apoptotic caspase activiteit vaak RFP zowel GFP expressie weergeven, en hebben ook een normale nucleaire morfologie19.

Het kan het moeilijk te onderscheiden van cellen die anastasis van de cellen die had afgelopen niet-apoptotic caspase activiteit ervaren, omdat beide alleen GFP worden weergegeven en geen kenmerk van celdood hebben. Daarom is zorgvuldige controle experimenten moeten opgenomen19. Voorbeelden, studie van anastasis in ei chambers, is het noodzakelijk om te bekijken GFP expressie zowel benadrukt-hersteld vliegen en niet-onderstreept vliegen (negatieve controle). Herstelde vliegen moeten tonen meer GFP-uiten cellen dan onbeklemtoonde vliegen, als anastasis na activering van caspase opgetreden. Het is ook belangrijk om te onderscheiden CaspaseTracker fluorescerende signalen van niet-specifieke auto-fluorescentie, zoals waargenomen in de cuticula, pigmenten en instanties die vet19. We negatieve controle biosensor vliegen gegenereerd door muteert de caspase-breukzijde van de biosensor (DQVD) in een niet-cleavable reeks (DQVA) en daardoor de controle biosensor reactieloos caspase activiteit19renderen. Het signaal gedetecteerd in de gevoelige caspase (DQVD), maar niet in de negatieve controle (DQVA) biosensor vliegen is het signaal van belang, veroorzaakt door caspase-activiteit, in plaats van auto-fluorescentie.

Onze huidige Drosophila dual CaspaseTracker biosensor kan identificeren met "recente" caspase-activiteit door expressie van RFP cellen en cellen met "vroegere" caspase-activiteiten door expressie van GFP19. Wij stellen vast dat RFP niet een "real-time" caspase-activiteit-indicator is, omdat het duurt een paar uur van de reactietijd voor Gal4 om te rijden de expressie van RFP in reactie op caspase-activiteit. Om toe te voegen een "real time"-functie, de Drosophila CaspaseTracker biosensor kan worden gecombineerd met de onlangs ontwikkelde iCasper biosensor52, een "real-time" en "dark tot helder" in vivo biosensor dat alleen zijn far-red signaal toont wanneer het gekloofd door caspases.

Afgezien van apoptosis, CaspaseTracker kon potentieel ook worden geactiveerd tijdens alternatieve soorten celdood als cellen cel dood trajecten kunnen schakelen tijdens hun cursus die direct of indirect houdt activering van caspase, zoals autophagy na honger95,96, necrose door de koude schok-geïnduceerde plasmamembraan breuk19,55,56,,78, en staurosporine-geïnduceerde necroptosis97, 98. Onze huidige en vorige studies aangetoond dat de CaspaseTracker biosensoren cellen hersteld van deze cel dood inducties in vitro of in vivo17,18,19 etiketteren kunnen , 20 , 21. als deze cel dood inducties alleen gelijktijdig meerdere trajecten van de dood van de cel in dezelfde cellen activeren kunnen, het herstel van deze cellen sterven suggereert dat anastasis is een algemene cel herstel fenomeen dat verschillende celdood kunt omkeren processen met inbegrip van apoptosis, autophagy, necrose en necroptosis, zowel afzonderlijk als tegelijk.

De in vivo CaspaseTracker biosensor vergemakkelijkt de uitoefening van de nog onbekende functies, mechanismen en therapeutische implicaties van anastasis ()Figuur 4)21. Om te onthullen de moleculaire handtekening van anastasis, we tijdsverloop geheel-genoom gen expressie microarray studies te analyseren van primaire cellen van de lever met muis tijdens omkering van ethanol-veroorzaakte apoptosis, en interessant, vond opvallende veranderingen in uitgevoerd transcriptie van genen die betrokken zijn in meerdere trajecten met inbegrip van de pro-overleving, anti-oxidatie, DNA schade reactie, histone modificatie, angiogenese, cel migratie en transformatie18,21. Deze bevinding wordt ondersteund door onze valideringsonderzoek van het herstel van menselijke leverkanker HepG2 cellen van apoptosis18,21, en ook een recent onafhankelijk RNA-sequencing onderzoek van HeLa cellen in herstel van apoptosis99. Interessant, up-regulatie van sommige pro-overleving factoren gevonden in de anastatic cellen zijn ook waargenomen in hartfalen omkering, tumor progressie en kanker herhaling100,101,102, suggereren de mogelijke deelname van anastasis. Studeren de fysiologische en pathologische therapeutische mogelijkheden van anastasis, is het belangrijk om te identificeren van de anastatic cellen en bijhouden van hun lot in kleine dieren, aangezien hierdoor het mechanistische en therapeutische studies. Onze Drosophila en zoogdieren CaspaseTracker biosensoren zullen nuttige hulpmiddelen voor het testen van de potentiële bijdragen van anastasis in normale ontwikkeling, homeostase, herstel van het weefsel, evolutie van de tumor, kanker herhaling en metastase. Zoeken van deze studies zal verhogen ons begrip van de natuurlijke rol van anastasis, en mogelijkheden te identificeren van revolutionaire nieuwe therapeutische benaderingen voor hardnekkige ziekten door bemiddeling van celdood en overleven door middel van beheersing van de anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Darren Obbard voor Drosophila afbeelding in figuur 3 c en video manuscript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson en Heather M. Lamb voor waardevolle discussie van dit manuscript. Dit werk werd gesteund door een Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright verlenen 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.), en NCI K22 verlenen CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang was een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

Geneeskunde kwestie 132 Anastasis apoptosis autophagy biosensor caspase CaspaseTracker necrose necroptosis geprogrammeerde celdood omkering van apoptosis
Opsporen van Anastasis <em>In Vivo</em> door CaspaseTracker Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter