Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Att upptäcka Anastasis In Vivo av CaspaseTracker Biosensor

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis tekniskt utmanande för att upptäcka i vivo eftersom cellerna som återförts cell dödsprocessen kan vara morfologiskt oskiljbara från normala friska celler. Här beskriver vi protokoll för att upptäcka och spåra celler som genomgår anastasis i levande djur genom att använda vår biosensor nyutvecklade i vivo CaspaseTracker system.

Abstract

Anastasis (grekiska för ”rising till liv”) är ett nyligen upptäckt cell återhämtning fenomen där döende celler kan återföra sent stadium cell death processer som generellt antas vara oupplösligt irreversibel. Att främja anastasis kunde i princip undsättnings- eller bevara skadade celler som är svåra att ersätta exempelvis hjärtmuskelceller eller nervceller, vilket underlättar vävnad återhämtning. Omvänt, undertrycka anastasis i cancerceller, som genomgår apoptos efter anti-cancer terapier, kan säkerställa cancer celldöd och minska risken för återfall. Dessa studier har dock hindrats av bristen på verktyg för att spåra celler som genomgår anastasis i levande djur öde. Utmaningen är att identifiera de celler som har återförts cell dödsprocessen trots deras morfologiskt normala utseende efter återhämtning. För att övervinna denna svårighet, har vi utvecklat Drosophila och däggdjur CaspaseTracker biosensor system som kan identifiera och spåra permanent anastatic celler in vitro eller in-vivo. Här presenterar vi i vivo protokoll för generering och användning av CaspaseTracker dubbla biosensor systemet att identifiera och spåra anastasis i Drosophila melanogaster efter övergående exponering för cell death stimuli. Medan konventionella biosensorer och protokoll kan märka celler aktivt genomgår apoptotisk celldöd, den CaspaseTracker biosensor permanent kan märka celler som har återhämtat sig efter aktivering av kaspas - ett kännetecken för sent stadium apoptos, och samtidigt identifiera aktiva apoptotiska processer. Detta biosensor kan också spåra återvinning av de celler som försökt andra former av celldöd som direkt eller indirekt inblandade kaspas aktivitet. Därför detta protokoll gör det möjligt för oss att kontinuerligt följa dessa celler och deras avkomma, underlätta framtida studier av biologiska funktioner, molekylära mekanismer, fysiologiska och patologiska konsekvenserna och terapeutiska konsekvenser av öde Anastasis. Vi diskuterar också lämpliga kontroller för att skilja celler som genomgår anastasis från dem som visar icke-apoptotiska kaspas aktivitet in vivo.

Introduction

Programmerad celldöd, såsom apoptos, spelar en viktig roll i embryonal utveckling och normala homeostas genom att eliminera oönskade, skadade eller farliga celler i flercelliga organismer1,2,3. Förlust av balans mellan celldöd och överlevnad kan leda till fatala konsekvenser såsom cancer, hjärtsvikt, autoimmunitet och degeneration4,5,6,7,8. Aktivering av bödeln kaspaserna har traditionellt betraktats som den ”point of no return” apoptos9,10,11, eftersom det utlöser snabba och massiva cellulära rivning12, 13,14,15,16. Utmanande denna allmänna dogm, visat vi att odlade döende primära celler och cancerceller kan återställa inte bara efter kaspas aktivering, men också följande viktiga cell death kännetecken inklusive plasmamembranet blebbing, cell krympning, mitokondriell fragmentering, frisläppandet av mitokondriell cytokrom c till cytosolen, kärnkraft och kromatin kondens, DNA-skador, nukleära fragmentering, cell surface exponering av Fosfatidylserin (PS) och bildandet av apoptotiska kroppar 17 , 18 , 19 , 20 , 21. vi föreslår att anastasis är ett inneboende cell återhämtning fenomen, som döende celler kan återhämta sig efter borttagning av cell death stimuli17,18,19,20, 21. vi myntade termen ”Anastasis” (Αναστάσης)18, vilket betyder ”rising till liv” på grekiska, till beskriva fenomenet oväntad cell återhämtning. Vår observation av anastasis stöds ytterligare av senaste oberoende studier som också avslöjar återvinning av celler efter fosfatidylserin externalisering22,23,24, begränsat mitokondriell yttre membran permeabilisering25, aktivering av blandade härstamning kreatinkinas-liknande (MLKL) och cell krympning26.

Karakterisera de mekanismer som reglerar anastasis får paradigm-shifting fysiologiska, patologiska och terapeutiska konsekvenser. Anastasis kan representera en tidigare okänd cytoprotektiva mekanism att rädda eller bevara viktiga postmitotic celler och vävnader som är svåra att ersätta, och möjligen konto för hjärtsvikt återföring av ventrikulära lossning med vänsterkammardysfunktion hjälpa enheter (LVADs)27,28, återvinning av ljusmätare celler efter övergående exponering av överdriven ljus29,30,31, eller reparation av nervceller efter hjärnan skada32. Om så att främja anastasis kunde förbättra cell- och återhämtning. Anastasis kan däremot vara en oväntad fly taktik används av cancerceller för att överleva cell-död-inducerande terapi, orsakar cancer återfall17,18. Därför undertrycka anastasis i döende cancerceller under och efter behandling av cancer kan vara en roman terapeutisk strategi att bota cancer genom att förhindra deras återfall.

Under processen för anastasis, har vi funnit att vissa återvunna celler förvärvat permanent genetiska förändringar och genomgick Onkogen transformation, sannolikt på grund av DNA-skador som uppstått under apoptos18,20,21 . Backning dödsprocessen DNA-skadade celler kan vara en mekanism för uppkomst, potentiellt bakomliggande iakttagelsen att upprepade vävnadsskada ökar risken för cancer i en mängd olika vävnader, såsom kronisk termisk skada i matstrupen inducerad av konsumtion av mycket varma drycker33,34,35, leverskador på grund av alkoholism36,37, tumör evolution efter genotoxiska cancer behandling38, 39,40, och utvecklingen av de nya cancerfallen från normal vävnad som uppstår under pauserna mellan cykler av cancerbehandling41,42,43,44 . Om sant, kunde inriktning anastasis hindra eller arrestera cancerutveckling och progression. Vi har funnit att svält-inducerad döende könsceller genomgår anastasis i åter fed Drosophila19.  Om anastasis sker i könsceller med DNA-skador, det konto för observationen att långvarig miljöbelastning främjar utvecklingen av genetiska sjukdomar. Exempelvis bidrar svältar till utvecklingen av transgenerationell ärftliga sjukdomar som diabetes och koronara hjärtsjukdomar45. Förståelse anastasis kan därför leda till strategier för att förebygga utveckling av ärftliga sjukdomar som orsakas av denna potentiella mekanism.

För att utnyttja upptäckten av anastasis och direkt kunna utveckla innovativa behandlingar, är det viktigt att studera orsak och konsekvens av anastasis i levande djur. Dock det tekniskt svårt att identifiera och spåra anastatic celler i vivo, eftersom cellerna som återhämtat sig från cell death process verkar morfologiskt oskiljbara från normala friska celler, och det finns ingen biomarkör för anastasis identifierade ännu17,18,21. För att lösa dessa problem, vi nyligen utvecklat ett nytt i vivo kaspas biosensor designerat ”CaspaseTracker”19, att identifiera och spåra celler som överlever apoptos efter kaspas aktiveringen19,46, den kännetecknande för apoptos10,14. Skilja det från ”realtid” kaspas biosensorer som SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 och iCasper52 att upptäcka pågående kaspas aktivitet, den CaspaseTracker biosensor har dessutom förmågan att permanent etikett celler express kaspas aktiviteten även övergående. Den CaspaseTracker biosensor kan därför långsiktigt spårning av anastasis efter återföring av kaspas-medierad cell death process i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

(1) förberedelse av CaspaseTracker Biosensor flugor

  1. Söva flugor med CO2, och använda en pensel för att överföra 7 till 10 kaspas-känsliga Gal4 (DQVD)19 oskuld honor och 7 till 10 G-Trace53 Gal4 reporter unga manliga flugor (eller tvärtom) i samma injektionsflaskan med flyga mat och färsk jäst pasta.
    Obs: Kors av kaspas-känsliga (DQVD) Gal4 och G-Trace flugor kommer att producera CaspaseTracker avkomma flugor. Korsa av kaspas -ikänsliga (DQVA)19 Gal4 och G-Trace flugor kommer att ge negativ kontroll flugor (se diskussion). Färsk jäst pasta fungerar som proteinkälla att öka produktionen av ägg, så som ökar antalet avkommor. Välj oskuld honor och unga manliga flugor enligt deras fenotyper54.
  2. Inkubera flugorna på 18 grader Celsius (oC) under korset i 3 till 7 dagar, och sedan överföra flugorna till en ny injektionsflaska att inrätta en ny cross vid 18 ° C. Fortsätta att Inkubera ursprungliga injektionsflaskan vid 18 ° C tills avkomman flyger eclose.
    Obs: Överföra de överordnade flugorna till nya flaskor för att undvika överbeläggning avkommor på ursprungliga injektionsflaskan. Överordnade flugor kan producera avkomma med färska livsmedel och jäst klistra på de första 2 till 3 växlarna, och sedan produktiviteten avsevärt kommer att minska med tiden. Att höja flugor 18 ° C kan minska icke-specifik signal om CaspaseTracker biosensor (se diskussion).
  3. Välj progeny flyger med rätta fenotyper54 för följande experiment.
    Obs: Transgener både kaspas-känsliga Gal4 och G-Trace här finns på den andra kromosomen, balanserad med CyO balancer. Välj icke-lockigt wing avkomman (utan CyO), som har både transgener kaspas-känsliga Gal4 och G-Trace.

(2) tillämpningen av övergående Cell Death induktion till CaspaseTracker Biosensor flugor

  1. Överför 10 till 20 nya eclosed kvinna flyger till en ny injektionsflaska med färska flyga mat och färsk jäst pasta för 1 dag på 18 ° C till möjliggöra äggproduktion kammare av oogenes.
    Obs: Att hålla honan med manliga flugor kan förbättra kammare äggproduktion.
  2. För att inducera ägg chambers att genomgå apoptos av Köldchocken, överföring flyger honan till nya tomma injektionsflaska, vilket sedan placeras vid-7 ° C i 1 h.
    Obs: Köldchocken skadar celler genom att inducera plasmamembranet bristning55,56.
  3. För att inducera ägg chambers att genomgå apoptos av protein svält, överföra kvinnliga flugorna till en ny injektionsflaska med 8% sackaros och 1% agar mat vid 18 ° C i 3 dagar.
    Obs: Protein svält (icke-protein mat) kan utlösa ägg chambers att genomgå apoptos57,58,59 och autofagi60,61. Växla flugor till en ny injektionsflaska med 8% sackaros och 1% agar mat varje dag för att hålla optimal kondition av sackaros flyga mat.
  4. Överföra stressad flugorna tillbaka till en ny injektionsflaska med färska flyga mat och färsk jäst pasta i 3 dagar vid 18 ° C för att kunna återställa. Dissekera de utsvultna och utsvulten-återvunnen flugor få ägg kamrarna på äggstockarna som beskrivs62.
    Obs: För att dissekera Drosophila för att få äggstockarna, söva flugor med CO2, använder 2 par pincett bort flyga huvud, och använder tången för att dra basen av buken att ta bort äggstockarna av flugor.

(3) fixering och färgning av dissekerade ägg Chambers för avbildning

  1. Överföra dissekerade ägg kamrarna tillsammans med runt 0,5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 1 mL centrifugrör. Låt äggen att slå sig ner.
    Obs: Coat de plast pipettspetsarna med 1% bovint serumalbumin (BSA) upplöst i vatten eller PBS att förhindra ägg kamrarna att sticka på plastytan av tips. Utför följande procedurer i mörkret att undvika fotoblekning röd fluorescerande protein (RFP, även känd som DsRed) och grönt fluorescerande protein (GFP) i ägg kamrarna.
  2. Ta bort PBS genom pipettering, och applicera sedan 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS fixar ägg kamrarna vid rumstemperatur i mörkret för 20-30 min.
    Obs: Tillämpa varsam rotering i detta och de följande inkubationsstegen.
  3. Ta bort PARAFORMALDEHYD genom pipettering, och sedan tvättade ägg kammaren med 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton x-100) för 3 gånger.
    Obs: Långvarig fixering kan minska RFP och god Jordbrukarsed signalerna.
  4. Inkubera ägg kamrarna med PBST för 1 till 2 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C med varsam rotering till permeabilize ägg kamrarna.
    Obs: PBST kan också undvika ägg chambers att hålla sig till icke-BSA belagda plastytan.
  5. Ta bort PBST genom pipettering, och sedan gälla ägg kammare för 1 till 2 h i rumstemperatur att färga för nucleus 0,5 mL 10 μg/mL blå nukleära Hoechst färgämne i PBST.
    NOTE1: Undvik långvarig inkubation med nukleära färgämne som detta kommer att öka icke-specifik signal.
    NOTE2: Alternativ metod att färga kärnan utan Hoechst är att lägga till 200 μl anti-blekning montering agent med DAPI (se material) och inkubera över natten63, innan montering vävnader på glas täckglas som beskrivs i protokollet 3,8.
    Anmärkning 3: utför färgningen och följande procedurer i mörkret att undvika fotoblekning.
  6. Ta bort kärn färgämnet genom pipettering, och applicera sedan 0,5 mL PBST att tvätta ägg kamrarna i de 1 mL centrifugrör för 3 gånger, med 10 till 20 minuters inkubation med varsam rotering mellan varje tvätt steg.
  7. Ta bort alla PBST med fina pipett, och applicera sedan 200 μl anti-blekning montering agent (se material) att ruva ägg kamrarna i rumstemperatur i 3 tim eller över natten vid 4 ° C tills ägget kamrarna sjunka till botten av röret.
    Obs: vävnader som har absorberats montering agenten sjunka till botten av röret.
  8. Montera de färgade ägg kamrarna genom att överföra dem med 200 μl anti-blekning montering agent på en pre rengjorda glasskiva för avbildning av pipettering, täcka ägg kamrarna med en 20 x 20 mm före rengjorda glas täckglas och försegla täckglaset på glasskiva genom att sätta nagellack på kanta av täckglaset.
    NOTE1: Pre ren objektglas och täckglas med vatten eller 70% etanol.
    NOTE2: Applicera vaselin mellan objektglas och täckglas att undvika förstöra ägg kamrarna genom overcompressionsystemet.
  9. Bild ägg kamrarna med fluorescens eller confocal Mikroskop, med en 20 x, NA 0,8 Plan-Apochromat mål, med excitation ljus våglängd 405 nm för nukleär färgning (upptäcka utsläpp ~ 461 nm), 561 nm för RFP (pågående eller nyligen kaspas aktivitet) signal ( upptäcka utsläpp ~ 590 nm), och 488 nm för god Jordbrukarsed (tidigare kaspas aktivitet) signal (upptäcka utsläpp ~ 518nm).
    Obs: Se våra publicerade protokoll för mikroskopi20,64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Time-lapse levande cell mikroskopi är en tillförlitlig metod att tarmkanalen anastasis i odlade celler20, är det utmanande att identifiera vilka celler har genomgått anastasis i djur, eftersom de återvunna cellerna visas morfologiskt oskiljbara från normala friska celler som inte har försökt celldöd. Till exempel Visa mänskliga livmoderhalscancer HeLa cells morfologiska kännetecken för apoptos1,2,14, såsom cell krympning, nukleär kondensation och plasmamembranet blebbing svar till celldöd stimulans av 1µM staurosporine17 (figur 1A, figur 1B i-ii). Efter ta bort cell death stimulans och inkubation i färskt medium, omvända döende celler cell dödsprocessen av anastasis17,18, indikerat av morfologiska återhämtning (figur 1B iii-iv), följt av spridning (figur 1B v-vi). Våra tidigare studier har också använt ”realtid” kaspas biosensorer, såsom ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) att Visa återföring av apoptos efter kaspas aktiveringen18,20. Detta biosensor lokaliserar till cytosolen i friska celler (figur 1 c, 1 D jag). Vid kaspas aktivering utlöses av cell death stimulans 3,7% etanol, är denna YFP-baserade biosensor klyvs av kaspaserna och flyttad till kärnan, där det ackumuleras och den resulterande nukleära fluorescensen av dess YFP tag identifierar celler med pågående kaspas aktivitet (figur 1 C, 1 D ii-iii). De döende cellerna också Visa morfologiska kännetecken för apoptos under etanol-induktion1,14,18,20, såsom fragmentering av tubulär mitokondrier, kärnkraft kondens, cell krympning och plasmamembranet blebbing (figur 1 d ii-iii). Intressant, efter avlägsnande av den cell death stimulansen, kan samma celler återhämta sig och återfå normal morfologi (figur 1 d iv-viii). Särskilt den nukleära fluorescensen av ApoAlert (klyvs biosensor) är borta inom 1 timme i återvunna cellerna (figur 1 d iv-viii), möjligen på grund av liknande processer som eliminera skadade komponenter i anastatic celler18 , som klyvs kaspas-3, PARP och ICAD genereras under apoptos. Därför krävs en ny strategi för att spåra anastasis över en längre tidsperiod, särskilt i vivo.

För att spåra anastatic celler öde, utvecklat vi däggdjur CaspaseTracker biosensor systemet, som permanent etiketter cellerna efter att klyvs av bödeln kaspas aktivitet. Detta biosensor består av en kaspas-känsliga rtTA (omvänd tetracyklin-kontrollerade transactivator) och Cre-LoxP-baserade reporter för rtTA aktivitet (figur 2A-B). I friska celler utan kaspas-aktivitet, transactivator rtTA65 är bundna till den plasmamembranet ankare (Lyn11)66,67, nucleus utslagning signal (NES) av karta Kinase Kinase (MAPKK)68, och östrogen receptor variant (ERT2)69 genom kaspas-cleavable (DEVD)70 linkers härrör från PARP (figur 2A, 2B). Som tjudrad rtTA inte kan translocate från cytosolen till kärnan, kan inte det aktivera den rtTA reportern. Dock vid aktivering som svar på en cell death stimulans klyva kaspaserna de DEVD linkers, att befria rtTA till translocate till kärnan (figur 2B). En gång i kärnan, rtTA binder till tet svar element (TRE) och utlösare övergående uttryck för Cre recombinase, vilket leder till en irreversibel rekombination händelse som avlägsnar stop kodon kassetten mellan CAG arrangören och kodande sekvenser för röd fluorescerande protein (DsRed). Detta resulterar i permanent uttryck för DsRed (figur 2B), som fungerar som en permanent fluorescerande markör för de celler som kan förbli vid liv efter att de har upplevt kaspas aktivitet, liksom deras avkomma (figur 2 c).

För att testa de däggdjur CaspaseTracker biosensor, vi förs det in HeLa celler av övergående transfection behandlade cellerna med en cell death stimulans (1µM staurosporine) och övervakas återhämtning av celler av time-lapse levande cell konfokalmikroskopi som vi har beskrivs20. Doxycyklin (slutliga koncentration 1 µg/mL), vilket är nödvändigt att tillåta rtTA aktivitet65,71, lades till i cellodlingsmedium aktivera biosensor hela experimentet. I svar på cell death stimulans visas de behandlade cellerna kännetecken av apoptos, inklusive cell krympning och plasmamembranet blebbing som förväntade (figur 2D i-iii). Efter bort cell death stimulans, kan sköljer det cell lager en gång och lägga färska odlingsmedium, anastasis observeras i de döende cellerna, vilket framgår av deras återgång till en normal morfologi (figur 2D iv-vii). Diagnostiskt, bara återhämtat sig celler express DsRed fluorescerande markör under och efter anastasis (figur 2D iv-vii), skilja dem från både icke-återvunnen (figur 2D iv-vii), och kontroll celler inte utsätts för den cell death stimulansen (figur 2E). Detta visar tillämpningen och nyttan av de däggdjur CaspaseTracker som en roman nya verktyg för att identifiera och permanent märkning anastatic cellerna att återhämta sig från kaspas-aktivering, och ger ett sätt att spåra och studera deras långsiktiga öde.

För att upptäcka och spåra anastasis i levande djur, krävs CaspaseTracker biosensor transgena djur. Därför vi först använda Drosophila melanogaster som en modell system19, eftersom det är en viktigt genetiskt eftertraktansvärda organism för studiet av djurens utveckling och mänskliga sjukdomar72,73,74 ,75. Ändrade från det däggdjur CaspaseTracker biosensor, kan den Drosophila dubbla biosensor identifiera och särskilja ”senaste/pågående” från ”förbi” kaspas aktivitet. Denna dubbla biosensor består av en kaspas-känsliga Gal419och Gal4 reportern G-Trace53 (figur 3A). I celler med ingen kaspas-aktivitet, den jäst Transkriptionfaktorn Gal4 är bundna till en plasmamembranet ankare (mCD8) domän via en kaspas-cleavable länkare (DQVD) härstammar från DIAP1 (figur 3B), att ha en 21NN/GV22 mutation att förhindra nedbrytning av Gal4 av N-end regeln vid kaspas klyvning av den länkare afterAsp2076och en D135R mutation att avskaffa drICE kaspas hämmande funktion i BIR1 domän77. Som tjudrad Gal4 inte kan translocate till kärnan utan klyvning av kaspas att släppa det, förblir Gal4 reportern G-Trace inaktiva i de celler som har ingen kaspas aktivitet19. Vid kaspas aktivering, dock klyva aktiverat kaspaserna DQVD länkare, att frigöra Gal4 till translocate in i cellkärnan att aktivera G-Trace reporter (figur 3A)19. Gal4 binder till specifika uppströms aktivera sekvenser (UAS) för att utlösa övergående transkription och uttryck för RFP, som då fungerar som en fluorescerande reporter på aktuella eller nyligen kaspas aktivitet tills Gal4 (kaspas) aktivitet slutar och sedan RFP protein är försämras. Gal4 utlöser också uttryck för FLP recombinase från transgenens, leder till en rekombination händelse som tar bort stop kodon kassetten mellan en ubiquitin (Ubi) arrangören och en kodande sekvens för nucleus-riktade GFP (nucGFP). Detta resulterar i permanent uttryck för nucGFP, som fungerar som den permanenta märkpenna av de celler som har upplevt kaspas aktivitet och förbli vid liv.

För att testa den Drosophila CaspaseTracker biosensor för att upptäcka apoptos och anastasis utsattes i vivo, CaspaseTracker kvinna flyger för fysiologisk stress (figur 3 c), såsom kall stöt19, som kan effektivt trigger celldöd, inklusive apoptos som indikeras av kaspas aktivering, nukleär kondensation och cell krympning19,78, och också nekros på grund av kylning som orsakar förlust av membran integritet och läckage av cytoplasmisk innehållet55,56. Som förväntat, CaspaseTracker aktiverades inte i ägget kammare av kontroll flugor där stressrelaterade celldöd inte var inducerade (figur 3D). Däremot ägg avdelningar med stressad flugor en dag efter Köldchocken visade inte bara karakteristiska apoptotiska celler krympning och nukleär kondensation, men också RFP och GFP uttryck, vilket indikerar förekomst av senaste eller pågående (RFP +) och tidigare (GFP +) kaspas aktivitet (figur 3E). På 3 dagar efter återkomsten stressad flugorna till icke-betonar normaltillstånd, GFP, men ingen RFP, upptäcktes dock uttryck i återvunna ägg kamrarna (figur 3F). Detta indikerar att ägg chambers som hade uttryckt kaspas aktivitet efter stress kunde övervinna cell dödsprocessen och överleva.

För att ytterligare testa reversibilitet av cell death process i ägg chambers19, var CaspaseTracker kvinnliga flugorna stressad av protein svält efter matas 8% sackaros i 1% agar i 3 dagar. Tidigare studier har visat att protein svält kan utlösa kaspas-medierad apoptos och autofagi i vävnader med somatiska och könsceller, inklusive ägg chambers57,60,61. Som förväntat, aktiverades CaspaseTracker i ägg chambers efter 3 dagar av protein svält (figur 3 g). Döende ägg kamrarna uppvisade både apoptotiska morfologier och uttryck av RFP och god Jordbrukarsed biosensor markörer, som visar pågående eller nyligen (RFP +) och förbi kaspas aktiviteter (GFP +) (figur 3 g). För att visa att CaspaseTracker kan spåra återvunna celler som tidigare upplevt kaspas aktiveringen efter döden stimulans, överfördes utsvultna flugorna sedan till normal proteinhaltiga flyga mat. Som förväntat, saknar de återvunna ägg kamrarna av dessa åter fed flugor RFP övergående kaspas reportern, som visar ingen pågående eller nyligen kaspas-aktivitet (figur 3 H). Dock hade ägg kamrarna i dessa flugor efter lindra stress genom att återsända dem till vanlig mat visas GFP kaspas reportern (figur 3 H), vilket tyder på att cellerna i dessa ägg chambers vänt initierade cellen dödsprocessen vid en punkt efter kaspas aktivering. Kontroll att CaspaseTracker biosensor aktiviteten utlöses av kaspas erhölls genom att ersätta sekvensen klyvning DQVD med sekvens av DQVA, vilka kaspas är oförmögen att klyva och som avskaffa biosensor aktivitet (figur 3B, 3I ).

Efter den CaspaseTracker Drosophila återhämtat sig från protein svält, hittade vi att flera typer av cellen i ägg chambers, såsom somatisk (follikel) celler och könsceller celler (sjuksköterska celler och oocyter), visas endast GFP, men inte RFP (figur 3J )19, som anger att dessa celler kan genomgå anastasis efter kaspas aktivering. Intressant, märkt GFP också celler i germarium (figur 3J)19, som innehåller stamceller, tillsammans med dess associerade ägg avdelningar i samma ovariole kedja. Dessa GFP-positiv ägg kammare kan därför har hämtats från stamceller som har tillfrisknat från cell dödsprocess efter kaspas aktivering. Allt flyger utsvultna och åter fed Honan lägger fertila ägg som kan producera GFP-uttryckande avkomma flugor19, vilket tyder på att cellerna potentiellt omvänd cell dödsprocess efter kaspas aktivering kan återfå tydligen normal funktion. Framtida studier behövs för att avgöra om avkomman flugor som överlever till följd av anastasis uppvisar bestående följdsjukdomar.

Figure 1
Figur 1 . Återställning av HeLa celler efter cell death induktion.
(A) Schematisk bild av metoden att inducera celldöd och därefter låta döende celler att återhämta sig efter borttagning av cell death inducerare.
(B) Time-lapse levande cell DIC mikroskopi av friska HeLa cells (jag), samma grupp av celler efter att behandla med 1µM staurosporine (ii), och sedan tvättas och ytterligare inkuberas med färskt odlingssubstrat att ta bort staurosporine ( III-vi). Vit pil visar en dividera cell.
(C) Schematisk bild av kaspas biosensor fusionsprotein NES-DEVD-YFP-NLS och subcellulär lokalisering av YFP under cell death induktion och efter anastasis.
(D) Time-lapse levande cell konfokalmikroskopi av en HeLa cellen uttrycker kaspas biosensor fusion proteinet NES-DEVD-YFP-NLS innan (jag), under exponering till 3,7% etanol (ii - iii), och efter ta bort etanol från odlingssubstratet (iv - viii). Här visas bilder av kaspas-biosensor endast (grön fluorescens, översta raden); sammanslagna bilder av Hoechst-färgade nucleus (blå fluorescens) och mitokondrier (röd fluorescens) (mellersta raden), och bilder i mittenraden ytterligare samman med DIC bilder (nedersta raden). Vita pilar i översta raden visar nukleära lokaliserade YFP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Däggdjur CaspaseTracker biosensor system.
(A) Schematisk bild av den kaspas-känsliga rtTA.
(B) Schematisk bild av däggdjur CaspaseTracker rtTA biosensor systemet.
(C) flödesschema över med CaspaseTracker rtTA biosensor systemet för att upptäcka anastasis. Röd/gul triangel (gäller cell death inducerare) och grön/blå (tvätta inducerare av) symboler är som i figur 1A.
(D) time-lapse levande cell konfokalmikroskopi av ett kluster av HeLa celler uttrycker det däggdjur CaspaseTracker rtTA biosensor innan (jag), och under exponering till 1µM staurosporine (ii - iii), och efter att ta bort staurosporine från odlingssubstratet (iv - vii). Sammanslagna bilder av DIC och DsRed signaler. Pilarna visar cellen 1 (gul) och cell 2 (grön).
(E) time-lapse levande cell konfokalmikroskopi obehandlad biosensor-uttryckande HeLa celler. Sammanslagna bilder av DIC och DsRed signaler. Vita pilar indikerar delande celler.
Doxycyklin (1ug/mL) var närvarande i mediet i hela experimenten visas i panelerna (D) och (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Drosophila CaspaseTracker dubbla biosensor system. (Antog med tillstånd från Tang et al., vetenskapliga rapporter 2015 9:9015 19 ).
(A) Schematisk bild av Drosophila CaspaseTracker Gal4 biosensor systemet.
(B) Schematisk bild av kaspas-okänsliga kontroll (DQVA) för kaspas-känsliga (DQVD) och Gal4.
(C) Schematisk bild av Drosophila äggstock och flödesschema för cell death-induktion i 1-dag-gammal flugor, följt av 3-dagars återhämtning på normala villkor. Drosophila bild som tillhandahålls av Darren Obbard.
(D) representativ confocal bild av ägg chambers från äggstocken av en kvinnlig biosensor fluga matas med vanlig flyga mat under 6 dagar (obehandlad).
(E) representativa confocal bild av ägg chambers från äggstockarna på en kall chockad kvinnliga biosensor fluga placeras vid-7 ° C i 1 h och sedan bytte till normal kultur villkor för 1 dag (Köldchocken, CS).
(F) som panelen E utom kalla chockad flugorna var bytte till normal kultur villkor för 3 dagar (återställd efter CS).
(G) representativ confocal bild av ägg chambers från äggstockarna på en utsvultna kvinnliga biosensor flyga matas med 8% sackaros i 1% agar utan protein i 3 dagar (utsvulten).
(H) som panelen G utom behandlade flugorna var bytte till vanlig flyga mat i 3 dagar efter protein svält behandling (nytt matas).
(I) som panelen G utom visar svält av kaspas ikänsliga CaspaseTracker (DQVA) kvinnliga biosensor flugor, som tjänade som negativ kontroll.
(J) representativa confocal bild av ägg chambers från en utsvultna och åter fed kvinnliga Drosophila. Pilarna anger nukleära GFP uttrycker i den sjuksköterska (svart), oocyter (vit) och follikeln celler (gul) ägg chambers, och i germarium (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Fysiologiska, patologiska och terapeutiska konsekvenser av anastasis. (Antog med tillstånd från Tang et al., F1000Res 2017, 6:43 21 ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Systemets CaspaseTracker dubbla biosensor är en ny och unikt verktyg som möjliggör detektering av senaste eller pågående kaspas aktivitet, och spårning av celler som har återförts celldöd och överleva efter att ha upplevt kaspas aktivitet i vivo. Medan kaspas verksamhet har traditionellt antagits som ett kännetecken för apoptos, visar växande studier att icke-apoptotiska kaspas aktivitet spelar potentiella roller i olika normala cellfunktioner, såsom reglering av neuronal aktivitet79, 80, inlärning och minne81,82,83,84, dämpning av necroptotic cell död85,86, spermatid individualisering87, 88, mikroRNA bearbetning89, cell spridning90och cell öde mönstring91. Förutom apoptos och anastasis, kan CaspaseTracker biosensor systemet därför upptäcka icke-apoptotiska kaspas aktivitet, som finns i hjärnan och optic lober cardia, gut, Malpighian tubuli, luftstrupen, muskler och andra vävnader i Drosophila19,46,64. Denna biosensor signal kan också representera aktiviteten nuvarande eller tidigare anastatic under embryots utveckling eller normala homeostas i dessa vävnader. För att studera anastasis efter övergående cell death-inducerande miljöbelastning i levande djur, är det viktigt att välja vävnader med celler som uppvisar ingen kaspas biosensor aktivitet under normala fysiologiska förhållanden, men som kan förmås att genomgå kaspas aktivering av övergående cell death induktion. Ägg chambers är idealiska för detta ändamål, eftersom de vanligtvis har ingen kaspas aktivitet från germarium till etapp 10 under oogenes58,59,92.

Utsätta kvinnliga Drosophila till övergående miljöpåfrestningar, triggar såsom protein svält och Köldchocken, effektivt kaspas aktivering och celldöd i ägg chambers19,57,58, 78. Kritiska steg inom protokollet omfatta undvika långvarig cell death induktion till flugor. Optimerad villkoren för protein svält (8% sackaros i 1% agar 3-dagar) och Köldchocken (1 h på-7 oC) till kvinnliga flugor kan utlösa kaspas-aktiverad cell death process i ägg chambers, och tillåta dem att återhämta sig efter stressade flugorna returneras till normalt skick19. Långvarig behandling med en cell death stimulans kan utlösa fler ägg chambers att genomgå cell dödsprocessen, men återvinningsgraden är också minskas, förmodligen eftersom de döende ägg kamrarna upplever enorma skador går att reparera.

Ytterligare ett avgörande steg i detta protokoll är att minska CaspaseTracker bakgrund signal i ägg kamrarna genom korsning, höja och upprätthålla CaspaseTracker flyger på en lägre temperatur, såsom 18 oC. Medan majoriteten av ägg chambers från optimalt uppfödda flugor visas inte kaspas aktivitet i germarium genom etapp 10 under oogenes58, ca 1% av ägg kammare kunde uppvisa kaspas biosensor aktivitet utan cell death induktion19 . Detta kan avspegla den normala förslitningen klassar på grund av medfödda fel eller kan utlösas oavsiktligt under oogenes av standard laboratorieförhållanden. Som Gal4 visar mindre aktivitet i flugor på låg temperatur93, kan höja flugor på 18 oC, snarare än i rumstemperatur, minska den endogena signal som aktiverar CaspaseTracker systemet. Alternativt kan byter flugor till en högre temperatur, såsom 29 oC, öka känsligheten för CaspaseTracker system, på grund av för att ökad Gal4 aktivitet93och eventuellt andra endogena temperatur-anhörigen enzymatisk aktiviteter.

Det är viktigt att skilja de CaspaseTracker-positiva celler som genomgår cellen dödsprocess eller anastasis från celler som uppvisar icke-apoptotiska kaspas aktivitet. Apoptotiska celler uttrycker RFP (övergående markör för pågående eller nyligen kaspas aktivitet) och ofta GFP (permanent maker för tidigare kaspas aktivitet) behandling av apoptos induktion, som dessa döende celler har pågående kaspas verksamhet som klyva-aktiverat Gal4, som sedan aktiverar övergående (Gal4 aktivitet-beroende RFP) och permanent (Gal4 utlöste FLPase-FRT medierad GFP) reportrar av G-Trace systemet. Apoptos av dessa celler kan bekräftas genom morfologiska och biokemiska stämplar sådana amerikanska nukleär kondensation upptäcks genom färgning med nukleära färgämnen14,19,58och kaspas klyvning upptäcks av immunfärgning19,94. Celler som redan genomgått anastasis visar permanenta GFP uttryck på grund av händelsen FLPase-medierad rekombination av G-Trace system. Dessa celler uttrycker ingen RFP eftersom de har ingen pågående kaspas aktivitet, och inte heller andra kännetecken för apoptos19. Dessa celler också Visa normala nukleära morfologi. Celler har pågående icke-apoptotiska kaspas aktivitet visar ofta både RFP och god Jordbrukarsed uttryck, och har även en normal nukleära morfologi19.

Det kan vara svårt att skilja celler som upplevt anastasis från de celler som hade tidigare icke-apoptotiska kaspas aktivitet, eftersom båda visar endast GFP och har inga kännetecken för celldöd. Noggrann kontroll experiment måste därför ingår19. För exempel, för att studera anastasis i ägg chambers, är det viktigt att undersöka GFP uttryck i både betonade-återvunnen flugor och icke-stressade flugor (negativ kontroll). Återvunna flugor bör Visa fler GFP-uttryckande celler än obetonade flugor, om anastasis har inträffat efter kaspas aktivering. Det är också viktigt att skilja CaspaseTracker fluorescerande signaler från ospecifik auto-fluorescens, som observerats i nagelbanden, pigment och fett organ19. Vi genereras negativ kontroll biosensor flugor av muterar kaspas klyvning platsen för biosensor (DQVD) en icke-cleavable sekvens (DQVA) och därmed gör den kontroll biosensor icke-lyhörd för kaspas aktivitet19. Signalen upptäcks i kaspas känsliga (DQVD) men inte i den negativa kontroll (DQVA) biosensor flugor är signalen av intresse, utlöses av kaspas verksamhet, i stället för auto-fluorescens.

Vår nuvarande Drosophila dubbla CaspaseTracker biosensor kan identifiera celler med ”senaste” kaspas aktivitet av uttryck av RFP och celler med ”past” kaspas aktivitet av uttryck av GFP19. Vi noterar att RFP inte är en ”realtid” kaspas aktivitet indikatorn, eftersom det tar ett par timmar av reaktionstid för Gal4 att köra uttrycket av RFP svar till kaspas aktivitet. För att lägga till en ”realtid” funktion, i Drosophila CaspaseTracker biosensor kan kombineras med den nyutvecklade iCasper biosensor52, en ”realtid” och ”mörka till ljusa” i vivo biosensor som bara visar sin mån signal när det är klyvs av kaspaserna.

Bortsett från apoptos, CaspaseTracker möjligen kan också aktiveras under alternativa typer av celldöd som cellerna kan växla cell death vägar under sin kurs som direkt eller indirekt innebär kaspas aktivering, såsom autofagi efter svält95,96, nekros av kall stöt-inducerad plasmamembranet bristning19,55,56,78, och staurosporine-inducerad necroptosis97, 98. Våra nuvarande och tidigare studier har visat att de CaspaseTracker biosensorer kan märka cellerna återhämtat sig från dessa cell death induktioner in vitro- eller in-vivo17,18,19 , 20 , 21. som dessa cell death induktioner ensam kunde samtidigt aktivera flera cell death vägar i samma celler, återvinning av dessa dör celler tyder på att anastasis är ett fenomen av allmänna cell-återhämtning som kan vända olika celldöd processer inklusive apoptos, autofagi, nekros och necroptosis, individuellt eller samtidigt.

Den i vivo CaspaseTracker biosensor kommer att underlätta utövande av ännu okänd funktioner, mekanismer och terapeutiska konsekvenser av anastasis ()figur 4)21. För att avslöja den molekylära signaturen av anastasis, utfört vi tid-rätters helgenom-gen uttryck microarray studier för att analysera mus primära leverceller under återföring av etanol-inducerad apoptos, och intressant nog fann slående förändringar i transkription av gener involverade i flera vägar, inklusive Pro överlevnad, anti-oxidation, DNA skador svar, Histon modifiering, angiogenes, cellmigration och omvandling18,21. Denna slutsats stöds av vår valideringsstudie av återvinning av mänskliga levercancer HepG2 celler från apoptos18,21, och även en studie oberoende RNA-sekvensering av HeLa cells i återvinning av apoptos99. Intressant, Uppregleringen av vissa faktorer som Pro överlevnad i anastatic celler observeras också i hjärtsvikt återföring, tumör progression och cancer recidiv100,101,102, vilket tyder på potentiella deltagande av anastasis. För att studera de fysiologiska, patologiska och terapeutiska potentialerna av anastasis, är det viktigt att identifiera cellerna som anastatic och spåra sitt öde i små djur, eftersom detta mekanistiska och terapeutiska studier. Våra Drosophila och däggdjur CaspaseTracker biosensorer kommer att vara användbara verktyg för att testa potentiella bidrag från anastasis i normala utveckling, homeostas, vävnad återhämtning, tumör evolution, cancer recidiv och metastaser. Slutsatsen från dessa studier kommer att öka vår förståelse av anastasis naturliga roll och erbjuder möjligheter att identifiera revolutionerande nya terapeutiska strategier för svårbehandlade sjukdomar genom att medla celldöd och överlevnad genom kontroll av anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Darren Obbard för Drosophila bilden i figur 3 c och video manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson och Heather M. Lamb för värdefull diskussion av detta manuskript. Detta arbete fick stöd av en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), dr Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright bevilja 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) och NCI K22 bevilja CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang var Märtas och Kay Curci Foundation Fellow för Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

Medicin fråga 132 Anastasis apoptos autofagi biosensor kaspas CaspaseTracker nekros necroptosis programmerad celldöd återföring av apoptos
Att upptäcka Anastasis <em>In Vivo</em> av CaspaseTracker Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter