Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Abstract

Anastasis (griechisch für "Rising zum Leben") ist ein vor kurzem entdeckten Zelle Erholung Phänomen, wobei Zellen sterben Tod Spätstadium Zellprozesse rückgängig machen kann, die in der Regel angenommen werden, per se nicht rückgängig gemacht werden. Förderung der Anastasis Körperverletzungen im Prinzip Rettungs- oder Konserve Zellen, die schwer zu ersetzen, wie Kardiomyozyten oder Nervenzellen, wodurch Gewebe Erholung sind. Umgekehrt kann unterdrücken Anastasis in Krebszellen die Apoptose nach Anti-Krebs-Therapien unterziehen Krebs Zelltod zu gewährleisten und reduzieren die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens. Allerdings haben diese Studien behindert wurde, durch den Mangel an Tools für die Verfolgung des Schicksals der Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen. Die Herausforderung ist es, die Zellen zu identifizieren, die die Zelle Tod trotz ihrer morphologisch normale Erscheinung nach der Wiederherstellung rückgängig gemacht haben. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, haben wir entwickelt, Drosophila und Säugetieren CaspaseTracker-Biosensor-Systeme, die erkennen und dauerhaft zu verfolgen, die Anastatic Zellen in Vitro oder in Vivo. Hier präsentieren wir Ihnen in-Vivo -Protokolle für die Erzeugung und Nutzung von das CaspaseTracker dual Biosensor-System zu erkennen und verfolgen Anastasis in Drosophila Melanogaster nach vorübergehenden Aussetzung zu Zelle Tod Reize. Während konventionelle Biosensoren und Protokolle Zellen aktiv durchmachenden apoptotischen Zelltod beschriften können, der CaspaseTracker-Biosensor kann dauerhaft beschriften, Zellen, die nach der Aktivierung der Caspase - ein Markenzeichen der Spätphase Apoptose, erholt haben und gleichzeitig aktive apoptotische Prozesse zu identifizieren. Dieser Biosensor kann auch die Erholung der Zellen aufspüren, die andere Formen des Zelltods versucht, die direkt oder indirekt Caspase-Aktivität beteiligt. Daher ist dieses Protokoll ermöglicht es uns, kontinuierlich verfolgen das Schicksal dieser Zellen und deren Nachkommen, die Erleichterung der Zukunftsforschung der biologischen Funktionen, molekulare Mechanismen, physiologischen und pathologischen folgen und therapeutische Implikationen der Anastasis. Wir diskutieren auch die entsprechenden Steuerelemente, um Zellen zu unterscheiden, die Anastasis von denen zu unterziehen, die nicht-apoptotische Caspase-Aktivität in Vivoanzeigen.

Introduction

Programmierten Zelltod, z. B. Apoptose, spielt eine wesentliche Rolle in der embryonalen Entwicklung und normale Homöostase durch den Wegfall von unerwünschter, verletzter oder gefährliche Zellen in mehrzelligen Organismen1,2,3. Der Verlust des Gleichgewichts zwischen Zelle Tod und überleben kann zu fatalen Folgen wie Krebs, Herzversagen, Autoimmunität und Degeneration4,5,6,7,8führen. Aktivierung des Henkers, die Caspasen traditionell als der "Point Of No Return" Apoptose9,10,11, als es betrachtet löst schnelle und massive zellulären Abriss12, 13,14,15,16. Anspruchsvolle dieses allgemeinen Dogma, haben wir bewiesen, kultivierten sterbenden primäre Zellen und Krebszellen nicht nur nach Aktivierung der Caspase, sondern auch folgende wichtige Zelle Tod Kennzeichen einschließlich der Plasmamembran Blebbing, Schrumpfung der Zelle wiederherstellen zu können, mitochondriale Fragmentierung, Freisetzung von mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, nukleare und Chromatin Kondensation, DNA-Schäden, nukleare Fragmentierung, Zelle Oberfläche Exposition von Phosphatidylserin (PS) und Bildung von apoptotischen Körper 17 , 18 , 19 , 20 , 21. schlagen wir die Anastasis ist eine innere Zelle Erholung Phänomen, wie sterbende Zellen nach Entfernung der Zelle Tod Reize17,18,19,20, erholen können 21. wir prägte den Begriff "Anastasis" (Αναστάσης)18, was bedeutet "steigt zum Leben" in griechischer Sprache, zu dieser unerwarteten Zelle Erholung Phänomen zu beschreiben. Unsere Beobachtung der Anastasis wird weiter unterstützt durch unabhängige Studien, die zeigen auch Erholung der Zellen nach Phosphatidylserin Externalisierung22,23,24, mitochondriale begrenzte äußeren Membran Permeabilisierung25, Aktivierung der gemischte Abstammung Kinase-wie (MLKL) und Zelle Schrumpfung26.

Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Anastasis wird Paradigma-Verschiebung physiologische, pathologische und therapeutische Konsequenzen haben. Anastasis könnte einen bisher unbekannten zellschützenden Mechanismus zu retten oder bewahren wichtige postmitotischen Zellen und Gewebe, die schwer zu ersetzen sind, und möglicherweise Konto für Herzinsuffizienz Umkehrung von ventrikulären entladen mit Links ventrikulären darstellen unterstützen Sie Geräte (LVAD)27,28, Wiederherstellung der Sehzellen nach vorübergehender Exposition von übermäßigen hellen29,30,31, oder Reparatur von Neuronen nach Gehirn Verletzungen32. Wenn ja, Förderung der Anastasis Zell- und Erholung verbessern könnte. Umgekehrt könnte Anastasis eine unerwartete Flucht Taktik zu Zelle Tod-induzierenden Therapie verursacht Krebs Wiederauftreten17,18Überleben von Krebszellen verwendet werden. Deshalb unterdrücken Anastasis im sterben Krebszellen während und nach Behandlung von Krebs könnte eine neuartige therapeutische Strategie, Krebs zu heilen, durch ihren Rückfall zu verhindern.

Während des Prozesses der Anastasis haben wir festgestellt, dass einige wiederhergestellten Zellen erworben dauerhafte genetische Veränderungen und unterzog sich onkogenen Transformation, wahrscheinlich aufgrund von DNA-Schäden entstehen während der Apoptose18,20,21 . Umkehrung des Prozesses der Tod von DNA-beschädigte Zellen könnte ein Mechanismus der Tumorgenese, potenziell zugrunde liegt die Beobachtung, die Gewebeverletzung wiederholt erhöht das Risiko von Krebs in einer Vielzahl von Geweben, wie z. B. chronische thermische Schädigung in der Speiseröhre induziert durch den Verzehr von sehr heißen Getränken33,34,35, Leberschäden durch Alkoholismus36,37, Tumor-Evolution nach genotoxische Krebs Therapie38, 39,40und die Entwicklung von Neuerkrankungen von normalen Zellen, die in den Pausen zwischen den Zyklen der Anti-Krebs-Therapie41,42,43,44 entstehen . Wenn "true", könnte targeting Anastasis verhaften Krebsentstehung und Progression oder verhindern. Wir haben festgestellt, dass Hunger-induzierte sterbenden Keimzellen Anastasis erneut zugeführt werden, Drosophila19unterziehen.  Wenn Anastasis in Keimzellen mit DNA-Schädigung auftritt, könnte es sein, entfallen die Beobachtung, die Umweltbelastungen verlängert Entwicklung genetischer Erkrankungen fördert. Z. B. zur Hungersnöte Entwicklung der transgenerationalen vererbbare Krankheiten wie Diabetes und koronare Herzkrankheiten45. Daher könnten Verständnis Anastasis Strategien zur Prävention von vererbbaren Krankheiten, die durch diesen möglichen Mechanismus zu entwickeln.

Um die Entdeckung der Anastasis zu nutzen und zu lenken, innovative Therapien zu entwickeln, ist es wichtig, die Ursache und Folge der Anastasis mit lebenden Tieren zu studieren. Jedoch ist es technisch schwierig zu identifizieren und verfolgen Anastatic Zellen in Vivo, da die Zellen, die Zelle Todesprozess erholt morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen erscheinen, und es keine Biomarker der Anastasis gibt identifiziert noch17,18,21. Um diese Probleme anzugehen, haben wir vor kurzem entwickelt eine neue in-Vivo Caspase Biosensor bezeichnet "CaspaseTracker"19, zu identifizieren und verfolgen von Zellen, die Apoptose nach Caspase Aktivierung19,46, überleben die Markenzeichen der Apoptose10,14. Unterscheidet sie von der "Echtzeit" Caspase-Biosensoren wie SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 und iCasper52 erkennen, dass andauernde Caspase-Aktivität, der CaspaseTracker-Biosensor zusätzlich bietet die Möglichkeit, dauerhaft Zellen diese ausdrückliche Caspase-Aktivität sogar vorübergehend beschriften. Der CaspaseTracker-Biosensor ermöglicht somit, langfristige Verfolgung von Anastasis nach Umkehr der Caspase-vermittelte Zelle Tod Prozess in Vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

(1) Vorbereitung der CaspaseTracker Biosensor fliegen

  1. Betäuben Sie fliegen mit CO2zu, und verwenden Sie einen Pinsel, 7-10 Caspase-Sensitive Gal4 (DQVD)19 jungfräulichen Weibchen und 7 bis 10 G-Spur53 Gal4 Reporter junge männliche fliegen (oder umgekehrt) in der gleichen Flasche mit fliegen Essen und frische Hefe Paste übertragen.
    Hinweis: Kreuz von Caspase-Sensitive (DQVD) Gal4 und G-Spur fliegen erzeugt CaspaseTracker Nachkommen fliegen. Kreuz des Caspase -insensiblen (DQVA)19 Gal4 und G-Spur fliegen, erhalten Negativkontrolle fliegt (siehe Diskussion). Frische Hefe Paste dient als Proteinquelle, Ei-Produktion, zu verbessern, so dass die Anzahl der Nachkommen erhöht. Wählen Sie jungfräuliche Weibchen und junge Männchen fliegt nach ihren Phänotypen54.
  2. 3 bis 7 Tagen inkubieren Sie fliegen bei 18 Grad Celsius (oC) während des Kreuzes und übertragen Sie dann die fliegen zu einem neuen Fläschchen zum Einrichten eines neuen Kreuzes bei 18 ° C. Weiterhin der Originalflasche bei 18 ° C inkubieren, bis Nachkommen Eclose fliegt.
    Hinweis: Übertragen Sie die Eltern fliegen auf neue Fläschchen zu vermeiden Überbelegung der Nachkommen in der Originalflasche. Elternteil fliegen Nachkommen mit frischen Lebensmitteln und Hefe Paste in den ersten 2 bis 3 Schaltern erzeugen können, und dann verringern die Produktivität deutlich mit der Zeit. Erhöhung der fliegen 18 ° C können unspezifische Signal des CaspaseTracker Biosensor reduzieren (siehe Diskussion).
  3. Wählen Sie Nachkommen fliegt mit richtigen Phänotypen54 für folgende Experimente.
    Hinweis: Transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hier befinden sich auf dem zweiten Chromosom mit CyO Balancer ausgeglichen. Wählen Sie die nicht lockig Flügel Nachkommen (ohne CyO), die beide transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hat.

(2) die Anwendung der Transienten Zelle Tod Induktion, CaspaseTracker-Biosensor fliegen

  1. Übertragen Sie 10 bis 20 neu geschlüpften Weibchen ein neues Fläschchen mit Fliege Frischwaren und frische Hefe Paste für 1 Tag auf 18 ° C fliegt um Ei-Kammer-Produktion durch Oogenese zu ermöglichen.
    Hinweis: Halten das Weibchen mit männlichen fliegen könnte Ei Kammer-Produktion erhöhen.
  2. Das Weibchen fliegt um Ei Kammern durch Kälteschock, Transfer Apoptose induzieren neue leere Fläschchen, die dann bei-7 ° C für 1 h platziert wird.
    Hinweis: Kälteschock verletzt Zellen durch Induktion Plasmamembran Bruch55,56.
  3. Um Ei Kammern durch Protein verhungern Apoptose induzieren, übertragen Sie die weiblichen fliegen zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen bei 18 ° C für 3 Tage.
    Hinweis: Protein-Hunger (nicht-Protein Lebensmittel) auslösen kann Ei Kammern um Apoptose57,58,59 und Autophagie60,61unterziehen. Schalter fliegt zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen jeden Tag um zu optimalen Zustand Saccharose fliegen Essen zu halten.
  4. Übertragen Sie die gestressten fliegen zurück zu einem neuen Fläschchen mit frischen fliegen Essen und frische Hefe Paste für 3 Tage bei 18 ° C, damit sie sich erholen. Sezieren Sie die hungrigen und die verhungert erholt fliegen Ei Kammern an Eierstöcken beschrieben62zu erhalten.
    Hinweis: Um Drosophila Eierstöcke zu sezieren, verwenden Sie 2 Paar Pinzette, um fliegen Kopf entfernen betäuben Sie fliegen mit CO2, zu und verwenden Sie die Zange, um die Basis des Bauches zu entfernen die Eierstöcke der fliegen zu ziehen.

(3) Fixierung und Färbung der seziert Ei Kammern für die Bildgebung

  1. Übertragen Sie die seziert Ei Kammern zusammen mit rund 0,5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 1 mL Zentrifuge Röhren. Lassen Sie die Eiern zu beruhigen.
    Hinweis: Beschichten von Kunststoff Pipettenspitzen mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) aufgelöst in Wasser oder PBS Ei Kammern zum Aufkleben auf die Kunststoffoberfläche der Tipps zu verhindern. Führen Sie die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz rot fluoreszierenden Proteins (RFP, auch bekannt als DsRed) zu vermeiden und grün fluoreszierendes Protein (GFP) in die Ei-Kammern.
  2. Entfernen Sie die PBS durch pipettieren, und wenden Sie dann 0,5 mL 4 % Paraformaldehyd in PBS, Ei Kammern bei Raumtemperatur in Dunkelheit für 20 bis 30 min. zu beheben.
    Hinweis: Sanfte Drehung in dieser und die folgenden Inkubationsschritte anwenden.
  3. Entfernen Sie die Paraformaldehyd durch pipettieren und dann gewaschen, die Ei-Kammer mit 0,5 mL PBST (PBS + 0,1 % Triton x-100) für 3 Mal.
    Hinweis: Verlängerte Fixierung könnte die RFP und GFP-Signale reduzieren.
  4. Die Ei-Kammern mit PBST für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C mit sanften Drehung um das Ei Kammern permeabilize.
    Hinweis: PBST kann vermeiden, Ei Kammern, an die nicht-BSA beschichteten Kunststoff-Oberfläche.
  5. Entfernen Sie der PBST durch pipettieren und Ei Kammern für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur für Kern Fleck dann zuweisen Sie 0,5 mL 10 μg/ml blauer nuklearen Hoechst Farbstoff in PBST.
    Hinweis1: Vermeiden Sie längeren Inkubation mit nuklearen Farbstoff, wie das unspezifische Signal zu erhöhen.
    Hinweis 2: Alternativer Ansatz zum Kern ohne Hoechst Fleck ist das Hinzufügen von 200 μl Anti-bleichen Montage Agent mit DAPI (siehe Material) und inkubieren Sie über Nacht63, vor der Montage das Gewebe auf Glas Deckglas, wie im Protokoll 3.8 beschrieben.
    NOTE3: führen Sie die Färbung und die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz zu vermeiden.
  6. Entfernen des nuklearen Farbstoffs durch pipettieren und dann gelten 0,5 mL PBST die Ei Kammern in die Zentrifuge Röhren 1 mL für 3 Mal mit 10 bis 20 min Inkubation mit sanften Drehung zwischen jedem Waschschritt zu waschen.
  7. Entfernen Sie alle PBST mit feinen Pipette, und wenden Sie dann 200 μL Anti-bleichen Montage Agent (siehe Material) Ei Kammern bei Raumtemperatur 3 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren, bis Ei Kammern auf der Unterseite des Rohres sinken.
    Hinweis: auf den Boden des Rohres sinken Gewebe, die vollständig den Montage-Agent aufgenommen haben.
  8. Montieren Sie die gefärbten Ei Kammern durch Übertragung mit 200 μl Anti-bleaching Montage-Agent auf einem vorgereinigten Objektträger für die Bildgebung durch pipettieren, Ei Kammern mit einem 20 x 20 mm vorgereinigten Glas Deckglas abdecken und verschließen das Deckglas auf Glasobjektträger indem man Nagellack am Rand des Deckglases.
    Hinweis1: Pre-reinigen Sie den Objektträger und Deckglas mit Wasser oder 70 % Ethanol.
    Hinweis 2: Gelten Sie Vaseline zwischen den Objektträger und Deckglas zu zerstören die Ei-Kammern durch Unterverdichtungen.
  9. Bild der Ei-Kammern mit Fluoreszenz oder confocal Mikroskop, mit einem 20 X, NA 0,8 Plan-Apochromat Objektive, mit Anregung Licht-Wellenlänge 405 nm für nukleare Färbung (Erkennung Emission ~ 461 nm), 561 nm für RFP (laufende oder kürzlich Caspase-Aktivität) Signal ( erkennen Emission ~ 590 nm), und 488 nm für GFP (vorbei an Caspase-Aktivität) Signal (Emission erkennen ~ 518nm).
    Hinweis: Sehen Sie unsere veröffentlichten Protokolle für Mikroskopie-20,-64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Time-Lapse live Zelle Mikroskopie eine zuverlässige Methode, um Trakt Anastasis in kultivierten Zellen20ist, ist es schwierig zu identifizieren welche Zellen Anastasis bei Tieren, unterzogen wurden, da die wiederhergestellten Zellen morphologisch nicht zu unterscheiden scheinen aus normalen gesunden Zellen, die nicht Zelltod versucht haben. Z. B. anzeigen menschliche Gebärmutterhalskrebs HeLa-Zellen morphologische Kennzeichen der Apoptose1,2,14, wie Zelle Schrumpfung, nukleare Kondensation und Plasmamembran Blebbing als Reaktion auf den Zelltod Impulse von 1µM Staurosporine17 (Abbildung 1A, 1 b Abbildung i-Ii). Nach dem Entfernen der Zelle Tod Reiz und Inkubation in frisches Medium, gehen Sie umgekehrt die sterbenden Zellen Zelle Tod von Anastasis17,18, wie durch morphologische Erholung (Abbildung 1 b Iii-iv), gefolgt von Proliferation (Abbildung 1 b V-vi). Unsere früheren Studien haben auch "in Echtzeit" Caspase Biosensoren, z. B. ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) Umkehrung der Apoptose demonstrieren nach Caspase Aktivierung18,20verwendet. Diese Biosensor lokalisiert, die Zellflüssigkeit in gesunden Zellen (Abbildung 1, 1D ich). Bei Caspase-Aktivierung durch die Zelle Tod Reiz 3,7 % Ethanol ausgelöst diese YFP-basierten Biosensor von Caspasen gespalten und umgesiedelt in Zellkern, wo es sammelt sich und die daraus resultierende nukleare Fluoreszenz des YFP Tag identifiziert sich Zellen mit laufender Caspase-Aktivität (Abbildung 1 C, 1D Ii-Iii). Der sterbenden Zellen zeigen auch morphologische Merkmale der Apoptose bei Ethanol-Induktion1,14,18,20, wie Fragmentierung des röhrenförmigen Mitochondrien, nukleare Kondensation, Zelle Schrumpfung und Plasmamembran Blebbing (Abbildung 1 Ii-Iii). Interessant ist, nach der Entfernung des Zelle Todes Stimulus, können die gleichen Zellen wiederherstellen und wiedererlangen normaler Morphologie (Abbildung 1 iv-Viii). Bemerkenswert ist die nukleare Fluoreszenz des ApoAlert (gespalten Biosensor) Weg innerhalb von 1 Stunde in den wiederhergestellten Zellen (Abbildung 1 iv-Viii), möglicherweise aufgrund von ähnlichen Prozessen, die beschädigte Bauteile in Anastatic beseitigen Zellen18 , z. B. gespalten Caspase-3 und PARP ICAD erzeugt während der Apoptose. Daher ist eine neue Strategie für die Verfolgung von Anastasis über einen längeren Zeitraum, insbesondere in Vivoerforderlich.

Um das Schicksal der Anastatic Zellen zu verfolgen, haben wir das Säugetier-CaspaseTracker Biosensor-System, das dauerhaft die Zellen Etiketten nach gespalten wird vom Henker Caspase-Aktivität entwickelt. Diese Biosensor besteht aus einem Caspase-Sensitive RtTA (reverse Tetracyclin-gesteuerte Transaktivator) und Cre-LoxP-basierte Reporter für RtTA Aktivität (Abbildung 2A-B). In gesunden Zellen ohne Caspase-Aktivität, die Transaktivator RtTA65 ist angebunden an die Plasmamembran Anker (Lyn11)66,67, Kern Ausgrenzung Signal (NES) von Map-Kinase-Kinase (MAPKK)68, und Östrogen-Rezeptor-Variante (ERT2)69 durch Caspase-spaltbaren (DEVD)70 linker abgeleitet von PARP (Abb. 2A, 2 b). Als gefesselte RtTA aus dem Zytosol in den Zellkern translozieren kann nicht, kann es die RtTA Reporter nicht aktivieren. Jedoch nach der Aktivierung in Reaktion auf einen Reiz Zelle Tod cleave Caspasen DEVD-linker, RtTA, translozieren in den Zellkern (Abb. 2 b) zu befreien. Einmal im Zellkern, die RtTA bindet an die Tet-Response-Element (TRE) und Trigger transiente Expression der Cre-Rekombinase, führt zu einer irreversiblen Rekombination Veranstaltung, die die Stopp-Codon Kassette zwischen dem CAG Projektträger und die kodierenden Sequenzen für entfernt rot fluoreszierenden Proteins (DsRed). Dies führt zu ständigen Ausdruck der DsRed (Abb. 2 b), dient als fluoreszierende Permanentmarker jener Zellen, die am Leben bleiben können, nachdem sie, Caspase-Aktivität sowie deren Nachkommen (Abbildung 2 erfahren haben).

Um den Säugetieren CaspaseTracker Biosensor zu testen, wir durch transiente Transfektion in HeLa-Zellen eingeführt, behandelt die Zellen mit einem Zelle Tod Stimulus (1µM Staurosporine) und Wiederherstellung der Zellen von Time-Lapse live Zelle konfokalen Mikroskopie überwacht, wie wir 20beschrieben. Doxycyclin (Endkonzentration 1µg/mL), die für RtTA Aktivität65,71erlauben unerlässlich ist, wurde das Zellkulturmedium zum Einschalten der Biosensor während des Experiments hinzugefügt. In Reaktion auf die Zelle Tod Reiz zeigen die behandelten Zellen Markenzeichen der Apoptose, einschließlich der Zelle Schrumpfung und Plasmamembran Blebbing als erwartet (Abb. 2D i-Iii). Nach dem Entfernen des Zelle Tod Reizes, kann die Spülung der Zelle Schicht einmal und Hinzufügen von frischem Nährmedium, Anastasis in den sterbenden Zellen, angedeutet durch die Rückkehr in eine normale Morphologie (Abb. 2D iv-Vii) beobachtet werden. Diagnostisch, erholte sich nur Zellen Express die DsRed fluoreszierenden Marker während und nach der Anastasis (Abb. 2D iv-Vii), individualisieren noch nicht erholt Zellen (Abb. 2D iv-Vii) sowohl Kontrollzellen nicht auf die Zelle Tod Reiz (Abb. 2E) ausgesetzt. Das zeigt die Anwendung und den Nutzen von Säugetieren CaspaseTracker als neuartige neues Werkzeug für die Identifizierung und Kennzeichnung dauerhaft Anastatic Zellen erholt sich von Caspase-Aktivierung und bietet eine Möglichkeit zu verfolgen und ihre längerfristige Schicksal zu studieren.

Um zu erkennen und verfolgen Anastasis mit lebenden Tieren, sind CaspaseTracker Biosensor transgene Tiere erforderlich. Daher wir zuerst verwendet Drosophila Melanogaster als ein Modell System19, weil wie es genetisch gefügig Organismus wichtig für das Studium der tierischen Entwicklung und menschlicher Erkrankungen72,73,74 ,75. Von den Säugetieren CaspaseTracker Biosensor geändert, kann der Drosophila -dual-Biosensor identifizieren und unterscheiden "aktuelle/laufende" aus "Vergangenheit" Caspase-Aktivität. Dieser dual Biosensor besteht aus einem Caspase-Sensitive Gal419und Gal4-Reporter G-Spur53 (Abb. 3A). In Zellen ohne Caspase-Aktivität, Hefe Transkriptionsfaktors Gal4 ist angebunden an einer Plasmamembran Anker (mCD8) Domäne durch einen Caspase-spaltbaren Linker (DQVD) abgeleitet von DIAP1 (Abb. 3 b), mit einer 21NN/GV22-Mutation, Abbau zu verhindern der Gal4 durch die N-Ende-Regel auf Caspase Spaltung der Linker afterAsp2076, und eine D135R-Mutation, die DrICE Caspase hemmenden Funktion in die BIR1 Domäne77abzuschaffen. Als gefesselte Gal4 Kern ohne Spaltung durch Caspase freizugeben translozieren kann nicht, bleibt die Gal4-Reporter G-Spur in den Zellen haben keine Caspase-Aktivität-19inaktiv. Nach der Aktivierung der Caspase cleave jedoch aktivierte Caspasen DQVD Linker, Befreiung Gal4, translozieren in den Zellkern, die G-Spur Reporter (Abbildung 3A)19zu aktivieren. Gal4 bindet an spezifische stromaufwärts aktivieren Sequenzen (UAS) auslösen transiente Transkription und Ausdruck des RFP, dient dann als fluoreszierende Reporter von den vergangenen oder aktuellen Caspase-Aktivität bis die Gal4 (Caspase) beendet und dann RFP Protein ist degradiert. Gal4 löst auch Ausdruck der FLP-Rekombinase von Transgen, führt zu einer Rekombination-Ereignis, das Stopp-Codon Kassette zwischen Ubiquitin (Ubi) Förderer und eine kodierende Sequenz für Kern-gezielte GFP (NucGFP) entfernt. Dies führt zu ständigen Ausdruck des NucGFP, dient als permanent-Marker dieser Zellen, die Caspase-Aktivität erlebt haben und am Leben bleiben.

Testen der Drosophila CaspaseTracker Biosensor zur Detektion von Apoptose und Anastasis in Vivo, CaspaseTracker Weibchen fliegt wurden physiologische Belastungen ausgesetzt (Abbildung 3), wie Kälte Schock19, die effizient können Trigger Zelltod, auch Apoptose durch Caspase-Aktivierung, nukleare Kondensation und Zelle Schrumpfung19,78, und auch Nekrose durch Kühlung, der Verlust der Integrität der Membran und Austreten von zytoplasmatischen verursacht Inhalt55,56. Wie erwartet, CaspaseTracker konnte nicht aktiviert werden im Ei Kammern der Steuerung fliegen wo stressbedingte Zelltod nicht war induziert (Abbildung 3D). Im Gegensatz dazu zeigte Ei Kammern der gestresste fliegen einen Tag nach der Kälteschock nicht nur charakteristische apoptotische Zelle Schrumpfung und nuklearen Kondensation, aber auch RFP und GFP Ausdruck, auf das Vorhandensein der letzten oder laufende (RFP +) und letzten (GLP +) caspase Aktivität (Abbildung 3E). Jedoch wurde bei 3 Tage nach der Rückkehr der gestressten Flies in Normalzustand nicht betonend, GLP, aber keine RFP, Ausdruck in den wiederhergestellten Ei Kammern (Abbildung 3F) erkannt. Dies zeigt, dass Ei Kammern, die Caspase-Aktivität nach Stress geäußert hatte überwinden Tod Zellprozess und überleben können.

Um weitere Reversibilität der Zelle Todesprozess im Ei Kammern19testen, waren CaspaseTracker weiblichen fliegen durch Protein-Hunger nach gefüttert 8 % Saccharose in 1 % Agar für 3 Tage beansprucht. Frühere Studien gezeigt, dass Protein Hunger Caspase-vermittelten Apoptose und Autophagie in Geweben mit somatischen auslösen kann und Keimzellen, einschließlich ei Kammern57,60,61. Wie erwartet, wurde CaspaseTracker in Ei Kammern nach 3 Tagen an Protein Hunger (Abbildung 3) aktiviert. Die sterbenden Ei Kammern ausgestellt Apoptotic Morphologien und Ausdruck der RFP und GFP Biosensor Marker, angibt, den letzten oder andauernde (RFP +) und Vergangenheit (GLP +) Caspase-Aktivität (Abbildung 3). Um zu demonstrieren, dass CaspaseTracker wiederhergestellten Zellen verfolgen kann, die zuvor Caspase-Aktivierung nach Tod Anregung erfahren, wurden die ausgehungerten fliegen dann auf normale Protein-haltigen fliegen Nahrung übertragen. Wie erwartet, fehlt die wiederhergestellten Ei Kammern dieser erneut zugeführt werden, fliegen den RFP transiente Caspase-Reporter, zeigt keine neuen oder laufenden Caspase-Aktivität (Abbildung 3 H). Jedoch hatte die Ei Kammern in diese fliegen nach Entlastung von Stress durch Rückgabe an normale Nahrung der GFP Caspase-Reporter (Abbildung 3 H), darauf hinweist, dass die Zellen in dieser Ei Kammern angezeigt die initiierten Zellprozess der Tod zu einem Zeitpunkt nach rückgängig gemacht Caspase-Aktivierung. Geprüft werden, ob die CaspaseTracker-Biosensor-Aktivität wird durch Caspase ausgelöst wurde durch den Austausch der Spaltung Sequenz DQVD mit der Sequenz des DQVA, welches Caspase ist nicht in der Lage, zu Spalten und die Abschaffung der Biosensor-Aktivität (Abb. 3 b, 3I erhalten ).

Nachdem die CaspaseTracker Drosophila von Protein Hunger erholt, fanden wir, dass mehrere Arten der Zelle in die Ei-Kammern, wie somatische () Follikelzellen und Keimbahnzellen (Krankenschwester Zellen und Eizellen), angezeigt nur GFP, aber nicht RFP (Abbildung 3J )19, darauf hinweist, dass diese Zellen nach Aktivierung der Caspase Anastasis durchlaufen können. Interessanterweise, beschriftet die GFP auch Zellen in der Germarium (Abbildung 3J)19, die Stammzellen, zusammen mit seinen zugehörigen Ei Kammern in der gleichen Ovariole Kette enthält. Daher können diese GFP-positiven Ei Kammern aus Stammzellen gewonnen wurden, die nach der Aktivierung der Caspase Zellprozess Tod erholt haben. Wichtig ist, fliegt die ausgehungerte und erneut zugeführte werden, weibliche Laie fruchtbaren Eizellen, die GFP exprimierenden Nachkommen fliegen19, produzieren können darauf hindeutet, dass möglicherweise die Zellen Zelle Todesprozess umgekehrt, nach Aktivierung der Caspase scheinbar normalen Funktion wiedererlangen kann. Zukünftige Studien werden benötigt, um festzustellen, ob Nachkommen fliegen, die als Folge der Anastasis überleben dauerhaftere Folgeerscheinungen aufweisen.

Figure 1
Abbildung 1 . Wiederherstellung von HeLa-Zellen nach Zelle Tod Induktion.
(A) schematische Darstellung des Ansatzes zu Zelltod zu induzieren und anschließend sterben Zellen nach Entfernung der Zelle Tod Induktor erholen.
(B) Zeitraffer live Zelle DIC Mikroskopie von gesunden HeLa-Zellen (ich), die gleiche Gruppe von Zellen nach der Behandlung mit 1µM Staurosporine (Ii), und dann gewaschen und weiter mit frischem Nährmedium zu entfernen, die Staurosporine ( inkubiert III-vi). Weißen Pfeil zeigt eine teilende Zelle.
(C) schematische Darstellung der Caspase Fusionsproteins Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS und die subzelluläre Lokalisation der YFP während Zelle Tod Induktion und nach Anastasis.
(D) Zeitraffer live Zelle konfokalen Mikroskopie eine HeLa-Zelle mit dem Ausdruck Caspase Biosensor Fusionsproteins NES-DEVD-YFP-NLS vor (ich), während der Belichtung zu 3,7 % Ethanol (Ii - Iii) und nach Entfernen von Ethanol aus dem Kulturmedium (iv - Viii). Hier sind Bilder von der Caspase-Biosensor nur (grüne Fluoreszenz, oberste Zeile); Bilder von der Hoechst-gefärbten Kern (blaue Fluoreszenz) und Mitochondrien (rote Fluoreszenz) zusammengeführt (mittlere Reihe), und Bilder in der mittleren Reihe weiter mit DIC-Bilder (untere Zeile) zusammengeführt. Weiße Pfeile in Kopfzeile zeigen nuklearen lokalisierte YFP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Säugetier-CaspaseTracker Biosensor-System.
(A) schematische Darstellung der Caspase-Sensitive RtTA.
(B) schematische Darstellung der Säugetier-CaspaseTracker RtTA Biosensor-System.
(C) Flussdiagramm des mit dem CaspaseTracker RtTA Biosensor-System um Anastasis zu erkennen. Rot/gelb Dreieck (Zelle Tod Induktor gelten) und grün/blau (Waschen-Induktor aus) Symbole sind wie in Figur 1A.
(D) Zeitraffer live Zelle konfokalen Mikroskopie aus einem Cluster von HeLa-Zellen mit dem Ausdruck der Säugetier-CaspaseTracker RtTA Biosensor vor (ich), und während der Belichtung zu 1µM Staurosporine (Ii - Iii) und nach dem Entfernen Staurosporine aus dem Kulturmedium (iv - Vii). Zusammengeführte Bilder der DIC und DsRed Signale. Pfeile zeigen die Zelle 1 (gelb) und Zelle 2 (grün).
(E) Zeitraffer live Zelle konfokalen Mikroskopie von den unbehandelten Biosensor exprimierenden HeLa-Zellen. Zusammengeführte Bilder der DIC und DsRed Signale. Weiße Pfeile zeigen teilende Zellen.
Doxycyclin (1ug/mL) wurde in das Medium während der Experimente in Platten (D) und (E)gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Drosophila CaspaseTracker dual Biosensor-System. (Mit freundlicher Genehmigung von Tang Et Al., wissenschaftliche Berichte 2015 9:9015 verabschiedet 19 ).
(A) schematische Darstellung der Drosophila CaspaseTracker Gal4-Biosensor-System.
(B) schematische Darstellung der Caspase-Sensitive (DQVD) und Caspase-unempfindliche Kontrolle (DQVA) Gal4.
(C) schematische Darstellung der Drosophila Eierstock und Flussdiagramm für die Zelle Tod-Induktion bei 1-Tag-alte fliegen, gefolgt von 3 Tage Erholung im normalen Zustand. Drosophila -Bild von Darren Obbard zur Verfügung gestellt.
(D) repräsentative konfokale Bild der Kammern Ei aus dem Eierstock einer weiblichen Biosensor-Fliege mit normalen fliegen Essen für 6 Tage (unbehandelt) gefüttert.
(E) repräsentatives konfokale Bild der Kammern Ei aus dem Eierstock einer kalt schockiert weibliche Biosensor-Fliege bei-7 ° C für 1 h platziert und wechselte dann zum normalen Kultur Bedingung für 1 Tag (Kälteschock, CS).
(F) wie Panel E außer der kalten schockiert fliegen wurden auf normalen Kultur Bedingung für 3 Tage (Recovered nach CS) umgestellt.
(G) repräsentatives konfokale Bild des Eies, die Kammern aus dem Eierstock einer ausgehungerten weiblichen Biosensor Fliegen gefüttert mit 8 % Saccharose in 1 % Agar ohne Protein für 3 Tage (verhungert).
(H) wie Panel G außer die behandelten fliegen wurden auf normales fliegen Essen für 3 Tage nach Protein-Hunger-Behandlung (wieder zugeführt) umgestellt.
(I) wie panel G außer zeigt den Hungertod von Caspase insensiblen CaspaseTracker (DQVA) weibliche Biosensor fliegen, welche als Negativkontrolle diente.
(J) repräsentative konfokale Bild Ei Kammern aus einem ausgehungert und erneut zugeführt werden, weibliche Drosophila. Pfeile zeigen nuklearen GFP mit dem Ausdruck in der Krankenschwester Zellen (schwarz), Eizellen (weiß) und Follikelzellen (gelb) Ei Kammern und in die Germarium (grün). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Physiologische, pathologische und therapeutische Implikationen der Anastasis. (Mit freundlicher Genehmigung von Tang Et Al., F1000Res 2017, 06:43 angenommen 21 ). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das CaspaseTracker dual Biosensor-System ist ein neuartiges und einzigartiges Werkzeug, das ermöglicht die Erkennung von den vergangenen oder laufenden Caspase-Aktivität und Verfolgung von Zellen, die Zelle Tod rückgängig gemacht haben verarbeiten und Überleben nach Caspase-Aktivität in Vivozu erleben. Während traditionell Caspase-Aktivität als ein Markenzeichen der Apoptose angenommen hat, zeigen wachsende Untersuchungen, dass-apoptotische Caspase-Aktivität mögliche Rollen in diversen normalen Zellfunktionen wie Regulierung der neuronalen Aktivität79, spielt 80, lernen und Gedächtnis81,82,83,84, Unterdrückung der Necroptotic Zelle Tod85,86, Spermatid Individualisierung87 88, MicroRNA Verarbeitung89, Zelle Verbreitung90und Zelle Schicksal Musterung91. Neben der Apoptose und Anastasis erkennt das CaspaseTracker-Biosensor-System daher-apoptotische Caspase-Aktivität, die in das Gehirn und Sehlappen, Kardia, Darm, Malpighian Tubuli, Luftröhre, Muskeln und anderen Geweben des vorhanden ist Drosophila19,46,64. Dieses Biosensor-Signal kann auch die aktuelle oder vergangene Anastatic Aktivität während der Entwicklung des Embryos oder normale Homöostase in diesen Geweben darstellen. Um die Anastasis nach vorübergehender Zelle Tod-induzierende Umweltstress mit lebenden Tieren zu untersuchen, ist es wichtig, wählen Gewebe mit Zellen, die keine Caspase-Biosensor-Aktivität unter normalen physiologischen Bedingungen aufweisen, aber Caspase unterziehen induziert werden können Aktivierung durch vorübergehende Zelle Tod Induktion. Ei Kammern sind für diesen Zweck ideal, denn sie haben in der Regel keine Caspase-Aktivität von Germarium bis Stufe 10 während der Oogenese58,59,92.

Weibliche Drosophila , transiente Umweltbelastungen ausgesetzt, können wie z. B. Protein Hunger und Kälteschock, effizient Caspase-Aktivierung und Zelltod in Ei Kammern19,57,58auslösen, 78. Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls gehören die Vermeidung längerer Zelle Tod Induktion zu fliegen. Optimierten Bedingungen an Protein Hunger (8 % Saccharose in 1 % Agar für 3 Tage) und Kälteschock (1 h bei-7 oC) zur weiblichen fliegen können Caspase aktivierte Zelle Todesprozess in Ei Kammern auslösen und erlauben sie sich erholen, nachdem die gestressten fliegen an zurückgegeben werden Normalzustand19. Längere Behandlung mit einer Zelle Tod Reiz auslösen kann mehr Ei Kammern um den Zelle Todesprozess durchmachen, aber die Wiederfindungsrate wird ebenfalls reduziert, vermutlich weil die sterbenden Ei Kammern massive Schäden irreparabel erleben.

Ein weiteren wichtiger Schritt in diesem Protokoll wird zur Verringerung der CaspaseTracker Hintergrundsignal in Ei Kammern durch Kreuzung, anheben und die Aufrechterhaltung der CaspaseTracker bei einer niedrigeren Temperatur, z. B. 18 oC. fliegt Während die Mehrheit der Ei Kammern aus optimal aufgezogen fliegen zeigen keine Caspase-Aktivität in der Germarium durch Stufe 10 Oogenese58, etwa 1 % der Ei Kammern konnte zeigen Caspase-Biosensor-Aktivität ohne Zelle Tod Induktion19 . Dies spiegeln die normale Fluktuation aufgrund von angeborenen Fehlern oder kann während der Oogenese durch standard Laborbedingungen unbeabsichtigt ausgelöst werden. Wie Gal4 weniger Aktivität in fliegen bei niedriger Temperatur93angezeigt wird, kann fliegen am 18 oC und nicht bei Zimmertemperatur, Erhöhung der endogene Signal reduzieren, das das CaspaseTracker-System aktiviert. Alternativ kann fliegen die Umstellung auf eine höhere Temperatur, wie 29 oC, Erhöhung der Empfindlichkeit des CaspaseTracker Systems, wegen in die Gal4-Aktivität-93und mögliche andere endogene temperaturabhängige enzymatische erhöhen Aktivitäten.

Es ist wichtig, die CaspaseTracker-positiven Zellen unterscheiden, die durchmachen Zellprozess Tod oder Anastasis aus Zellen, die nicht-apoptotische Caspase-Aktivität aufweisen. Apoptotische Zellen express RFP (transient-Marker für laufende oder kürzlich Caspase-Aktivität) und oft GFP (permanent Maker für letzten Caspase-Aktivität) in der Behandlung der Apoptose-Induktion, da diese Zellen sterben laufenden Caspase-Aktivität, dass Gal4 Spalten aktiviert haben, die dann aktiviert die Transient (Gal4 aktivitätsabhängige RFP) und dauerhafte (Gal4 ausgelöst FLPase-FRT vermittelte GFP) Reporter von der G-Trace-System. Apoptose dieser Zellen kann bestätigt werden, dass morphologische und biochemische Markenzeichen wie nukleare Kondensation durch Färbung mit nuklearen Farbstoffe14,19,58erkannt und Caspase Spaltung von erkannt Immunostaining19,94. Zellen, die Anastasis bereits durchlaufen haben Anzeige permanent GFP Ausdruck aufgrund der FLPase-vermittelten Rekombination-Veranstaltung von G-Trace-System. Diese Zellen express keine RFP, da sie keine andauernde Caspase-Aktivität, noch andere Markenzeichen von Apoptose19haben. Diese Zellen werden auch normale nuklearen Morphologie angezeigt. Zellen haben andauernde-apoptotische Caspase Tätigkeit oft anzeigen RFP und GFP Ausdruck und haben auch eine normale nuklearen Morphologie-19.

Es kann schwierig sein, Zellen unterscheiden, die Anastasis aus diesen Zellen, die vorbei-apoptotische Caspase-Aktivität erfahren, da beide nur GFP anzeigen und kein Markenzeichen des Zelltods haben. Daher müssen sorgfältige Experimente enthalten19sein. Für Beispiele um Anastasis in Ei Kammern zu studieren ist es wichtig, GFP Ausdruck betont erholte sich fliegen und nicht gestressten fliegen (Negativkontrolle) zu untersuchen. Wiederhergestellte fliegen sollte mehr GFP exprimierenden Zellen als entspannt fliegen zeigen, ob Anastasis nach der Aktivierung der Caspase aufgetreten ist. Es ist auch wichtig, unspezifische Auto-Fluoreszenz, wie in der Kutikula, Pigmente und Fett Körper19CaspaseTracker fluoreszierenden Signale unterscheiden. Negativkontrolle Biosensor fliegen erzeugten wir mutiert die Caspase-Spaltstelle von der Biosensor (DQVD) zu einer nicht spaltbaren Sequenz (DQVA) und damit rendering der Kontrolle Biosensor zu Caspase Tätigkeit19nicht mehr reagiert. Das Signal in die Caspase empfindlich (DQVD) erkannt, aber nicht in die negativ-Kontrolle (DQVA)-Biosensor-fliegen ist das Signal von Interesse, ausgelöst durch Caspase-Aktivität, sondern als Auto-Fluoreszenz.

Unsere aktuellen Drosophila dual CaspaseTracker Biosensor kann Zellen mit "neueste" Caspase-Aktivität durch Expression von RFP, und mit "Vergangenheit" Caspase-Aktivität durch Expression von GFP19identifizieren. Wir beachten Sie, dass RFP kein "Echtzeit" Caspase-Aktivität-Indikator ist, denn es ein paar Stunden Reaktionszeit für Gal4 dauert, die Expression von RFP in Reaktion auf Caspase-Aktivität zu fahren. Fügen Sie eine "Real Time"-Funktion, der Drosophila CaspaseTracker Biosensor ist kombinierbar mit der neu entwickelten iCasper Biosensor52, ein "Real-Time" und "dunkel bis hell" in Vivo -Biosensor, der nur seine dunkelrote Signal zeigt, wenn es von Caspasen gespalten.

Abgesehen von Apoptose, CaspaseTracker könnte möglicherweise auch während alternative Arten von Zelltod aktiviert werden, wie Zellen Zelle Tod wegen deren Verlauf wechseln können, die direkt oder indirekt Caspase-Aktivierung, wie z. B. Autophagie nach beinhaltet verhungern95,96, Nekrose durch die Kälte Schock-induzierte Plasmamembran Bruch19,55,56,78und Staurosporine-induzierten Necroptosis97, 98. Unsere gegenwärtigen und früheren Studien gezeigt, dass die CaspaseTracker Biosensoren erholte sich von dieser Zelle Tod Induktionen in Vitro oder in Vivo17,18,19 Zellen beschriften können , 20 , 21. wie diese Zelle Tod Induktionen allein gleichzeitig mehrere Zelle Tod Wege in den gleichen Zellen aktivieren konnte, die Wiederherstellung dieser Zellen sterben deutet darauf hin, dass Anastasis ist eine allgemeine Zelle Erholung Phänomen, das verschiedene Zelltod rückgängig machen kann Prozesse, einschließlich der Apoptose, Autophagie, Nekrose und Necroptosis, einzeln oder gleichzeitig.

Der in-Vivo -CaspaseTracker-Biosensor erleichtert Verfolgung des noch unbekannten Funktionen, Mechanismen und therapeutische Implikationen der Anastasis ()Abb. 4()21. Um die molekulare Signatur von Anastasis zu enthüllen, führten wir Zeitverlauf Vollständiggenom Microarray Genexpressionsstudien zu primären Leberzellen Maus während der Umkehrung der Ethanol-induzierten Apoptose zu analysieren, und Interessanterweise fand auffällige Veränderungen in die Transkription von Genen, die in mehrere Wege einschließlich pro-überleben, Anti-Oxidation, DNA-Schäden-Reaktion, Histon-Modifikation, Angiogenese, Zellwanderung und Transformation18,21. Dieser Befund wird durch unsere Validierungsstudie der Erholung der menschlichen Leber Krebs HepG2-Zellen von Apoptose18,21, und auch eine unabhängige RNA-Sequenzierung Studie von HeLa-Zellen bei der Beitreibung von Apoptose99unterstützt. Interessanterweise, Up-Verordnung einige pro-überleben-Faktoren in den Anastatic Zellen gefunden werden auch beobachtet in Umkehrung der Herzinsuffizienz, Tumorprogression und Krebs Wiederauftreten100,101,102, was darauf hindeutet die mögliche Beteiligung der Anastasis. Um die physiologischen, pathologischen und therapeutischen Potentiale von Anastasis zu studieren, ist es wichtig, die Anastatic Zellen zu identifizieren und verfolgen Sie ihr Schicksal bei Kleintieren, mechanistische und therapeutische Studien ermöglichen wird. Unsere Drosophila und Säugetieren CaspaseTracker Biosensoren werden nützliche Tools zum Testen der möglichen Beiträge der Anastasis in normale Entwicklung, Homöostase, Gewebe Erholung, Tumor-Evolution, Rezidiv und Metastasierung. Erkenntnis aus diesen Studien wird unser Verständnis der natürlichen Rolle der Anastasis zu steigern und bieten Potenzial revolutionäre neue Therapieansätze für hartnäckigen Krankheiten durch Vermittlung von Zelltod und Überleben durch controlling Anastasis zu identifizieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Darren Obbard für Drosophila Bild in Abbildung 3 und video Manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson und Heather M. Lamb für wertvolle Diskussion dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright gewähren 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation Fellowship (H.L.T.) und NCI K22 gewähren CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang war ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

Medizin Ausgabe 132 Anastasis Apoptose Autophagie Biosensor Caspase CaspaseTracker Nekrose Necroptosis programmierten Zelltod Umkehrung der Apoptose
Erkennung von Anastasis <em>In Vivo</em> durch CaspaseTracker Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter