Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לזהות ויוו כי התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים יכולים להראות מורפולוגית תאים בריאים נורמלי. כאן נתאר פרוטוקולים עבור זיהוי ומעקב אחר תאים עוברים anastasis בבעלי חיים באמצעות פיתח ויוו CaspaseTracker ביוסנסור המערכת שלנו.

Abstract

אנסתזיס (מיוונית "מתגברת לחיים"): היא תופעה שחזור תא שנתגלתה לאחרונה לפיה למות תאים יכול להפוך תהליכים מוות תאים בשלב מאוחר מטופלות בדרך כלל להיות מהותי בלתי הפיכות. קידום anastasis יכול עיקרון הצלה או לשמר נפגע תאים שנמצאים קשה להחליף כגון cardiomyocytes או נוירונים, ובכך להקל שחזור רקמות. לעומת זאת, דיכוי anastasis של תאים סרטניים, שעברו אפופטוזה לאחר טיפולים אנטי סרטניים, עשויה להבטיח מוות תאי סרטן ולהפחית את הסיכוי להישנות. עם זאת, מחקרים אלה יש כבר הקשו על ידי חוסר של כלי למעקב אחר גורלם של תאים עוברים anastasis בבעלי חיים. האתגר הוא לזהות את התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים למרות הופעתם מורפולוגית נורמלי לאחר השחזור. כדי להתגבר על הקושי הזה, פיתחנו דרוזופילה ו בתרבית של מערכות ביוסנסור CaspaseTracker זה יכול לזהות ולעקוב באופן קבוע את התאים anastatic חוץ גופית בתוך או ויוו. כאן, אנו מציגים ויוו פרוטוקולים עבור הדור והשתמש של מערכת ביוסנסור כפול CaspaseTracker לזהות ולעקוב אחר anastasis ב דרוזופילה melanogaster לאחר ארעי חשיפה לגירויים מוות התא. בעוד ביולוגיים קונבנציונאלי ופרוטוקולים יכול תווית תאים מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע באופן פעיל העובר, החיישן CaspaseTracker יכול לצמיתות תווית תאים התאוששו לאחר קספאז ההפעלה - סימן היכר של אפופטוזיס בשלב מאוחר, ו במקביל לזהות תהליכים אפופטוטיים להיפגע פעיל. ביוסנסור הזה יכול גם לעקוב אחר התאוששות התאים ניסיון צורות אחרות של מוות של תאים במישרין או בעקיפין מעורבים קספאז פעילות. לכן, פרוטוקול זה מאפשר לנו לעקוב באופן רציף את גורלו של תאים אלה, הצאצאים שלהם, בקידום מחקרים עתידיים של תפקודים ביולוגיים, המנגנונים המולקולריים, השלכות פיזיולוגיים ופתולוגיים, השלכות טיפוליות anastasis. נדון גם הפקדים המתאימים כדי להבחין בין התאים עוברים anastasis מאלו המציגים שאינם אפופטוטיים להיפגע קספאז פעילות בתוך vivo.

Introduction

מות תאים מתוכנת, כגון אפופטוזיס, ממלא תפקיד חיוני בתחום הפיתוח עובריים הומאוסטזיס נורמלי על ידי ביטול תאים לא רצויים, פצוע או מסוכנים אורגניזמים רב תאיים1,2,3. האובדן של איזון בין מוות תאי ההישרדות יכול להוביל לתוצאות קטלניות כגון סרטן, אי ספיקת לב, מחלת חיסון עצמי, ניוון4,5,6,7,8. הפעלה של התליין caspases באופן מסורתי נחשב כמו "נקודת האל חזור" אפופטוזיס9,10,11, כפי שהוא מפעיל מהירה ומסיביים הריסה הסלולר12, 13,14,15,16. מאתגר את הדוגמה כללית, הפגנו כי תאים בתרבית ראשי הגוסס ותאים סרטניים יכול לשחזר לא רק לאחר הפעלת קספאז, אבל גם הבאים תא חשוב המחפשים מוות כולל קרום פלזמה blebbing, הצטמקות תא, פיצול מיטוכונדריאלי, שחרורו של מיטוכונדריאלי ציטוכרום c לתוך ציטוזול, גרעיני, עיבוי כרומטין, נזק לדנ א, פיצול גרעינית, חשיפת פני שטח התא phosphatidylserine (PS), ועל היווצרות אפופטוטיים להיפגע גופות 17 , 18 , 19 , 20 , 21. אנו מציעים anastasis הזה הוא תופעה שחזור תאים פנימיים, כמו תאים גוסס יכול לשחזר לאחר הסרת תאים מוות גירויים17,18,19,20, 21. אנחנו טבע את המונח "Anastasis" (Αναστάσης)18, מה שאומר "עולה לחיים" ביוונית, כדי לתאר את התופעה שחזור התא לא צפוי. שלנו התבוננות anastasis נוספות נתמך על ידי מחקרים עצמאיים החושפים גם שחזור של תאים לאחר phosphatidylserine הוצאתו22,23,24, מוגבל מיטוכונדריאלי החיצוני קרום permeabilization25, הפעלה של השושלת מעורב קינאז כמו (MLKL) ותא הצטמקות26.

אפיון מנגנוני ויסות anastasis יהיו השלכות פיזיולוגיות פתולוגי, טיפולית הפרדיגמה-shifting. Anastasis יכול לייצג מנגנון cytoprotective לא מוכרת או לשמר תאים postmitotic חשוב, רקמות שקשה להחליף, ואולי חשבון עבור היפוך אי ספיקת לב על ידי חדרית פריקה עם השמאל חדרית לסייע27,התקנים (LVADs)28, שחזור של תאים קולט אור לאחר חשיפה ארעית של אור מופרז29,30,31, או תיקון של נוירונים לאחר פגיעה במוח32. אם כך קידום anastasis יכול לשפר את שחזור תאים ורקמות. לעומת זאת, anastasis יכול להיות טקטיקת בריחה בלתי צפוי בשימוש על ידי תאים סרטניים לשרוד טיפול גרימת מוות התא, גורם לסרטן הישנות17,18. לכן, דיכוי anastasis בלמות תאים סרטניים במהלך ואחרי הטיפול בסרטן יכול להיות אסטרטגיה טיפולית חדשנית כדי לרפא סרטן על ידי מניעת התדרדרות שלהם.

במהלך התהליך של anastasis, מצאנו כי כמה תאים התאושש רכשה שינויים גנטיים קבועים, עברה שינוי oncogenic, ככל הנראה בגלל נזק לדנ א שנצברו במהלך אפופטוזיס18,20,21 . היפוך תהליך מוות של תאים פגומים-דנ א יכול להיות מנגנון של tumorigenesis, פוטנציאל שבבסיס את התצפית כי חזר על פגיעה ברקמות מגביר את הסיכון של סרטן במגוון של רקמות, כגון פגיעה תרמי כרונית בוושט הנגרמת על ידי הצריכה של משקאות חמים מאוד33,34,35, נזק לכבד עקב אלכוהוליזם36,37, התפתחות הגידול לאחר טיפול בסרטן genotoxic38, 39,40, ויש התפתחות סרטן חדשים מרקמות נורמלי המתעוררות במהלך המרווחים בין מחזורי טיפול נגד סרטן41,42,43,44 . אם true, מיקוד anastasis יכול למנוע או לעצור התפתחות סרטן והתקדמות. מצאנו רעב-induced בתאי הנבט הגוסס עוברים anastasis דרוזופילהמחדש הפדרציה19.  אם anastasis מתרחשת בתאי הנבט עם נזק לדנ א, זה יכול להיות חשבון עבור התצפית כי ממושך עקה מקדם התפתחות של מחלות גנטיות. לדוגמה, הרעב תורמים להתפתחות של transgenerational למחלות כמו סוכרת, מחלות לב כליליות45. לכן, הבנה anastasis עלול להוביל אסטרטגיות למניעת פיתוח שעברו בירושה מחלות שנגרמות על ידי מנגנון פוטנציאל זה.

כדי לרתום את הגילוי של anastasis וישיר אותו לפתח טיפולים חדשניים, זה חיוני כדי ללמוד על סיבה ותוצאה של anastasis בבעלי חיים. עם זאת, זה טכנית מאתגר לזהות ולעקוב anastatic תאים ויוו, כי התאים התאוששה תהליך מוות תאי מופיעים מורפולוגית להבחין מגניחותיה תאים בריאים נורמלי, ויש אין סמן של anastasis מזוהה אך17,18,21. כדי לטפל בבעיות אלו, שפיתחנו לאחרונה חדש ויוו קספאז ביוסנסור המיועד "CaspaseTracker"19, לזהות ולעקוב תאים ששורדים אפופטוזיס לאחר הפעלת קספאז19,46, סימן ההיכר של אפופטוזיס10,14. המבדיל אותו קספאז "בזמן אמת" ביולוגיים כגון לצואת12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 , iCasper52 זה מגלה פעילות קספאז מתמשך, החיישן CaspaseTracker כולל בנוסף את היכולת לצמיתות תווית תאים הפעילות קספאז אקספרס אפילו transiently. לכן, החיישן CaspaseTracker מאפשר מעקב ארוך טווח של anastasis לאחר היפוך של קספאז בתיווך תא תהליך המוות בתוך vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) הכנת CaspaseTracker ביוסנסור זבובים

  1. עזים ומתנגד זבובים עם CO2ולאחר להשתמש במכחול כדי להעביר 7 עד 10 קספאז רגיש Gal4 (DQVD)19 בתולה נקבות ו- 7 10 G-מעקב53 Gal4 כתב צעיר זבובים זכרים (או להיפך) בבקבוקון אותו עם אוכל לטוס והדבק שמרים טריים.
    הערה: הצלב של הזבובים קספאז רגיש (DQVD) Gal4 ו- G-מעקב תפיק CaspaseTracker רומא זבובים. לחצות קספאזברגיש (DQVA)19 Gal4, G-מעקב זבובים תספק שליטה שלילי זבובים (ראה דיון). שמרים טריים הדבק משמש מקור חלבון כדי לשפר את ייצור הביצים, אז זה מעלה מספר צאצאי. בחר נקבות בתולה וזבובים זכרים צעירים לפי שלהם פנוטיפים54.
  2. תקופת דגירה הזבובים-18 מעלות צלזיוס (oC) במהלך הצלב של 3-7 ימים, ולאחר מכן להעביר את הזבובים כדי בקבוקון חדש כדי להגדיר צלב חדש ב- 18 מעלות צלזיוס. להמשיך דגירה המבחנה המקורי ב 18 ° C עד רומא טס eclose.
    הערה: העברת הזבובים האב בקבוקונים חדשים כדי למנוע צפיפות יתר צאצאי על המבחנה המקורי. זבובים האב יכול לייצר רומא עם אוכל טרי, ממרח שמרים-בבוררים קודם 2 עד 3 ולאחר מכן הפרודוקטיביות יקטן באופן משמעותי עם הזמן. מגדל הזבובים 18 ° C. המצמצמים את האות לא ספציפית של CaspaseTracker ביוסנסור (ראה דיון).
  3. רומא בחר טסה עם פנוטיפים הנכון54 לניסויים הבאים.
    הערה: Transgenes של קספאז רגיש Gal4 וגם G-מעקב כאן ממוקמים כרומוזום השני, מאוזנת עם מאזן ארגון הקתולים הצעירים. בחר הוא צאצא כנף מתולתל (ללא ארגון הקתולים הצעירים), שבו יש שני transgenes של קספאז רגישים Gal4, G-מעקב.

2) יישום האינדוקציה מוות תא ארעית כדי CaspaseTracker ביוסנסור זבובים

  1. העברת 10 עד 20 לאחרונה eclosed הנקבה טסה בקבוקון חדש עם אוכל לעוף טרי, ממרח שמרים טריים עבור יום אחד ב 18 ° C כדי לאפשר ייצור הביצים קאמרית מאת oogenesis.
    הערה: שמירה על הנקבה עם זבובים זכרים יכול להגביר ייצור תא ביצה.
  2. לזירוז תאי ביצה במנגנוני מאת הלם קר, להעביר נקבות הזבוב הבקבוקון ריק חדש, אשר הוכנסה ב-7 מעלות לשעה.
    הערה: הלם קר פצעה תאים על ידי גרימת קרום פלזמה-קרע-55,-56.
  3. לזירוז תאי ביצה במנגנוני ברעב חלבון, העברה נקבות הזבוב בקבוקון חדש עם 8% סוכרוז ו 1% אגר אוכל ב 18 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
    הערה: רעב חלבון (חלבון שאינו מזון) יוכל להפעיל את תאי ביצה לעבור אפופטוזיס57,58,59 ועד autophagy60,61. מתג טסה בקבוקון חדש עם 8% סוכרוז ו 1% אגר אוכל כל יום כדי לשמור על מצב אופטימלי של סוכרוז אוכל לעוף.
  4. העברת הזבובים לחוץ לחזור בקבוקון חדש עם אוכל לעוף טרי, ממרח שמרים טריים במשך 3 ימים ב 18 ° C כדי לאפשר להם לשחזר. לנתח את מורעבים, הזבובים מורעבים-התאושש כדי להשיג ביצה צ'יימברס-השחלות כמו שמתואר62.
    הערה: לנתח דרוזופילה להשיג השחלות, עזים ומתנגד זבובים עם CO2, ולא להשתמש 2 זוגות של מלקחיים כדי להסיר את הראש לטוס ולהשתמש המלקחיים למשוך בבסיס הבטן כדי להסיר את השחלות של הזבובים.

3) קיבעון, צביעה של תאי ביצה גזור עבור הדמיה

  1. להעביר את תאי ביצה ביתור יחד עם סביב 0.5 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) 1 מ"ל צנטריפוגה צינורות. לאפשר את הביצים להתמסד.
    הערה: מעיל העצות פיפטה פלסטיק עם 1% שור אלבומין (BSA) מומס במים או PBS כדי למנוע את תאי ביצה להשאר על המשטח פלסטיק של הטיפים. בצע את ההליכים הבאים בחושך כדי להימנע photobleaching של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP, הידוע גם בשם DsRed), חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בלשכה הביצה.
  2. הסר את PBS על-ידי pipetting, ולאחר מכן החל paraformaldehyde 4% 0.5 מ ב- PBS לתקן את תאי ביצה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 20-30 דקות.
    הערה: החל סיבוב עדין זה, בשלבים הבאים הדגירה.
  3. להסיר את paraformaldehyde על-ידי pipetting ולאחר מכן שטפו תא ביצה עם 0.5 mL PBST (PBS + 0.1% טריטון X-100) עבור 3 פעמים.
    הערה: קיבוע ממושך יכול להפחית את האותות RFP ו- GFP.
  4. דגירה של לשכות ביצה עם PBST 1 עד 2 h בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב 4 ° C עם סיבוב עדין כדי permeabilize את תאי ביצה.
    הערה: PBST ניתן גם למנוע תאי ביצה לדבוק פני השטח מצופה פלסטיק שאינו-BSA.
  5. להסיר את PBST על ידי pipetting, ולאחר מכן החל 0.5 מיליליטר 10 μg/mL של דיו כחול Hoechst גרעינית ב PBST ללשכה ביצה עבור 1 עד 2 h בטמפרטורת החדר כתם על גרעין.
    NOTE1: הימנע דגירה ממושך עם צבע גרעיני כמו זה יגדיל את האות לא ספציפית.
    NOTE2: גישה חלופית כתם גרעין ללא Hoechst היא להוסיף 200 μL anti-הלבנת הרכבה סוכן עם דאפי (ראה חומרים) דגירה לילה63לפני הרכבה הרקמות ב- slip כיסוי זכוכית כפי שתואר על פרוטוקול 3.8.
    NOTE3: לבצע את ההכתמה ההליכים הבאים בחושך כדי להימנע photobleaching.
  6. להסיר את הצבע גרעיני על-ידי pipetting, ולאחר מכן החל 0.5 mL PBST לרחוץ את תאי ביצה בתוך הצינורות צנטריפוגה 1 מ"ל עבור 3 פעמים, עם הדגירה 10 עד 20 דקות עם סיבוב עדין בין שלב לשלב הכביסה.
  7. להסיר את כל PBST עם פיפטה בסדר, ולאחר מכן החל 200 μL anti-הלבנת הרכבה הסוכן (ראה חומרים) דגירה של תאי ביצה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות או למשך הלילה ב 4 ° C עד הצ'יימברס ביצה לשקוע לתחתית הצינור.
    הערה: רקמות באופן מלא שספגו את הסוכן הרכבה לשקוע לתחתית הצינור.
  8. הר הצ'יימברס ביצה מוכתם על ידי העברת אותם עם 200 μL נגד הלבנת-הרכבה הסוכן על משטח זכוכית נקי מראש עבור הדמיה על ידי pipetting, לכסות את תאי ביצה עם 20 x 20 מ מ זכוכית נקי מראש מכסה, ויסגור בתגית כיסוי זכוכית שקופית על-ידי הצבת . לק בקצה של תגית כיסוי
    NOTE1: מראש לנקות את זכוכית ואת הכיסוי להחליק עם מים או 70% אתנול.
    NOTE2: החל וזלין בין השקופית זכוכית בתגית כיסוי כדי להימנע להרוס את תאי ביצה על ידי overcompression.
  9. תמונה של תאי ביצה באמצעות קרינה פלואורסצנטית או מיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות סימן x 20, נה 0.8 תוכנית-עדשה אפוכרומטית אובייקטיבי, עם עירור אור באורך גל 405 ננומטר עבור צביעת גרעיני (זיהוי פליטת ~ 461 nm), 561 nm עבור (אות RFP (פעילות קספאז מתמשך או אחרונים) זיהוי פליטת ~ 590 nm), ו- 488 ננומטר לאות GFP (מעבר קספאז פעילות) (לזהות פליטה ~ 518nm).
    הערה: ראה שלנו פרוטוקולים שפורסמו עבור מיקרוסקופ20,64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעוד תא חי זמן לשגות מיקרוסקופ הוא שיטה אמינה כדי בדרכי anastasis תאים בתרבית20, זה מאתגר כדי לזהות אילו תאים שעברו anastasis ב בעלי חיים, כי התאים התאושש מופיעים מורפולוגית להבחין מגניחותיה בין תאים בריאים נורמלי זה לא ניסו מוות של תאים. לדוגמה, תאים סרטניים בצוואר הרחם אנושיים הלה להציג ההיכר מורפולוגי של אפופטוזיס1,2,14, כגון תא הצטמקות, גרעיני התעבות קרום פלזמה blebbing בתגובה המוות של תאים גירוי של 1µM staurosporine17 (איור 1A, איור 1B i-ii). לאחר הסרת הגירוי מוות התא של דגירה בינוני טריים, התאים הגוססים להפוך תהליך מוות של תאים על-ידי anastasis17,18, כמצוין על-ידי שחזור מורפולוגי (איור 1B iii-iv), ואחריו התפשטות (איור 1B v-vi). מחקרים קודמים שלנו גם השתמשו ביולוגיים קספאז "בזמן אמת", כגון ApoAlert (נס-DEVD-YFP-NLS) להפגין היפוך של אפופטוזיס לאחר קספאז הפעלה18,20. ביוסנסור זו רגישה ציטוזול בתאים בריאים (איור 1C, 1 י אני). על ההפעלה קספאז המופעלות על-ידי מוות תא גירוי האתנול 3.7 אחוזים, זה ביוסנסור מבוססי YFP הוא ביקע מאת caspases, translocated אל הגרעין, שבו הוא מצטבר, זריחה גרעיני וכתוצאה מכך התג שלו YFP מזהה תאים עם מתמשך פעילות קספאז (איור 1 ג, 1 ד ii-iii). התאים הגוססים להציג גם ההיכר מורפולוגי של אפופטוזיס במהלך אתנול-אינדוקציה1,14,18,20, כגון פיצול של המיטוכונדריה צינורי, גרעיני עיבוי הצטמקות תא, קרום פלזמה blebbing (איור 1D ii-iii). מעניין, לאחר הסרת הגירוי מוות התא, לאותם התאים באפשרותך לשחזר, ולזכות מורפולוגיה תקינה (איור 1D iv-viii). ראוי לציין, הגרעין של ApoAlert (cleaved ביוסנסור) הוא נעלם בתוך שעה אחת בתאים ששוחזר (איור 1D iv-viii), כנראה עקב תהליכים דומים לסלק רכיבים פגומים ב anastatic תאים18 , כגון קספאז cleaved-3, PARP ICAD שנוצרו במהלך אפופטוזיס. לכן, אסטרטגיה חדשה נדרש מעקב anastasis על מסגרת זמן ארוך יותר, במיוחד ויוו.

כדי לעקוב אחר גורלם של תאים anastatic, פיתחנו יונקים CaspaseTracker ביוסנסור המערכת, אשר לצמיתות תוויות התאים לאחר להיות ביקע על-ידי פעילות קספאז התליין. ביוסנסור הזה מורכב rtTA של קספאז רגיש (transactivator שבשליטת טטרציקלין הפוכה), עיתונאי Cre-LoxP מבוססי לפעילות rtTA (איור 2 א-ב). בתאים בריאים עם שום פעילות קספאז, rtTA transactivator65 קשורה ל קרום פלזמה עוגן (לין11)66,67, האות אי-הכללה של גרעין (נס) של קינאז קינאז מפה (MAPKK)68, ו אסטרוגן קולטן variant (ERT2)69 דרך קספאז-cleavable linkers70 (DEVD) נגזר PARP (איור 2 א, 2 ב). כפי rtTA קשור לא translocate מן ציטוזול את הגרעין, זה לא יכול להפעיל את הכתב rtTA. עם זאת, בעת הפעלת בתגובה לגירוי מוות התא, caspases קליב את linkers DEVD, משחרר את rtTA כדי translocate את הגרעין (איור 2B). פעם אחת בגרעין, rtTA המאגד רכיב תשובה ט (TRE) וביטוי מפעילים ארעית של Cre recombinase, מה שמוביל זה מסיר את הקלטת codon להפסיק בין יזם את החטיבה את רצפי קידוד עבור אירוע רקומבינציה בלתי הפיך חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed). התוצאה היא ביטוי קבוע של DsRed (איור 2B), משמש סמן פלורסנט קבוע של התאים האלה זה יכול להישאר בחיים אחרי שהם חוו קספאז פעילות, כמו גם הצאצאים שלהם (איור 2C).

כדי לבדוק את החיישן CaspaseTracker יונקים, אנחנו שהציג אותו. לתוך תאים הלה ארעי תרביות תאים, התאים עם גירוי מוות התא (1µM staurosporine) ובא בפיקוח שחזור של התאים תאים חיים זמן לשגות מיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שיש לנו תיאר20. דוקסיציקלין (ריכוז סופי 1µg/mL), אשר חיוני כדי לאפשר rtTA פעילות65,71, נוספה המדיום התרבות התא כדי להפעיל את החיישן לאורך כל הניסוי. בתגובה הגירוי מוות של תאים, התאים שטופלו להציג ההיכר של אפופטוזיס, כולל הצטמקות תא, קרום פלזמה blebbing כמו הצפוי (איור דו-ממדי i-iii). לאחר הסרת הגירוי מוות התא, שטיפה anastasis שכבה אחת ולאחר הוספת בינוני תרבות טריים, את התא יכול להיות שנצפו בתאי גוסס, כמצוין להם לחזור מורפולוגיה תקינה (איור דו-ממדי הרביעי-vii). רע רק התאוששה תאים אקספרס DsRed פלורסנט בסמן במהלך ואחרי anastasis (איור דו-ממדי הרביעי-vii), הבחנה אותם תאים שאינם משוחזרים (איור דו-ממדי הרביעי-vii), והן תאים שליטה לא חשוף הגירוי מוות התא (2E איור). זה מדגים את היישום ואת התועלת של CaspaseTracker יונקים כמו הרומן החדש כלי זיהוי לצמיתות סימון תאים anastatic מתאוששת קספאז-הפעלה, מספק לך דרך לעקוב אחר וללמוד את גורלם וקהילותיהם.

לזהות ולעקוב אחר anastasis של בעלי חיים, חיות הטרנסגניים ביוסנסור CaspaseTracker נדרשים. לכן, תחילה השתמשנו דרוזופילה melanogaster בתור מערכת מודל19, כי כפי שהוא אורגניזם גנטית צייתן חשוב במחקר של מחלות האדם72,73,74 ופיתוח בעלי חיים ,75. כפי ששונה מ החיישן CaspaseTracker יונקים, החיישן כפול דרוזופילה ניתן לזהות, להבחין בין "אחרונים/שוטפת" של "מעבר" פעילות קספאז. ביוסנסור כפול זה מורכב Gal4 רגיש קספאז19, והכתבת Gal4 G-מעקב53 (איור 3 א). תאים עם שום פעילות קספאז, גורם שעתוק שמרים Gal4 קשורה לתחום עוגן (mCD8) קרום פלזמה באמצעות מקשר קספאז-cleavable (DQVD) נגזר DIAP1 (איור 3B), עובר מוטציה 21NN/GV22 כדי למנוע השפלה של Gal4 על ידי הכלל N-end על המחשוף קספאז את afterAsp20 מקשר76, מוטציה D135R לבטל drICE את קספאז פונקציית מעכבות תחום BIR177. כפי Gal4 קשור לא יכול translocate את גרעין בלי מחשוף מאת קספאז לשחרר אותו, הכתב Gal4 G-מעקב נשאר לא פעיל בתאי עובר אין פעילות של קספאז19. עם זאת, בעת הפעלת קספאז, caspases מופעל קליב את מקשר DQVD, פינוי Gal4 כדי translocate לתוך גרעין כדי להפעיל את הכתב (איור 3 א) G-מעקב19. Gal4 נקשר ספציפית במעלה הזרם הפעלת רצפים (UAS) כדי לעורר שעתוק ארעי וביטוי של RFP, אשר משמשת ככתבת פלורסנט של פעילות קספאז האחרונות או הנוכחי עד Gal4 תחנות פעילות (קספאז) ולאחר מכן היא RFP חלבון יורד. Gal4 מפעילה גם ביטוי של FLP recombinase מ transgene, המוביל אל אירוע רקומבינציה מסיר את הקלטת stop codon בין מקדם אוביקוויטין (Ubi) רצף קידוד עבור GFP, ממוקדות גרעין (nucGFP). התוצאה היא ביטוי קבוע של nucGFP, אשר משמש הסמן הקבע של תאים אלה אשר חוו קספאז פעילות ולהישאר בחיים.

כדי לבדוק את החיישן CaspaseTracker דרוזופילה לגילוי ואפופטוזיס ו anastasis ויוו, CaspaseTracker נקבה זבובים היו נתונים פיזיולוגיים מתח (איור 3C), כגון הקרה לזעזע19, אשר יכול ביעילות מוות של תאים המפעיל, כולל אפופטוזיס כמצוין על-ידי הפעלת קספאז, גרעיני התעבות תא הצטמקות19,78ואני גם נמק עקב מצמרר הגורמת לאובדן הקרומיות ודליפה של cytoplasmic תוכן55,56. כצפוי, CaspaseTracker לא הופעלה על הביצה לשכות שליטה זבובים שבו המוות הקשורות במתח התא לא היה מושרה (דמות תלת-ממד). לעומת זאת, לאהלי ביצה זבובים לחוץ יום לאחר הלם קר הראה לא רק האופייניים מוות תא הצטמקות וגם גרעיני התעבות, אבל RFP ו- GFP ביטוי, המעידים על המצאות של האחרונים או מתמשך (RFP +) ובעבר (GFP +) קספאז פעילות (איור 3E). עם זאת, ב- 3 ימים לאחר שחזר הזבובים לחוץ רגילה למצב שאינו והדגיש, ה-GFP, אבל אין RFP, הביטוי זוהתה בתאי הביצה התאושש (איור 3F). אפשרות זו מציינת כי תאי ביצה זה ביטא קספאז פעילות בעקבות הלחץ הצליחו להתגבר על תהליך מוות של תאים ולשרוד.

לבדוק עוד יותר של הפיכות של תהליך מוות תאי ביצה צ'יימברס19, CaspaseTracker נקבות הזבוב היו הדגיש ברעב חלבון אחרי שמאכילים 8% סוכרוז ב 1% אגר במשך 3 ימים. מחקרים קודמים הראו כי רעב חלבון יכול להפעיל בתיווך קספאז ואפופטוזיס ו autophagy ברקמות עם סומאטית בתאי הנבט, כולל ביצה צ'יימברס57,60,61. כצפוי, CaspaseTracker הופעלה בתאי הביצית לאחר 3 ימים מרעב חלבון (איור 3G). התאים ביצה הגוסס הציג אפופטוטיים להיפגע מורפולוגיות וגם הביטוי RFP ו- GFP ביוסנסור סמנים, המציין האחרונות או מתמשך (RFP +) מעבר (GFP +) פעילות קספאז (איור 3G). כדי להדגים CaspaseTracker באפשרותך לעקוב אחר התאים התאושש שבעבר גרמה קספאז ההפעלה לאחר גירוי מוות, הזבובים מורעבים הועברו ואז אוכל לטוס המכילים חלבון רגיל. כצפוי, לאהלי ביצה התאושש זבובים מחדש הפדרציה האלה חסרי הכתב קספאז ארעי RFP, המציין אין פעילות קספאז האחרונות או מתמשך (איור 3 H). עם זאת, תאי ביצה בזבובים הללו לאחר להקל על הלחץ על ידי החזרתם לאוכל הרגיל מוצג הכתב קספאז GFP (איור 3 H), המציין את התאים בתאי הביצה האלה היה הפוך תהליך מוות של תאים יזומה בשלב לאחר קספאז הפעלה. אימות כי הפעילות ביוסנסור CaspaseTracker המופעלת על-ידי קספאז הושג על-ידי החלפת הרצף פצילות DQVD רצף DQVA, אילו קספאז אין אפשרות לדבוק, אשר לבטל את פעילות ביוסנסור (איור 3B, 3עכשיו ).

לאחר CaspaseTracker דרוזופילה התאושש מרעב חלבון, מצאנו כי מספר סוגים של תאים בתאי הביצה, כגון תאים סומאטית (זקיק) ותאים germline (האחות תאים ו- oocytes), להציג רק GFP, אך לא RFP (דמות 3J )19, המציין כי תאים אלה יכולות לעבור anastasis לאחר קספאז ההפעלה. מעניין, ה-GFP מתויג גם בתאים germarium (איור 3J)19, אשר מכיל תאי גזע, יחד עם שלה תאי ביצה המשויך בשרשרת ovariole אותו. לכן, תאי ביצה האלה GFP-חיובית ייתכן עיטורית מתאי גזע זה יש התאוששה תהליך מוות תאי לאחר הפעלת קספאז. חשוב, הנקבה מורעבים, הפדרציה מחדש הזבובים להטיל ביצים פוריות שיוכל לייצר את הבעת-GFP רומא זבובים19, רומז כי פוטנציאל התאים להפוך תהליך מוות תאי לאחר הפעלת קספאז יכול להחזיר את תפקוד תקין ככל הנראה. מחקרים עתידיים נחוצים כדי לקבוע אם זבובים רומא לשרוד כתוצאה anastasis שיישומים sequelae קבוע.

Figure 1
איור 1 . שחזור של הלה תאים לאחר אינדוקציה מוות התא.
(א) תרשים סכמטי של הגישה כדי לגרום מוות של תאים, לאחר מכן לאפשר למות תאים להתאושש לאחר הסרת משרן מוות תא.
(B) תא חי זמן לשגות DIC מיקרוסקופיה של תאים בריאים של הלה (אני), לאותה הקבוצה של תאים לאחר טיפול עם 1µM staurosporine (ii), ואז לשטוף ואת עוד יותר מודגרות בינונית טרייה תרבות כדי להסיר את staurosporine ( השלישי-vi). חץ לבן מציין תא החלוקה.
(ג) תרשים סכמטי של חלבון כימרי ביוסנסור קספאז נס-DEVD-YFP-NLS, לוקליזציה subcellular של YFP במהלך תא מוות אינדוקציה, לאחר anastasis.
(ד) תא חי זמן לשגות מיקרוסקופיה קונפוקלית של תא אחד של הלה, המבטאת את קספאז ביוסנסור חלבון כימרי נס-DEVD-YFP-NLS לפני (אני), במהלך החשיפה 3.7% אתנול (ii - iii), ואחרי הסרת אתנול המדיום תרבות (iv - viii). המוצגים כאן הם תמונות של קספאז החיישן בלבד (זריחה ירוק, השורה העליונה); מיזוג תמונות של גרעין שהוכתמו Hoechst (זריחה כחול), המיטוכונדריה (פלואורסצנטי אדום) (בשורה האמצעית), תמונות בשורה האמצעית נוסף הממוזג עם תמונות DIC (השורה התחתונה). חיצים לבנים בשורה העליונה מציינים גרעיני YFP לשפות אחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . מערכת ביוסנסור CaspaseTracker יונקים.
(א) תרשים סכמטי של rtTA קספאז רגיש.
(ב) תרשים סכמטי של מערכת ביוסנסור בתרבית של CaspaseTracker rtTA.
(ג) תרשים זרימה של שימוש במערכת ביוסנסור rtTA CaspaseTracker לאתר anastasis. משולש אדום וצהוב (חלים משרן מוות התא), סמלים ירוק/כחול (משרן לשטוף את) הם כמו איור 1A.
(ד) זמן לשגות תא חי מיקרוסקופיה קונפוקלית מקבץ של תאים הלה לבטא את החיישן rtTA בתרבית של CaspaseTracker לפני (אני), במהלך החשיפה 1µM staurosporine (ii - iii), ולאחר הסרת staurosporine של המדיום תרבות (iv - vii). התמונות הממוזגות של אותות DIC ו- DsRed. חיצים מציינים את התא 1 (צהוב), תא 2 (ירוק).
(ה) זמן לשגות תא חי קונפוקלית לבטא ביוסנסור הלה התאים ללא טיפול. התמונות הממוזגות של אותות DIC ו- DsRed. החצים הלבנים לציין תאים החלוקה.
דוקסיציקלין (1ug/mL) נכח במדיום במהלך הניסויים הראו פאנלים (D) ו- (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . דרוזופילה מערכת ביוסנסור כפול CaspaseTracker. (מאומצת עם הרשאה של טאנג ואח ', 2015 דוחות מדעיים, 9:9015 19 ).
(א) תרשים סכמטי של מערכת ביוסנסור דרוזופילה CaspaseTracker Gal4.
(ב) תרשים סכמטי של קספאז רגיש (DQVD) ושליטה קספאז-רגישות (DQVA) Gal4.
(ג) סכמטית דרוזופילה השחלה, ואת זרימה עבור תא המוות-אינדוקציה בזבובים בן יום-1, ואחריו שלושה ימי התאוששות במצב נורמלי. תמונת דרוזופילה המסופקים על ידי דארן Obbard.
(ד) נציג קונאפוקלית דימוי ביצה צ'יימברס מן השחלה של זבוב ביוסנסור נקבה האכלת עם אוכל לטוס רגיל למשך 6 ימים (ללא טיפול).
(ה) נציג תמונה קונאפוקלית של תאי ביצה מן השחלה של זבוב קר בהלם ביוסנסור הנשי הציב ב-7 ° C עבור 1 h והקדמנו ואז למצב נורמלי תרבות ליום 1 (הלם קר, מדעי המחשב).
(ו) כמו פאנל E חוץ הזבובים בהלם קר הוחלפו למצב נורמלי תרבות במשך 3 ימים (משוחזר לאחר CS).
(ז) נציג תמונה קונאפוקלית של הביצה צ'יימברס מן השחלה של ביוסנסור הנשי מורעבים לטוס האכיל עם 8% סוכרוז ב 1% אגר בלי חלבון במשך 3 ימים (Starved).
(ח) כמו לוח G חוץ הזבובים שטופלו הוחלפו כדי לטוס. אוכל רגיל במשך 3 ימים לאחר הטיפול רעב חלבון (האכיל מחדש).
(I) כמו פאנל G אלא מציג הרעב של קספאז ברגיש זבובים ביוסנסור הנשי CaspaseTracker (DQVA), אשר שימשו השליטה שלילי.
(י) נציג תמונה קונאפוקלית של ביצה צ'יימברס מורעבים, הפדרציה מחדש הנשי דרוזופילה. חיצים מציינים GFP גרעיני לבטא האחות תאים (שחור), oocytes (לבן), תאי זקיק (צהוב) של תאי ביצה, וב germarium (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . השלכות פיזיולוגיות, פתולוגי וטיפוליים של anastasis. (מאומצת עם הרשאה של טאנג ואח ', F1000Res 2017, 6:43 21 ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת כפולה ביוסנסור CaspaseTracker הוא הרומן ו כלי ייחודי המאפשר איתור של האחרונים או פעילות קספאז שוטף ומעקב של תאים כי ביצעו היפוך מוות תאי לעבד ולשרוד לאחר שנוכחו קספאז פעילות ויוו. בזמן פעילות קספאז הייתה ההנחה באופן מסורתי כמו סימן היכר של אפופטוזיס, הולך וגדל ומחקרים מגלים זה פעילות קספאז שאינם אפופטוטיים להיפגע ממלא תפקידים פוטנציאליים בפונקציות תאים נורמליים מגוונים, כגון ויסות פעילות. עצבית79, 80, למידה, זיכרון81,82,83,84, דיכוי של necroptotic תא מוות85,86, spermatid האינדיבידואליזציה87, 88,89, התפשטות תא90ותהליכי גורל תכנים91microRNA. בנוסף אפופטוזיס anastasis, מערכת ביוסנסור CaspaseTracker ניתן לכן לזהות פעילות קספאז הלא-מוות, אשר נוכח המוח ואת הראייה האונות cardia, בטן, Malpighian בקוריאנית, קנה הנשימה, השרירים, רקמות אחרות של דרוזופילה19,46,64. האות הזה ביוסנסור יכול לייצג גם את הפעילות הנוכחיים או הקודמים anastatic במהלך התפתחות העובר או הומאוסטזה רגיל ברקמות אלה. ללמוד anastasis לאחר תא ארעי גרימת מוות עקה בבעלי חיים, חשוב לבחור רקמות עם תאים זה מוצג ללא פעילות ביוסנסור קספאז בתנאים פיזיולוגיים רגילים, אבל זה יכול להיגרם לעבור קספאז להפעלה באמצעות אינדוקציה מוות תא ארעית. תאי הביצה אידיאליים למטרה זו, כי יש להם בדרך כלל אין פעילות קספאז מ germarium לשלב 10 במהלך oogenesis58,59,92.

חשיפת הנשי דרוזופילה מושם סביבתיים ארעית, כגון רעב חלבון והלם קר, יכולים ביעילות להפעיל הפעלה קספאז ומוות תא הביצה צ'יימברס19,57,58, 78. שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול כוללים הימנעות ממושכת התא אינדוקציה המוות כדי זבובים. התנאים אופטימיזציה של רעב חלבון (8% סוכרוז ב 1% אגר במשך שלושה ימי) והלם קר (1h ב-7 oC) כדי נקבות הזבוב יכול להפעיל תהליך מוות תא לפעיל על-קספאז בתאי הביצה, ולאפשר להם לשחזר לאחר הזבובים לחוץ מוחזרות למחשב מצב נורמלי19. טיפול ממושך עם גירוי מוות התא. יוכל להפעיל את תאי ביצה יותר לעבור תהליך מוות של תאים, אך קצב התאוששות גם מופחת, יש להניח כי התאים ביצה הגוסס לחוות נזק עצום ללא תקנה.

צעד קריטי נוסף ב פרוטוקול זה היא לצמצם את האות רקע CaspaseTracker בתאי הביצית על ידי חציית, מגדל שמירה על ש-caspasetracker זבובים בטמפרטורה נמוכה יותר, כגון 18 oC. בעוד הרוב המכריע של צ'יימברס ביצה גדלו בצורה אופטימלית זבובים אינם מציגים פעילות קספאז ב germarium דרך שלב 10 במהלך oogenesis58, כ 1% של תאי הביצה יכול להפגין קספאז ביוסנסור פעילות ללא מוות התא אינדוקציה19 . זה עשוי לשקף השחיקה רגילה עקב שגיאות מולדת או עלול להיגרם בשוגג במהלך oogenesis תנאי מעבדה סטנדרטיים. כמו Gal4 מציג פעילות פחות זבובים על טמפרטורה נמוכה93, מגדל הזבובים-18 oC, ולא בטמפרטורת החדר, ניתן להקטין את האות אנדוגני שמפעיל את מערכת CaspaseTracker. לחלופין, מיתוג זבובים לטמפרטורה גבוהה יותר, כגון 29 o. C, יכול להגביר את הרגישות של מערכת CaspaseTracker, בשל כדי להגביר את פעילות Gal493, פוטנציאל אחרים אנדוגני תלוית טמפרטורה אנזימטי פעילויות.

חשוב להבחין בין התאים CaspaseTracker-חיוביות עוברים תהליך מוות תאי או anastasis מתאי כי התערוכה פעילות קספאז הלא-מוות. מוות התאים לבטא RFP (ארעי סמן לפעילות שוטפת או אחרונים קספאז) ואת לעיתים קרובות GFP (קבוע maker לפעילות קספאז קודמים) בטיפול של אפופטוזיס, כמו אלה למות תאים יש פעילות מתמשכת קספאז הזה Gal4 קליב-מופעל, לאחר מכן מפעילה את ארעי (Gal4 תלויי-פעילות RFP) ואת קבוע (Gal4 עורר FLPase-והשפלתם מתווכת GFP) כתבים של מערכת G-מעקב. אפופטוזיס של תאים אלה יכולים להיות מאושרות על ידי המחפשים מורפולוגי וביוכימי כזה ארה ב גרעיני התעבות זוהה על ידי צביעת עם צבעי גרעיני14,19,58, המחשוף קספאז שזוהה על-ידי immunostaining19,94. תאים שעברו כבר anastasis הצג ביטוי GFP קבוע עקב האירוע רקומבינציה בתיווך FLPase של מערכת G-מעקב. תאים אלה מבטאים RFP לא כפי שהם ללא פעילות קספאז מתמשך, וגם אחרים המחפשים אפופטוזיס19. תאים אלה גם להציג מורפולוגיה תקינה גרעינית. תאים יש פוסקת פעילות של קספאז מוות שאינו מוצג לרוב ביטוי RFP והן GFP, וגם יש מורפולוגיה תקינה גרעיני19.

זה יכול להיות קשה להבחין תאים חוו anastasis של תאים אלה שהיו בעבר הלא-מוות קספאז פעילות, כי שניהם להציג רק GFP ואין שום סימן ההיכר של מוות של תאים. לכן, זהיר בקרת ניסויים חייב להיות כלול19. לקבלת דוגמאות, ללמוד anastasis בתאי הביצה, זה חיוני כדי לבדוק ביטוי GFP זבובים הדגיש-התאושש והן שאינם הדגיש זבובים (בקרה שלילית). זבובים התאושש צריך להראות יותר תאים GFP-מביע יותר זבובים unstressed, אם anastasis אירעה לאחר קספאז ההפעלה. חשוב גם לבידול אותות פלואורסצנט CaspaseTracker לא ספציפית אוטומטית-זריחה, כפי שנצפה לציפורן, פיגמנטים וגופים שומן19. אנחנו שנוצר זבובים ביוסנסור בקרה שלילית על ידי מוטציה האתר המחשוף קספאז של החיישן (DQVD) לרצף בלתי-cleavable (DQVA), ובכך טיוח את החיישן שליטה שאינם מגיבים קספאז פעילות19. האות זוהה קספאז רגיש (DQVD), אך לא עם הזבובים ביוסנסור שליטה שלילי (DQVA) היא האות של עניין, המופעלות על-ידי קספאז פעילות, במקום האוטומטית-זריחה.

הנוכחי שלנו דרוזופילה כפול CaspaseTracker ביוסנסור ניתן לזהות תאים עם פעילות קספאז "לאחרונה" על ידי ביטוי של RFP, והתאים עם פעילות קספאז "העבר" על-ידי ביטוי של GFP19. נציין כי RFP אינה מחוון פעילות קספאז "בזמן אמת", כי זה לוקח כמה שעות של זמן התגובה עבור Gal4 לנהוג הביטוי של RFP בתגובה קספאז פעילות. כדי להוסיף פונקציה "בזמן אמת", החיישן CaspaseTracker דרוזופילה יכול להיות משולב עם ביוסנסור iCasper פיתחה לאחרונה52, "בזמן אמת", ביוסנסור "כהה בהיר" ויוו המציג רק אות מרחיקת אדום שלו כאשר הוא ביקע מאת caspases.

מלבד אפופטוזיס, CaspaseTracker עלול גם להיות מופעל במהלך סוגים חלופיים של מוות של תאים כמו תאים באפשרותך לעבור מסלולים מוות התא שלהם במהלך הכרוך במישרין או בעקיפין קספאז ההפעלה, כגון autophagy לאחר 95,רעב96, נמק על ידי קרום פלזמה הנוצרות על-ידי הלם קר קרע19,55,56,78necroptosis staurosporine-induced97, 98. המחקרים שלנו הנוכחי והקודם הפגינו ביולוגיים CaspaseTracker יכול תווית תאים התאוששה אלה תא מוות inductions במבחנה או ויוו17,18,19 , 20 , 21. כפי inductions מוות אלה תא לבד יכול להפעיל בו זמנית מספר מסלולים מוות התא בתאים באותו, ההתאוששות של אלה למות תאים מרמז anastasis הזה הוא תופעה שחזור תא כללי זה יכול להפוך מות תאים שונים תהליכים כולל אפופטוזיס, autophagy, נמק, necroptosis, בנפרד או במקביל.

החיישן CaspaseTracker ויוו יקל על רדיפה של פונקציות לא ידוע עדיין, מנגנונים, השלכות טיפוליות של anastasis (איור 4)21. כדי לחשוף את החתימה מולקולרית של anastasis, ביצענו מחקרים microarray ביטוי הגן הגנום כל הזמן-קורס כדי לנתח את תאי הכבד העיקרי העכבר במהלך היפוך של אתנול-induced אפופטוזיס, מעניין, נמצאו שינויים מרשימים שעתוק של גנים המעורבים במשעולים מרובים כולל פרו-הישרדות, נגד חמצון, DNA נזק התגובה, שינוי היסטון, אנגיוגנזה, נדידת תאים של טרנספורמציה18,21. ממצא זה נתמך על ידי המחקר שלנו אימות על החלמתו של תאים סרטניים אנושיים הכבד HepG2 אפופטוזיס18,21, כמו גם מחקר שנערך לאחרונה RNA-רצף עצמאית של הלה תאים בשחזור של אפופטוזיס99. מעניין, למעלה-רגולציה של כמה גורמים פרו-הישרדות נמצאו בתאים anastatic גם הן נצפו היפוך אי ספיקת לב, התקדמות הגידול ו סרטן הישנות100,101,102, רומז השתתפות פוטנציאלי anastasis. ללמוד את הפוטנציאליות פיזיולוגיים, פתולוגי וטיפוליים של anastasis, חשוב לזהות את התאים anastatic ולעקוב אחר גורלם של חיות קטנות, כמו זה יאפשר מחקרים מכניסטית וטיפוליים. שלנו דרוזופילה ביולוגיים CaspaseTracker יונקים יהיו כלים שימושיים לבדיקה תרומות פוטנציאליות של anastasis להתפתחות התקינה הומאוסטזיס, שחזור רקמות, הגידול האבולוציה, הישנות סרטן, גרורות. מציאת ממחקרים אלה להגדיל את ההבנה שלנו של התפקיד הטבעי של anastasis, ומציעים פוטנציאל לזהות מהפכנית חדשה גישות טיפוליות למחלות סורר דרך מתווכים מוות תאי והישרדות שליטה על anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים דארן Obbard על תמונה דרוזופילה 3C איור כתב היד וידאו; ג'יי מארי הארדוויק, ווייד גיבסון ו הת'ר כבש מסיה לדיון בעל ערך של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי סר אדוארד יואו-דה אנדרטת מלגת (H.L.T.), ד ר וולטר Szeto ממוריאל מלגה (H.L.T.), מלגת פולברייט 007-2009 (H.L.T.), מלגת קרן מחקר מדעי החיים (H.L.T.), NCI K22 הענק CA204458 (H.L.T.). Ho Tang לאם היה Shurl קיי קורצ'י קרן עמית של קרן מחקר מדעי החיים (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

רפואה גיליון 132 Anastasis אפופטוזיס autophagy ביוסנסור קספאז CaspaseTracker נמק necroptosis מות תאים מתוכנת היפוך של אפופטוזיס
גילוי Anastasis <em>In Vivo</em> מאת CaspaseTracker ביוסנסור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter