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Medicine

CaspaseTracker के द्वारा Vivo में Anastasis का पता लगाना

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis को वीवो में डिटेक्ट करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया को उलट देने वाली कोशिकाओं को सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं से आकृति किया जा सकता है । यहाँ हम का पता लगाने और उन कोशिकाओं है कि लाइव जानवरों में anastasis से गुजरना पर नज़र रखने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन हमारे नव विकसित vivo में CaspaseTrackerीय प्रणाली.

Abstract

Anastasis ("जीवन के लिए बढ़ती" के लिए ग्रीक) एक हाल ही में खोज सेल वसूली घटना जिससे मर कोशिकाओं देर हो सकती है चरण कोशिका मृत्यु प्रक्रियाओं है कि आम तौर पर माना जाता है आंतरिक रूप से अपरिवर्तनीय है । anastasis को बढ़ावा देने के सिद्धांत बचाव में सकता है या घायल कोशिकाओं है कि ऐसे cardiomyocytes या न्यूरॉन्स के रूप में प्रतिस्थापित करने के लिए मुश्किल हैं संरक्षित, जिससे ऊतक वसूली की सुविधा. इसके विपरीत, कैंसर की कोशिकाओं में anastasis को दबाने, विरोधी कैंसर के उपचार के बाद apoptosis के दौर से गुजर, कैंसर कोशिका मृत्यु सुनिश्चित करने और पुनरावृत्ति की संभावना को कम कर सकते हैं । हालांकि, इन अध्ययनों से जीवित पशुओं में anastasis से गुजरना कोशिकाओं के भाग्य पर नज़र रखने के लिए उपकरणों की कमी से बाधा गया है । चुनौती कोशिकाओं है कि वसूली के बाद उनके आकृति सामांय उपस्थिति के बावजूद सेल मौत की प्रक्रिया उलट है की पहचान है । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, हमने Drosophila और स्तनधारी CaspaseTracker का विकास किया है जो इन विट्रो या vivoमें anastatic कोशिकाओं को पहचान और स्थाई रूप से ट्रैक कर सकते हैं । यहां, हम इस पीढ़ी और CaspaseTracker दोहरी प्रणाली का उपयोग करने के लिए vivo प्रोटोकॉल में मौजूद का पता लगाने और सेल मौत उत्तेजनाओं के लिए क्षणिक जोखिम के बाद Drosophila melanogaster में anastasis ट्रैक । जबकि पारंपरिक उपसेंसरों और प्रोटोकॉल कोशिकाओं को सक्रिय रूप से अपोप्तोटिक कोशिका मृत्यु के दौर से गुजर लेबल कर सकते हैं, CaspaseTracker को स्थाई रूप से कोशिकाओं है कि caspase सक्रियण के बाद बरामद किया है लेबल कर सकते है-देर चरण apoptosis की एक बानगी, और इसके साथ ही सक्रिय अपोप्तोटिक प्रक्रियाओं की पहचान । यह भी कोशिकाओं है कि कोशिका मृत्यु के अंय रूपों का प्रयास किया है कि प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से caspase गतिविधि शामिल की वसूली को ट्रैक कर सकते है सेंसर । इसलिए, इस प्रोटोकॉल हमें लगातार इन कोशिकाओं और उनकी संतान के भाग्य को ट्रैक करने के लिए सक्षम बनाता है, जैविक कार्यों के भविष्य के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने, आणविक तंत्र, शारीरिक और रोग के परिणाम, और उपचारात्मक निहितार्थ anastasis । हम भी उन है कि vivo मेंगैर अपोप्तोटिक caspase गतिविधि प्रदर्शन से anastasis से गुजरना कोशिकाओं को भेद करने के लिए उचित नियंत्रण पर चर्चा ।

Introduction

क्रमादेशित कोशिका मृत्यु, जैसे apoptosis, कोशिकीय जीवों में अवांछित, घायल, या खतरनाक कोशिकाओं को नष्ट करने के द्वारा भ्रूण विकास और सामान्य homeostasis में एक आवश्यक भूमिका निभाता है,2,3. कोशिका मृत्यु और अस्तित्व के बीच संतुलन की हानि कैंसर, हृदय विफलता, प्रतिरक्षा, और अध4,5,6,7,8के रूप में घातक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । जल्लाद caspases के सक्रियकरण परंपरागत रूप से apoptosis9,10,11में कोई वापसी की "बिंदु के रूप में माना गया है, के रूप में यह तेजी से चलाता है और बड़े पैमाने पर सेलुलर विध्वंस12, 13,14,15,16. इस सामांय हठधर्मिता को चुनौती देते हुए, हम प्रदर्शन किया है कि संस्कृति मर प्राथमिक कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं न केवल caspase सक्रियण के बाद ठीक कर सकते हैं, लेकिन यह भी प्लाज्मा झिल्ली blebbing, सेल सिकुड़ना सहित महत्वपूर्ण कोशिका मौत की पहचान के बाद, mitochondrial विखंडन, cytosol, परमाणु और क्रोमेटिन में mitochondrial cytochrome सी की रिहाई, डीएनए क्षति, परमाणु विखंडन, phosphatidylserine के सेल की सतह जोखिम (पी एस), और अपोप्तोटिक निकायों के गठन 17 , 18 , 19 , 20 , 21. हम प्रस्ताव है कि anastasis एक आंतरिक कोशिका वसूली घटना है, के रूप में मरने कोशिकाओं सेल मौत उत्तेजनाओं17,18,19,20के हटाने के बाद ठीक हो सकता है, 21. हम शब्द "Anastasis" (Αναστάσης)18गढ़ा, जिसका अर्थ है "जीवन के लिए" ग्रीक में बढ़ती है, इस अप्रत्याशित कोशिका वसूली घटना का वर्णन । anastasis के हमारे प्रेक्षण आगे हाल ही में स्वतंत्र अध्ययनों से भी पता चलता है कि phosphatidylserine externalization22,23,24, सीमित mitochondrial बाहरी के बाद कोशिकाओं की वसूली का समर्थन किया है झिल्ली permeabilization25, मिश्रित वंश कळेनासे के सक्रियकरण की तरह (MLKL), और सेल सिकुड़ते26।

निस्र्पक anastasis विनियमन तंत्र है प्रतिमान-स्थानांतरण शारीरिक, रोग, और चिकित्सीय निहितार्थ होगा । Anastasis एक पहले से अज्ञात cytoprotective तंत्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए बचाव या महत्वपूर्ण postmitotic कोशिकाओं और ऊतकों है कि जगह मुश्किल कर रहे है की रक्षा कर सकते हैं, और संभवतः दिल की विफलता उत्क्रमण के लिए खाता छोड़ वेंट्रिकुलर के साथ वेंट्रिकुलर अनलोड द्वारा असिस्ट उपकरणों (LVADs)27,28, अत्यधिक प्रकाश29,30,31, या मस्तिष्क की चोट के बाद न्यूरॉन्स की मरंमत के क्षणिक जोखिम के बाद photoreceptor कोशिकाओं की वसूली३२। यदि ऐसा है तो anastasis को बढ़ावा देने के सेल और ऊतक वसूली में वृद्धि सकता है । इसके विपरीत, anastasis एक अप्रत्याशित बच कैंसर कोशिकाओं द्वारा इस्तेमाल के लिए सेल-मौत उत्प्रेरण थेरेपी जीवित रणनीति, कैंसर पुनरावृत्ति17,18के कारण हो सकता है । इसलिए, कैंसर की कोशिकाओं के दौरान और कैंसर के इलाज के बाद मरने में anastasis दबा एक उपंयास चिकित्सकीय उनके पतन को रोकने के द्वारा कैंसर का इलाज रणनीति हो सकती है ।

anastasis की प्रक्रिया के दौरान, हमने पाया है कि कुछ बरामद कोशिकाओं स्थाई आनुवंशिक परिवर्तन प्राप्त कर लिया और oncogenic परिवर्तन, डीएनए apoptosis के दौरान किए गए नुकसान के कारण की संभावना18,20,21 . डीएनए की मौत की प्रक्रिया के पीछे-क्षतिग्रस्त कोशिकाओं tumorigenesis की एक प्रणाली हो सकता है, संभावित निरीक्षण है कि दोहराया ऊतक चोट ऊतकों की एक किस्म में कैंसर का खतरा बढ़ जाता है अंतर्निहित घेघा में जीर्ण थर्मल चोट के रूप में, बहुत गर्म पेय पदार्थ के उपभोग के द्वारा३३,३४,३५, जिगर३६,३७, genotoxic कैंसर थेरेपी३८के बाद ट्यूमर विकास की वजह से नुकसान, ३९,४०, और सामांय ऊतकों कि विरोधी कैंसर थेरेपी४१,४२,४३,४४ के चक्र के बीच अंतराल के दौरान पैदा से नए कैंसर का विकास . यदि सच है, लक्ष्यीकरण anastasis को रोकने या कैंसर के विकास और प्रगति की गिरफ्तारी सकता है । हमने पाया है कि भुखमरी प्रेरित मर रोगाणु कोशिकाओं को पुनः में anastasis से गुजरना Drosophila19खिलाया ।  यदि anastasis डीएनए क्षति के साथ रोगाणु कोशिकाओं में होता है, यह अवलोकन है कि लंबे समय तक पर्यावरण तनाव आनुवंशिक रोगों के विकास को बढ़ावा देने के लिए खाता हो सकता है । उदाहरण के लिए, अकाल transgenerational वारिस रोगों जैसे मधुमेह और कोरोनरी हृदय रोगों४५के विकास में योगदान करते हैं । इसलिए, anastasis को समझना इस संभावित तंत्र के कारण इनहेरिट करने योग्य बीमारियों के विकास की रोकथाम के लिए रणनीतियों के लिए नेतृत्व कर सकता है ।

anastasis की खोज का दोहन और अभिनव चिकित्सा विकसित करने के लिए निर्देशित करने के लिए, यह जीवित पशुओं में anastasis के कारण और परिणाम का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, यह तकनीकी रूप से vivo मेंanastatic कोशिकाओं की पहचान करने और ट्रैक करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया से बरामद कोशिकाओं को सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं से आकृति प्रकट होता है, और वहाँ anastasis का कोई निशान नहीं है अभी तक17,18,21की पहचान की । इन समस्याओं को हल करने के लिए, हम हाल ही में एक नया विकसित vivo caspase में नामित "CaspaseTracker"19, पहचान करने के लिए और कोशिकाओं है कि जीवित रहने के बाद apoptosis को ट्रैक caspase सक्रियकरण19,४६, apoptosis10,14की बानगी । यह "भू-समय" से अलग caspase जैसे गोबर12,४७, Apoliner४८, CA-GFP४९, ApoAlert18,५०, C3AIs५१ और iCasper५२ caspase गतिविधि पर जा रहा है कि का पता लगाने, CaspaseTracker के साथ ही स्थिर रूप से भी क्षणिक गतिविधि एक्सप्रेस कि कोशिकाओं को स्थायी रूप से लेबल करने की क्षमता सुविधाएँ. इसलिए, CaspaseTracker, vivo मेंcaspase-मध्यस्थ कोशिका मृत्यु प्रक्रिया के उत्क्रमण के बाद anastasis की दीर्घकालिक ट्रैकिंग सक्षम बनाता है ।

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Protocol

1) CaspaseTracker की तैयारी

  1. Anesthetize2के साथ मक्खियों, और एक तूलिका का उपयोग करने के लिए 7 से 10 caspase-संवेदनशील Gal4 (DQVD)19 कुंवारी महिलाओं और 7 से 10 जी ट्रेस५३ Gal4 रिपोर्टर युवा पुरुष मक्खियों (या इसके विपरीत) फ्लाई भोजन और ताजा खमीर पेस्ट के साथ एक ही शीशी में स्थानांतरित ।
    नोट: Caspase-संवेदी (DQVD) Gal4 और जी-ट्रेस मक्खियों के क्रॉस CaspaseTracker संतति मक्खियों का उत्पादन करेंगे । Caspase के पार-संवेदनशीलमें(DQVA)19 Gal4 और जी ट्रेस मक्खियों नकारात्मक नियंत्रण मक्खियों प्रदान करेगा (चर्चा देखें) । ताजा खमीर पेस्ट अंडे के उत्पादन को बढ़ाने के लिए प्रोटीन स्रोत के रूप में कार्य करता है, ताकि संतान की संख्या बढ़ जाती है । चुनें वर्जिन महिलाओं और युवा पुरुष मक्खियों उनके phenotypes५४के अनुसार ।
  2. 3 से 7 दिनों के लिए क्रॉस के दौरान 18 डिग्री सेल्सियस (ओसी) में मक्खियों की मशीन, और फिर 18 डिग्री सेल्सियस पर एक नया पार स्थापित करने के लिए एक नई शीशी के लिए मक्खियों हस्तांतरण । 18 डिग्री सेल्सियस पर मूल शीशी के लिए जारी रखें जब तक संतान मक्खियों eclose ।
    नोट: मूल शीशी में संततियों की भीड़ से बचने के लिए पैरेंट मक्खियों को नई शीशियों में स्थानांतरित करें. माता पिता मक्खियों पहले 2 से 3 स्विच पर ताजा भोजन और खमीर पेस्ट के साथ संतान का उत्पादन कर सकते हैं, और फिर उत्पादकता काफी समय के साथ कम हो जाएगा । ऊपर मक्खियों 18 डिग्री सेल्सियस CaspaseTracker (चर्चा देखें) के गैर विशिष्ट संकेत को कम कर सकते हैं ।
  3. निम्नलिखित प्रयोगों के लिए सही phenotypes५४ के साथ संतति मक्खियों का चयन करें ।
    नोट: दोनों caspase के transgenes-संवेदी Gal4 और जी-स्ट्रेस के यहाँ दूसरे गुणसूत्र स्थित हैं, CyO बालन के साथ संतुलित. गैर-घुंघराले दक्षिणपंथी संतति (बिना CyO) का चयन करें, जिसमें caspase-संवेदी Gal4 और जी-स्ट्रेस दोनों की transgenes है.

2) CaspaseTracker के लिए क्षणिक कोशिका मृत्यु प्रेरण के आवेदन

  1. 10 से 20 नव eclosed के लिए स्थानांतरण 18 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए ताजा मक्खी खाद्य और ताजा खमीर पेस्ट के साथ एक नई शीशी के लिए मक्खियों oogenesis द्वारा अंडा चैंबर उत्पादन की अनुमति है ।
    नोट: पुरुष मक्खियों के साथ महिला रखते हुए अंडा चैंबर उत्पादन में वृद्धि हो सकती है ।
  2. ठंड सदमे से apoptosis से गुजरना करने के लिए अंडा चैंबर प्रेरित करने के लिए, 1 ज के लिए-7 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, जो नई खाली शीशी, के लिए मादा मक्खियों हस्तांतरण ।
    नोट: ठंड सदमे प्लाज्मा झिल्ली टूटना५५,५६उत्प्रेरण द्वारा कोशिकाओं को घायल कर ।
  3. अंडे कक्षों को प्रेरित करने के लिए प्रोटीन भुखमरी से apoptosis से गुजरना, 8% सुक्रोज के साथ एक नई शीशी के लिए मादा मक्खियों हस्तांतरण और 1% 3 दिनों के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर खाना आगर ।
    नोट: प्रोटीन भुखमरी (गैर प्रोटीन भोजन) अंडा कक्षों को ट्रिगर कर सकते है apoptosis५७,५८,५९ और autophagy६०,६१से गुजरना । स्विच के साथ एक नई शीशी के लिए मक्खियों 8% सुक्रोज और 1% आगर भोजन हर दिन सुक्रोज मक्खी भोजन की इष्टतम स्थिति रखने के लिए.
  4. स्थानांतरण जोर से मक्खियों के लिए ताजा मक्खी भोजन और ताजा खमीर पेस्ट के साथ एक नई शीशी के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए उंहें ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं । टुकड़े भूखे और भूखे-बरामद मक्खियों को अंडाशय में अंडा मंडलों को प्राप्त करने के लिए वर्णित के रूप में६२।
    नोट: अंडाशय प्राप्त करने के लिए टुकड़े Drosophila करने के लिए, anesthetize2के साथ मक्खियों, और मक्खी सिर को हटाने के लिए संदंश के 2 जोड़े का उपयोग करें, और मक्खियों के अंडाशय को दूर करने के लिए पेट के आधार खींचने के लिए संदंश का उपयोग करें ।

3) निर्धारण और इमेजिंग के लिए विच्छेदित अंडा मंडलों के धुंधला

  1. चारों ओर ०.५ मिलीलीटर फॉस्फेट के साथ एक साथ विच्छेदित अंडा मंडलों स्थानांतरण 1 एमएल केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए खारा (पंजाब) बफर । अंडे बसने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: कोट 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) पानी या पंजाब में भंग के साथ प्लास्टिक पिपेट सुझावों के लिए अंडे कक्षों को रोकने के लिए सुझावों की प्लास्टिक की सतह पर चिपके रहते हैं । लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के photobleaching से बचने के लिए अंधेरे में निंनलिखित प्रक्रियाओं प्रदर्शन (आरएफपी, भी DsRed के रूप में जाना) और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) अंडा मंडलों में ।
  2. pipetting द्वारा पंजाबियों को हटा दें, और फिर 20 से 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर अंडा मंडलों को ठीक करने के लिए पंजाब में ०.५ मिलीलीटर 4% paraformaldehyde लागू होते हैं ।
    नोट: इस और निंनलिखित गर्मी चरणों में कोमल रोटेशन लागू होते हैं ।
  3. pipetting द्वारा paraformaldehyde निकालें, और फिर 3 बार के लिए ०.५ मिलीलीटर PBST (पंजाब + ०.१% ट्राइटन एक्स-१००) के साथ अंडा चैंबर धोया ।
    नोट: लंबे समय तक निर्धारण आरएफपी और GFP संकेतों को कम कर सकता है ।
  4. कमरे के तापमान पर 1 से 2 ज के लिए PBST के साथ अंडा मंडलों की मशीन या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रोटेशन के साथ अंडा मंडलों permeabilize ।
    नोट: PBST भी अंडा मंडलों से बचने के लिए गैर BSA लेपित प्लास्टिक की सतह के लिए छड़ी कर सकते हैं ।
  5. pipetting द्वारा PBST निकालें, और फिर 1 से 2 घंटे के लिए PBST में नीले परमाणु Hoechst डाई के 10 μg/एमएल के ०.५ मिलीलीटर के कमरे के तापमान पर करने के लिए नाभिक के लिए दाग लागू होते हैं ।
    NOTE1: परमाणु डाई के साथ लंबे समय तक गर्मी से बचें के रूप में यह गैर विशिष्ट संकेत वृद्धि होगी ।
    NOTE2: वैकल्पिक Hoechst के बिना नाभिक दाग के लिए दृष्टिकोण २०० μL एंटी ब्लीचिंग DAPI के साथ बढ़ते एजेंट जोड़ने के लिए है (सामग्री देखें) और रात भर६३मशीन, ग्लास कवर पर्ची पर ऊतकों को बढ़ते पहले के रूप में ३.८ प्रोटोकॉल पर वर्णित है ।
    NOTE3: धुंधला और अंधेरे में निंनलिखित प्रक्रियाओं को photobleaching से बचने के प्रदर्शन ।
  6. pipetting द्वारा परमाणु डाई निकालें, और फिर ०.५ मिलीलीटर PBST 1 एमएल केंद्रापसारक ट्यूबों में 3 बार के लिए अंडा मंडलों धोने के लिए लागू होते हैं, 10 से 20 प्रत्येक धुलाई कदम के बीच कोमल रोटेशन के साथ मिनट की मशीन के साथ ।
  7. ठीक पिपेट के साथ सभी PBST निकालें, और फिर लागू २०० μL एंटी ब्लीचिंग बढ़ते एजेंट (सामग्री देखें) के लिए कमरे के तापमान पर 3 ज या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में अंडे कक्षों गर्मी तक अंडे मंडलों ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक ।
    नोट: ऊतकों कि पूरी तरह से ट्यूब के नीचे करने के लिए बढ़ते एजेंट सिंक अवशोषित कर लेता है ।
  8. pipetting द्वारा इमेजिंग के लिए एक पूर्व साफ गिलास स्लाइड पर २०० μL विरोधी ब्लीचिंग बढ़ते एजेंट के साथ उन्हें स्थानांतरित करके सना हुआ अंडा मंडलों माउंट, एक 20 x 20 मिमी पूर्व साफ गिलास कवर पर्ची के साथ अंडा कक्षों को कवर, और ग्लास स्लाइड पर डाल द्वारा कवर स्लिप सील कवर स्लिप के किनारे पर नेल पॉलिश लगाएं ।
    NOTE1: पहले गिलास स्लाइड साफ और पानी या ७०% इथेनॉल के साथ कवर पर्ची ।
    NOTE2: कांच स्लाइड के बीच पेट्रोलियम जेली लागू करें और संपीड़न द्वारा अंडा मंडलों को नष्ट करने से बचने के लिए कवर स्लिप ।
  9. छवि अंडा कक्षों प्रतिदीप्ति या फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, एक 20x, NA ०.८ योजना-Apochromat उद्देश्य के साथ, परमाणु धुंधला (उत्सर्जन ~ ४६१ एनएम का पता लगाने के लिए ४०५ एनएम), ५६१ एनएम आरएफपी के लिए (चल रहे या हाल ही में caspase गतिविधि) संकेत का उपयोग ( GFP के लिए उत्सर्जन ~ ५९० एनएम), और ४८८ एनएम का पता लगाने (पिछले caspase गतिविधि) संकेत (उत्सर्जन ~ 518nm का पता लगाने) ।
    नोट: माइक्रोस्कोपी20,६४के लिए हमारे प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें ।

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Representative Results

समय चूक लाइव सेल माइक्रोस्कोपी संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में anastasis पथ करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है20, यह पहचान करने के लिए जो कोशिकाओं पशुओं में anastasis आया है चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि बरामद कोशिकाओं को प्रकट आकृति है सामांय स्वस्थ कोशिकाओं है कि कोशिका मृत्यु का प्रयास नहीं किया है से । उदाहरण के लिए, मानव गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर हेला कोशिकाओं apoptosis1,2,14, जैसे कोशिका संकोचन, परमाणु संघनित्र, और प्लाज्मा झिल्ली blebbing के रूपात्मक बानगी सेल मौत के जवाब में प्रदर्शन 1 µ m staurosporine17 (आंकड़ा 1a, आंकड़ा 1b i-ii) की उत्तेजना । सेल मौत उत्तेजना और ताजा माध्यम में गर्मी को दूर करने के बाद, मरने कोशिकाओं anastasis17,18द्वारा सेल मौत की प्रक्रिया रिवर्स, के रूप में रूपात्मक वसूली द्वारा संकेत (आंकड़ा 1b iii-iv), प्रसार (चित्रा 1b v-vi) के बाद । हमारे पिछले अध्ययनों का भी इस्तेमाल किया है "वास्तविक समय" caspase ApoAlert (NES-DEVD-YFP-एनएलएस) के रूप में, इस तरह के apoptosis के उत्क्रमण का प्रदर्शन करने के लिए "के रूप में प्रयोग किया जाता है" (18, 1,20। इस cytosol स्वस्थ कोशिकाओं में (चित्रा 1C, 1 डी मैं) के लिए स्थानीयकरण । पर caspase सक्रियण सेल मौत उत्तेजना ३.७% इथेनॉल से शुरू हो, इस YFP आधारित है, जो caspases और नाभिक के translocated, जहां यह जमा और उसके प्रतिदीप्ति टैग के परिणामस्वरूप परमाणु YFP से सट के साथ कोशिकाओं की पहचान करता है पर जा रहा caspase गतिविधि (चित्रा 1C, 1 डी द्वितीय-iii) । मर कोशिकाओं को भी इथेनॉल के दौरान apoptosis के रूपात्मक बानगी प्रदर्शित-प्रेरण1,14,18,20, ऐसे ट्यूबलर mitochondria के विखंडन के रूप में, परमाणु संघनित्र, कोशिका सिकुड़न, और प्लाज्मा झिल्ली blebbing (चित्रा 1 डी द्वितीय-iii) । दिलचस्प है, कोशिका मौत उत्तेजना को हटाने के बाद, एक ही कोशिकाओं को ठीक कर सकते हैं, और सामान्य आकृति विज्ञान हासिल (चित्रा 1 डी चतुर्थ-viii). विशेष रूप से, परमाणु प्रतिदीप्ति (सट ApoAlert) के बरामद कोशिकाओं में 1 घंटे के भीतर चला गया है (चित्रा 1 डी चतुर्थ-viii), संभवतः इसी तरह की प्रक्रियाओं है कि anastatic कोशिकाओं में क्षतिग्रस्त घटकों को खत्म करने के कारण18 , जैसे सट caspase-3, प्प, और ICAD के दौरान उत्पन्न apoptosis. इसलिए, एक नई रणनीति एक लंबे समय सीमा से अधिक anastasis ट्रैकिंग के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से vivo में।

anastatic कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए, हम स्तनधारी CaspaseTracker, जो स्थाई रूप से कोशिकाओं जल्लाद caspase गतिविधि से सट जाने के बाद लेबल का विकास किया । यह एक caspase संवेदनशील rtTA (रिवर्स टेट्रासाइक्लिन-नियंत्रित transactivator) से बना है, और Cre गतिविधि के लिए LoxP-rtTA-आधारित रिपोर्टर (चित्र 2a-B) । कोई caspase गतिविधि के साथ स्वस्थ कोशिकाओं में, transactivator rtTA६५ प्लाज्मा झिल्ली लंगर के लिए सीमित है (लयन11)६६,६७, नाभिक अपवर्जन संकेत (NES) के मानचित्र कळेनासे कळेनासे (MAPKK)६८, और एस्ट्रोजन रिसेप्टर संस्करण (ईआरटी 2) caspase के माध्यम से६९ -सट (DEVD)७० प्प (चित्रा 2a, 2 बी) से व्युत्पन्न लिंकर्स. के रूप में सीमित rtTA नाभिक को cytosol से translocate नहीं कर सकते, यह rtTA रिपोर्टर सक्रिय नहीं कर सकते । हालांकि, सक्रियण पर एक कोशिका मौत उत्तेजना के जवाब में, caspases DEVD लिंकर्स सट, rtTA को translocate करने के लिए नाभिक को मुक्त (आंकड़ा b) । एक बार नाभिक में, rtTA tet प्रतिक्रिया तत्व (TRE) को बांधता है और Cre recombinase, जो एक अपरिवर्तनीय पुनर्संयोजन घटना है कि सीएजी प्रमोटर और कोडिंग के लिए दृश्यों के बीच बंद codon कैसेट को हटा की ओर जाता है की परिवर्तनीय अभिव्यक्ति चलाता है लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed) । DsRed की स्थाई अभिव्यक्ति में यह परिणाम (चित्रा 2 बी), जो उन कोशिकाओं के स्थाई फ्लोरोसेंट मार्कर के रूप में कार्य करता है कि जीवित रह सकते है के बाद वे caspase गतिविधि का अनुभव किया है, साथ ही साथ अपनी संतान (चित्रा 2c) ।

स्तनधारी CaspaseTracker का परीक्षण करने के लिए, हम यह क्षणिक अभिकर्मक द्वारा हेला कोशिकाओं में पेश किया, एक कोशिका मौत उत्तेजना (1 µ एम staurosporine) के साथ कोशिकाओं का इलाज, और समय चूक रहते सेल फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की निगरानी वसूली के रूप में हम है 20बताई । Doxycycline (1 µ जी/एमएल अंतिम एकाग्रता), जो rtTA गतिविधि की अनुमति आवश्यक है६५,७१, सेल संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था प्रयोग भर में सेंसर पर बारी । कोशिका मृत्यु उत्तेजना के जवाब में, इलाज कोशिकाओं apoptosis की पहचान, कोशिका सिकुड़न और प्लाज्मा झिल्ली blebbing सहित के प्रदर्शन की उंमीद के रूप में (चित्रा 2d मैं-iii) । कोशिका मृत्यु उत्तेजना को हटाने के बाद, एक बार सेल परत धोने, और ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ने, anastasis मर कोशिकाओं में देखा जा सकता है, के रूप में एक सामान्य आकृति विज्ञान (चित्रा 2d iv-vii) के लिए उनकी वापसी के द्वारा संकेत दिया । निदान, केवल बरामद कोशिकाओं के दौरान और anastasis (चित्रा 2d iv-vii) के बाद DsRed फ्लोरोसेंट मार्कर एक्सप्रेस, उंहें दोनों गैर से अलग-बरामद कोशिकाओं (चित्रा 2 डी iv-vii), और नियंत्रण कोशिकाओं कोशिका मृत्यु उत्तेजना को उजागर नहीं (चित्रा 2E) । यह अनुप्रयोग और स्तनधारी CaspaseTracker के उपयोगिता की पहचान करने और स्थाई रूप से anastatic caspase से उबरने कोशिकाओं-सक्रियण लेबलिंग के लिए एक उपंयास नए उपकरण के रूप में दर्शाता है, और एक तरह से ट्रैक और उनके दीर्घकालिक भाग्य का अध्ययन प्रदान करता है ।

जीवित पशुओं में anastasis का पता लगाने और ट्रैक करने के लिए, CaspaseTracker ट्रांसजेनिक पशुओं की आवश्यकता होती है । इसलिए, हम पहले एक मॉडल प्रणाली19के रूप में Drosophila melanogaster इस्तेमाल किया, क्योंकि यह पशु विकास और मानव रोगों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण आनुवंशिक रूप से असभ्य जीव है७२,७३,७४ ,७५. के रूप में स्तनधारी CaspaseTracker से संशोधित, Drosophila दोहरे सेंसर की पहचान और भेद कर सकते है "हाल ही में/" से "पिछले" caspase गतिविधि । इस दोहरे सेंसर से बना है एक caspase-संवेदी Gal419, और Gal4 रिपोर्टर जी स्ट्रेस५३ (आंकड़ा 3ए). कोई caspase गतिविधि के साथ कोशिकाओं में, खमीर प्रतिलेखन कारक Gal4 एक caspase के माध्यम से एक प्लाज्मा झिल्ली लंगर (mCD8) डोमेन के लिए सीमित है (DQVD) DIAP1 से व्युत्पंन (चित्र बी), एक 21NN/GV22 उत्परिवर्तन होने क्षरण को रोकने के लिए एन द्वारा Gal4 की caspase के दरार पर अंत शासन afterAsp20७६, और एक D135R उत्परिवर्तन drICE डोमेन में caspase निरोधात्मक समारोह को समाप्त करने के लिए७७। के रूप में सीमित Gal4 नाभिक के लिए caspase द्वारा दरार के बिना translocate नहीं कर सकते इसे जारी करने के लिए, Gal4 रिपोर्टर जी ट्रेस कोई caspase गतिविधि19होने कोशिकाओं में निष्क्रिय रहता है । caspase सक्रियण पर, तथापि, सक्रिय caspases DQVD linker सट, नाभिक में translocate को मुक्त Gal4 के लिए जी-ट्रेस रिपोर्टर (चित्र 3ए)19सक्रिय । Gal4 यूएएस (Gal4) गतिविधि बंद हो जाता है और फिर caspase प्रोटीन है जब तक हाल ही में या वर्तमान caspase गतिविधि का एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में कार्य करता है जो क्षणिक प्रतिलेखन और आरएफपी, की अभिव्यक्ति को ट्रिगर करने के लिए विशिष्ट ऊपर के लिए बाइंड कर देता है, और तब तक नीचा. Gal4 भी transgene से FLP recombinase की अभिव्यक्ति चलाता है, एक पुनर्संयोजन घटना है कि एक codon (यूबीआई) प्रमोटर और नाभिक के लिए एक कोडिंग अनुक्रम-लक्षित ubiquitin (GFP) के बीच रोक nucGFP कैसेट को हटा करने के लिए अग्रणी । nucGFP की स्थाई अभिव्यक्ति में यह परिणाम है, जो उन कोशिकाओं है कि caspase गतिविधि का अनुभव किया है और जीवित रहने के स्थाई मार्कर के रूप में कार्य करता है ।

vivo मेंapoptosis और anastasis का पता लगाने के लिए Drosophila CaspaseTrackerer सेंसर का परीक्षण करने के लिए, CaspaseTracker मादा मक्खियों शारीरिक तनाव के अधीन थे (आंकड़ा 3सी), जैसे शीत सदमे19, जो कुशलता से कर सकते हैं ट्रिगर कोशिका मृत्यु, apoptosis सहित caspase सक्रियण, परमाणु संघनित्र और कोशिका सिकुड़न19,७८द्वारा संकेत के रूप में, और यह भी द्रुतशीतन कि झिल्ली अखंडता और cytoplasmic के रिसाव का कारण बनता है के कारण परिगलन सामग्री५५,५६। जैसा कि उंमीद थी, CaspaseTracker नियंत्रण मक्खियों के अंडे मंडलों में सक्रिय नहीं था जहां तनाव से संबंधित कोशिका मृत्यु प्रेरित (चित्रा 3 डी) नहीं था । इसके विपरीत, ठंडे सदमे के बाद एक दिन पर बल दिया मक्खियों के अंडे चैम्बर न केवल विशिष्ट अपोप्तोटिक कोशिका संकोचन और परमाणु संघनित्र दिखाया, लेकिन यह भी आरएफपी और GFP अभिव्यक्ति, हाल ही में या पर जाने की उपस्थिति का संकेत है (आरएफपी +) और अतीत (GFP +) caspase गतिविधि (चित्र 3E) । हालांकि, 3 दिन पर बल दिया मक्खियों लौटने के बाद सामांय गैर करने के लिए तनाव हालत, GFP, लेकिन कोई आरएफपी, अभिव्यक्ति बरामद अंडे मंडलों (चित्रा 3F) में पता चला था । यह इंगित करता है कि अंडा मंडलों कि caspase गतिविधि व्यक्त किया था निंनलिखित तनाव के लिए सेल मौत की प्रक्रिया पर काबू पाने और जीवित कर रहे थे ।

आगे अंडा मंडलों में सेल मौत की प्रक्रिया के reversibility परीक्षण के लिए19, CaspaseTracker मादा मक्खियों के बाद प्रोटीन भुखमरी से बल दिया गया 1% में 8% सुक्रोज खिलाया जा रहा 3 दिनों के लिए । पिछले अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि प्रोटीन भुखमरी caspase मध्यस्थता apoptosis और शारीरिक और रोगाणु कोशिकाओं के साथ ऊतकों में autophagy, अंडा चैंबर्स५७,६०,६१सहित ट्रिगर कर सकते हैं । जैसा कि उंमीद थी, CaspaseTracker अंडे कक्षों में प्रोटीन भुखमरी (चित्रा 3 जी) के 3 दिनों के बाद सक्रिय किया गया था । मर अंडा मंडलों दोनों अपोप्तोटिक morphologies और आरएफपी और GFP की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन सेंसर मार्करों, का संकेत हाल ही में या पर जा (आरएफपी +) और अतीत (GFP +) caspase गतिविधि (चित्रा 3 जी) । कि CaspaseTracker बरामद कोशिकाओं है कि पहले एक मौत उत्तेजना के बाद caspase सक्रियण अनुभवी ट्रैक कर सकते है प्रदर्शित करने के लिए, भूखे मक्खियों तो सामांय प्रोटीन युक्त मक्खी भोजन को हस्तांतरित किया गया । के रूप में की उंमीद है, इन पुनः फेड मक्खियों के बरामद अंडे कक्षों आरएफपी क्षणिक caspase रिपोर्टर की कमी है, कोई हाल ही में या चल रहे caspase गतिविधि का संकेत (चित्रा 3H) । हालांकि, इन मक्खियों में अंडा कक्षों सामांय भोजन के लिए उंहें लौटने से तनाव से राहत के बाद GFP caspase रिपोर्टर (चित्रा 3H) प्रदर्शित, यह दर्शाता है कि इन अंडा मंडलों में कोशिकाओं को एक बिंदु पर शुरू सेल मौत की प्रक्रिया उलट था के बाद caspase सक्रियण । सत्यापन कि CaspaseTracker caspase द्वारा ट्रिगर किया गया है DQVA के अनुक्रम के साथ क्लीवेज अनुक्रम DQVD की जगह द्वारा प्राप्त की गई थी, जो caspase से सट करने में असमर्थ है और जो कि (चित्र बी. के., टैक्टिकल ).

CaspaseTracker Drosophila प्रोटीन भुखमरी से बरामद करने के बाद, हमने पाया है कि अंडा कक्षों में कोशिका के कई प्रकार, दैहिक (कूप) कोशिकाओं और germline कोशिकाओं (नर्स कोशिकाओं और अंडाणुओं) के रूप में, केवल GFP प्रदर्शित किया, लेकिन नहीं आरएफपी (चित्रा 3J )19, यह इंगित करता है कि इन कोशिकाओं caspase सक्रियण के बाद anastasis से गुजरना कर सकते हैं । दिलचस्प है, GFP भी germarium में कोशिकाओं लेबल (चित्रा 3J)19, जो स्टेम सेल में शामिल है, एक ही ovariole श्रृंखला में अपने संबद्ध अंडा मंडलों के साथ । इसलिए, इन GFP-सकारात्मक अंडा कक्षों स्टेम कोशिकाओं है कि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया से caspase सक्रियण के बाद बरामद किया गया है से प्राप्त किया गया है हो सकता है । महत्वपूर्ण बात, भूखे और फिर से खिलाया मादा मक्खियों उपजाऊ अंडे कि GFP-व्यक्त संतान का उत्पादन कर सकते है रखना19मक्खियों, सुझाव है कि संभावित कोशिकाओं caspase सक्रियण के बाद कोशिका मृत्यु प्रक्रिया उलट जाहिरा तौर पर सामांय समारोह हासिल कर सकते हैं । भविष्य के अध्ययनों से अगर संतति मक्खियों कि anastasis प्रदर्शन स्थाई sequelae का एक परिणाम के रूप में जीवित निर्धारित करने की जरूरत है ।

Figure 1
चित्र 1 . कोशिका मृत्यु प्रेरण के बाद हेला कोशिकाओं की वसूली.
(एक) दृष्टिकोण के योजनाबद्ध आरेख कोशिका मृत्यु को प्रेरित और बाद में कोशिका मौत उत्प्रेरण के हटाने के बाद ठीक करने के लिए मर कोशिकाओं की अनुमति ।
(ख) समय चूक स्वस्थ हेला कोशिकाओं (मैं), 1 µ एम staurosporine (द्वितीय) के साथ इलाज के बाद कोशिकाओं का एक ही समूह के रहते सेल उद्योग माइक्रोस्कोपी, और फिर धोया और आगे ताजा संस्कृति माध्यम से मशीन को हटाने के लिए staurosporine ( iii-vi) । सफ़ेद तीर किसी विभाजित कक्ष को इंगित करता है ।
(ग) caspase के योजनाबद्ध आरेख-संवेदी फ्यूजन प्रोटीन NES-DEVD-YFP-एनएलएस, और कोशिका मृत्यु प्रेरण के दौरान YFP के उपसेलुलर स्थानीयकरण और anastasis के बाद.
(घ) समय-चूक लाइव सेल के फोकल माइक्रोस्कोपी एक हेला caspase के लिए (मैं) से पहले (मैं), ३.७% इथेनॉल (द्वितीय - iii) के लिए जोखिम के दौरान, DEVD-YFP-एनएलएस, और उसके बाद संस्कृति माध्यम (iv - viii) से इथेनॉल हटाना । यहां दिखाया गया है caspase केवल (ग्रीन प्रतिदीप्ति, शीर्ष पंक्ति) सेंसर की छवियां; Hoechst-सना हुआ नाभिक (नीले प्रतिदीप्ति) और mitochondria (लाल प्रतिदीप्ति) (मध्य पंक्ति) के विलय छवियों, और मध्य पंक्ति में छवियों को आगे के साथ केंद्र की छवियों (नीचे पंक्ति) विलय कर दिए । शीर्ष पंक्ति में सफ़ेद तीर नाभिकीय स्थानीयकृत YFP इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . स्तनधारी CaspaseTracker । ।
(A) caspase-संवेदी rtTA की योजनाबद्ध आरेख ।
(ख) स्तनधारी CaspaseTracker rtTA की योजनाबद्ध आरेखक-संवेदी प्रणाली.
(ग) anastasis का पता लगाने के लिए CaspaseTracker rtTA के उपयोग का फ़्लोचार्ट सिस्टम । लाल/पीला त्रिभुज (सेल मौत उत्प्रेरण लागू) और हरे/नीले (धो उत्प्रेरण बंद) प्रतीक के रूप में चित्र 1aमें हैं ।
(डी) समय चूक लाइव सेल हेला कोशिकाओं के एक क्लस्टर स्तनधारी CaspaseTracker rtTA पहले (मैं), और प्रदर्शन के दौरान 1 µ एम staurosporine (द्वितीय - iii) के दौरान, और हटाने के बाद के लिए व्यक्त की एक समूह के फोकल माइक्रोस्कोपी कल्चरल मीडियम (iv - vii) से staurosporine । उद्योग और DsRed संकेतों के विलय छवियों । तीर सेल 1 (पीला) और सेल 2 (हरा) से संकेत मिलता है ।
(ङ) समय चूक अनुपचारित untreats-संवेदी हेला कोशिकाओं के रहने सेल फोकल माइक्रोस्कोपी । उद्योग और DsRed संकेतों के विलय छवियों । सफ़ेद तीर कक्षों को विभाजित करने का संकेत देते हैं ।
Doxycycline (1ug/एमएल) पैनलों में दर्शाए गए प्रयोगों के दौरान मध्यम में मौजूद थे (D) और (E)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . Drosophila CaspaseTracker दोहरी सेंसर प्रणाली । (तांग एट अल से अनुमति के साथ अपनाया., वैज्ञानिक रिपोर्ट २०१५, 9: 9015 19 ).
(क) Drosophila CaspaseTracker Gal4 की योजनाबद्ध आरेखक संवेदी प्रणाली.
(ख) caspase-संवेदी (DQVD) के योजनाबद्ध आरेख और caspase-असंवेदनशील नियंत्रण (DQVA) Gal4.
(ग) Drosophila अंडाशय के योजनाबद्ध, और सेल मौत के लिए फ़्लोचार्ट 1 में प्रेरण-दिन पुरानी मक्खियों, 3 द्वारा सामान्य स्थिति में दिन वसूली के बाद. Drosophila डैरेन Obbard द्वारा प्रदान की छवि ।
(घ) एक महिला के लिए सामांय मक्खी भोजन से तंग आ गया के अंडाशय से अंडा चैंबरों के प्रतिनिधि फोकल छवि के लिए 6 दिन (अनुपचारित) ।
(ङ) एक ठंड सदमे में महिला के अंडाशय से अंडा मंडलों के प्रतिनिधि फोकल छवि-7 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस पर रखा और फिर 1 दिन (शीत सदमे, सीएस) के लिए सामांय संस्कृति की स्थिति के लिए बंद ।
(च) की तरह पैनल ई ठंड हैरान मक्खियों को छोड़कर 3 दिनों के लिए सामांय संस्कृति हालत में बदल रहे थे (सीएस के बाद बरामद) ।
(छ) एक भूखे महिला के अंडाशय से अंडा मंडलों के प्रतिनिधि फोकल छवि 3 दिनों के लिए प्रोटीन के बिना 1% आगर में 8% सुक्रोज के साथ खिलाया मक्खी (भूखे) ।
(H) जैसे पैनल जी को छोड़कर इलाज मक्खियों के लिए 3 दिनों के लिए सामांय मक्खी भोजन के लिए बंद कर दिया गया प्रोटीन भुखमरी उपचार (फिर से खिलाया) ।
(I) पैनल जी की तरह संवेदनशील CaspaseTracker मेंcaspase के भुखमरी को दिखाने के अलावा (DQVA) महिला को सेंसर मक्खियों, जो नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया.
(जंमू) एक भूखे और फिर से खिलाया महिला Drosophilaसे अंडा चैंबरों के प्रतिनिधि फोकल छवि । तीर नर्स कोशिकाओं (काला), अंडाणुओं (सफेद) और अंडा मंडलों के कूप कोशिकाओं (पीला), और germarium (हरा) में परमाणु GFP व्यक्त करने का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . anastasis के शारीरिक, रोग और चिकित्सीय निहितार्थ । (तांग एट अल से अनुमति के साथ अपनाया., F1000Res २०१७, 6: 43 21 ). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

CaspaseTracker दोहरी सेंसर प्रणाली एक उपंयास और अनूठा उपकरण है कि हाल ही में या चल रहे caspase गतिविधि का पता लगाने की अनुमति देता है, और कोशिकाओं है कि सेल मौत की प्रक्रिया उलट है और vivo मेंcaspase गतिविधि का अनुभव करने के बाद जीवित रहने की ट्रैकिंग । जबकि caspase गतिविधि परंपरागत रूप से apoptosis की एक बानगी के रूप में ग्रहण किया गया है, बढ़ते अध्ययनों से पता चलता है कि गैर-अपोप्तोटिक caspase गतिविधि विविध सामांय कोशिका कार्यों में संभावित भूमिका निभाता है, जैसे कि ंयूरॉंस की गतिविधि का विनियमन७९, ८०, लर्निंग एण्ड मेमोरी८१,८२,८३,८४, दमन ऑफ necroptotic सेल ृ८५,८६, spermatid वैयक्तिकरण८७, ८८, microRNA प्रोसेसिंग८९, सेल प्रसार९०, और सेल भाग्य patterning९१। apoptosis और anastasis के अलावा, CaspaseTracker-संवेदी प्रणाली इसलिए गैर-अपोप्तोटिक caspase गतिविधि का पता लगा सकती है, जो मस्तिष्क और ऑप्टिक पालियों, cardia, आंत, Malpighian नलिकाओं, श्वासनली, मांसपेशियों, और अन्य ऊतकों में मौजूद है । Drosophila19,४६,६४. यह संवेदी संकेत भी भ्रूण विकास या इन ऊतकों में सामांय homeostasis के दौरान वर्तमान या पिछले anastatic गतिविधि का प्रतिनिधित्व कर सकता है । जीवित पशुओं में क्षणिक कोशिका मृत्यु-उत्प्रेरण पर्यावरणीय तनाव के बाद anastasis का अध्ययन करने के लिए, यह कोशिकाओं है कि सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत कोई caspaseात्मक गतिविधि प्रदर्शन के साथ ऊतकों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन है कि caspase से गुजरना करने के लिए प्रेरित किया जा सकता क्षणिक कोशिका मृत्यु प्रेरण द्वारा सक्रियण. अंडा मंडलों इस प्रयोजन के लिए आदर्श होते हैं, क्योंकि वे आम तौर पर germarium से कोई caspase गतिविधि oogenesis के दौरान 10 चरण के लिए है५८,५९,९२।

इस तरह के प्रोटीन भुखमरी और ठंड सदमे के रूप में क्षणिक पर्यावरणीय तनावों के लिए महिला Drosophila को उजागर, कुशलतापूर्वक अंडा मंडलों में caspase सक्रियण और कोशिका मृत्यु को ट्रिगर कर सकते हैं19,५७,५८, ७८. प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम लंबे समय तक सेल मौत प्रेरण से बचने के लिए मक्खियों शामिल हैं । प्रोटीन भुखमरी की अनुकूलित शर्तों (8% सुक्रोज में 1% आगर में 3 दिनों के लिए) और ठंडे सदमे (1 एच पर-7 ओसी) मादा मक्खियों को ट्रिगर कर सकते है caspase-सक्रिय सेल मौत की प्रक्रिया अंडा मंडलों में, और उंहें तनाव में मक्खियों के बाद ठीक करने की अनुमति के लिए लौट रहे है सामांय स्थिति19। एक सेल मौत उत्तेजना के साथ लंबे समय तक इलाज अधिक अंडा कक्षों को ट्रिगर करने के लिए सेल मौत की प्रक्रिया से गुजरना कर सकते हैं, लेकिन वसूली की दर भी कम है, शायद क्योंकि मर अंडा चैंबर मरंमत से परे भारी नुकसान का अनुभव ।

इस प्रोटोकॉल में एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम को पार करने, स्थापना और एक कम तापमान पर CaspaseTracker मक्खियों को बनाए रखने, जैसे 18 ओसी के रूप में अंडे कक्षों में CaspaseTracker पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए है । जबकि इष्टतम पीछे मक्खियों से अंडा मंडलों के बहुमत germarium में caspase गतिविधि प्रदर्शित नहीं करते 10 oogenesis५८के दौरान, के बारे में 1% अंडा मंडलों के सेल मौत प्रेरण 19 के बिना caspaseीय संवेदी गतिविधि प्रदर्शित सकता है . यह जन्मजात त्रुटियों के कारण सामान्य उदासीनता दर को प्रतिबिंबित कर सकते हैं या अनजाने में मानक प्रयोगशाला शर्तों द्वारा oogenesis के दौरान ट्रिगर किया जा सकता है । के रूप में Gal4 कम तापमान९३पर मक्खियों में कम गतिविधि प्रदर्शित करता है, 18 ओसी पर मक्खियों की स्थापना, बजाय कमरे के तापमान पर, अंतर्जात संकेत है कि CaspaseTracker प्रणाली को सक्रिय कर कम कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक उच्च तापमान के लिए मक्खियों स्विचन, इस तरह के रूप में 29 ओसी, CaspaseTracker प्रणाली की संवेदनशीलता को बढ़ा सकते हैं, Gal4 गतिविधि में वृद्धि के कारण९३, और संभावित अन्य अंतर्जात तापमान पर निर्भर एंजाइमी गतिविधियों.

यह CaspaseTracker-सकारात्मक कोशिकाओं है कि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया या anastasis कोशिकाओं है कि प्रदर्शन गैर अपोप्तोटिक caspase गतिविधि से गुजरना अलग महत्वपूर्ण है । अपोप्तोटिक कोशिकाओं एक्सप्रेस आरएफपी (पर जा रहा है या हाल ही में caspase गतिविधि के लिए परिवर्तनीय मार्कर), और अक्सर GFP (caspase प्रेरण के उपचार में पिछले apoptosis गतिविधि के लिए स्थाई निर्माता), के रूप में इन मर कोशिकाओं caspase गतिविधि चल रही है कि सट-सक्रिय Gal4, जो तब क्षणिक (Gal4 गतिविधि-आश्रित आरएफपी) और स्थायी (Gal4 ट्रिगर्ड FLPase-FRT मध्यस्थता GFP) रिपोर्टर्स जी-स्ट्रेस प्रणाली को सक्रिय करता है. इन कोशिकाओं के Apoptosis की पुष्टि की जा सकती है रूपात्मक और जैव रासायनिक बानगी ऐसे अमेरिका के परमाणु संघनित्र परमाणु रंजक के साथ धुंधला द्वारा पता चला14,19,५८, और caspase दरार द्वारा पता लगाया immunostaining१९,९४. वे कक्ष जो पहले से ही anastasis गए हैं, जी-ट्रेस सिस्टम के FLPase-मध्यस्थ पुनर्संयोजन इवेंट के कारण स्थायी GFP व्यंजक प्रदर्शित करते हैं. इन कोशिकाओं को कोई आरएफपी एक्सप्रेस के रूप में वे कोई caspase गतिविधि पर जा रहा है, और न ही अंय apoptosis की पहचान19। इन कोशिकाओं को भी सामांय परमाणु आकृति विज्ञान प्रदर्शित । कक्षों पर है-नॉन-अपोप्तोटिक caspase गतिविधि अक्सर आरएफपी और GFP अभिव्यक्ति दोनों प्रदर्शित करते हैं, और यह भी एक सामांय नाभिकीय आकृति19है ।

यह कोशिकाओं है कि उन कोशिकाओं है कि पिछले गैर था से anastasis अनुभव अंतर करने के लिए मुश्किल हो सकता है अपोप्तोटिक caspase गतिविधि, क्योंकि दोनों ही प्रदर्शन GFP और सेल मौत की कोई पहचान नहीं है । इसलिए, सावधान नियंत्रण प्रयोगों19शामिल किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, अंडा कक्षों में anastasis का अध्ययन करने के लिए, यह दोनों पर बल दिया-बरामद मक्खियों और गैर बल दिया मक्खियों (नकारात्मक नियंत्रण) में GFP अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए आवश्यक है । यदि anastasis caspase सक्रियण के बाद हुई है, तो बरामद मक्खियों अधिक GFP-व्यक्त करने वाली मक्खियों से कोशिकाओं को दिखाने चाहिए । यह भी गैर विशिष्ट ऑटो प्रतिदीप्ति से CaspaseTracker फ्लोरोसेंट संकेतों भेद महत्वपूर्ण है, के रूप में छल्ली में मनाया, pigments, और वसा निकायों19। हम एक गैर-सट अनुक्रम (DQVA) के लिए (DQVD) के caspase दरार साइट में रूपांतरित होने से नकारात्मक नियंत्रण सेंसर मक्खियों उत्पन्न होती है और इस तरह नियंत्रण के लिए गैर-उत्तरदायी संवेदक caspase गतिविधि19प्रतिपादन । caspase संवेदनशील (DQVD) में पाया गया सिग्नल लेकिन नकारात्मक नियंत्रण (DQVA) में नहीं है, तो caspase गतिविधि, ऑटो प्रतिदीप्ति के बजाय से ट्रिगर ब्याज का संकेत है ।

हमारे वर्तमान Drosophila दोहरी CaspaseTracker सेंसर आरएफपी की अभिव्यक्ति द्वारा "हाल ही में" caspase गतिविधि के साथ कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं, और caspase की अभिव्यक्ति द्वारा "पिछले" GFP गतिविधि के साथ कोशिकाओं19. हम ध्यान दें कि आरएफपी एक "वास्तविक समय" caspase गतिविधि संकेतक नहीं है, क्योंकि यह Gal4 के लिए प्रतिक्रिया समय के कुछ घंटे लगते है caspase गतिविधि के जवाब में आरएफपी की अभिव्यक्ति ड्राइव । एक "वास्तविक समय" समारोह में जोड़ने के लिए, Drosophila CaspaseTracker५२, हाल ही में विकसित iCasper के साथ संयुक्त किया जा सकता है, एक "वास्तविक समय" और "उज्ज्वल करने के लिए डार्क" vivo में है कि केवल अपने दूर लाल संकेत है जब यह है caspases से सट कर ।

apoptosis के अलावा, CaspaseTracker संभावित भी सेल मौत के वैकल्पिक प्रकार के दौरान सक्रिय हो सकता है के रूप में कोशिकाओं को अपने पाठ्यक्रम के दौरान सेल मौत रास्ते स्विच कर सकते है कि प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से caspase सक्रियण शामिल है, जैसे autophagy के बाद भुखमरी९५,९६, ठंड सदमे से परिगलन-प्रेरित प्लाज्मा झिल्ली टूटना19,५५,५६,७८, और staurosporine प्रेरित necroptosis९७, ९८. हमारे वर्तमान और पिछले अध्ययनों से यह दर्शाया गया है कि CaspaseTracker के लिए इन सेल से बरामद कोशिकाओं लेबल कर सकते हैं इन विट्रो में मौत प्रेरण या vivo में17,18,19 , 20 , 21. के रूप में इन सेल अकेले मौत प्रेरण एक साथ एक ही कोशिकाओं में कई सेल मौत रास्ते सक्रिय हो सकता है, इन कोशिकाओं के मरने की वसूली पता चलता है कि anastasis एक सामांय कोशिका वसूली घटना है कि अलग सेल मौत रिवर्स कर सकते है apoptosis, autophagy, परिगलन और necroptosis सहित प्रक्रियाओं, व्यक्तिगत रूप से या एक साथ.

vivo CaspaseTracker में अभी तक अज्ञात कार्यों, तंत्र, और anastasis (चित्रा 4)21के चिकित्सीय निहितार्थ की खोज की सुविधा होगी । anastasis के आणविक हस्ताक्षर प्रकट करने के लिए, हम समय-पाठ्यक्रम पूरे जीनोम जीन अभिव्यक्ति microarray अध्ययन करने के लिए इथेनॉल प्रेरित apoptosis के उत्क्रमण के दौरान माउस प्राथमिक जिगर की कोशिकाओं का विश्लेषण, और दिलचस्प है, हड़ताली परिवर्तन में पाया समर्थक अस्तित्व, विरोधी ऑक्सीकरण, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया, citrullinated संशोधन, angiogenesis, सेल माइग्रेशन, और परिवर्तन18,21सहित कई रास्ते में शामिल जीन की प्रतिलेखन । यह खोज apoptosis18,21से मानव जिगर कैंसर HepG2 कोशिकाओं की वसूली के हमारे सत्यापन के अध्ययन के द्वारा समर्थित है, और यह भी apoptosis९९की वसूली में हेला कोशिकाओं का हाल ही में एक स्वतंत्र आरएनए-अनुक्रमण अध्ययन. दिलचस्प है, ऊपर-कुछ समर्थक अस्तित्व कारकों anastatic कोशिकाओं में पाया के विनियमन भी दिल विफलता उत्क्रमण में मनाया जाता है, ट्यूमर प्रगति, और कैंसर पुनरावृत्ति१००,१०१,१०२, सुझाव anastasis की संभावित भागीदारी । anastasis के शारीरिक, रोग और चिकित्सीय क्षमता का अध्ययन करने के लिए, यह anastatic कोशिकाओं की पहचान और छोटे जानवरों में उनके भाग्य को ट्रैक करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में यह यंत्रवत और चिकित्सीय अध्ययन सक्षम हो जाएगा । हमारे Drosophila और स्तनधारी CaspaseTracker के सामान्य विकास, homeostasis, ऊतक वसूली, ट्यूमर विकास, कैंसर पुनरावृत्ति, और मेटास्टेसिस में anastasis के संभावित योगदान के परीक्षण के लिए उपयोगी उपकरण होंगे । इन अध्ययनों से ढूँढना anastasis की प्राकृतिक भूमिका की हमारी समझ में वृद्धि होगी, और anastasis को नियंत्रित करने के माध्यम से कोशिका मृत्यु और उत्तरजीविता द्वारा असभ्य रोगों के लिए क्रांतिकारी नए चिकित्सीय दृष्टिकोण की पहचान करने की क्षमता प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम चित्र 3 सी में और वीडियो पांडुलिपि में Drosophila छवि के लिए डैरेन Obbard धन्यवाद; जे मैरी Hardwick, वेड गिब्सन, और हीथ एम मेंने इस पांडुलिपि के बहुमूल्य चर्चा के लिए । यह काम एक सर एडवर्ड Youde मेमोरियल फेलोशिप (H.L.T.), डॉ वाल्टर Szeto मेमोरियल छात्रवृत्ति (H.L.T.), फुलब्राइट ग्रांट 007-2009 (H.L.T.), लाइफ साइंस रिसर्च फाउंडेशन फेलोशिप (H.L.T.), और NCI K22 ग्रांट CA204458 (H.L.T.) द्वारा समर्थित किया गया । हो लाम तांग जीवन विज्ञान अनुसंधान फाउंडेशन (2014-2017) के एक Shurl और Kay Curci फाउंडेशन फैलो था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

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दवा अंक १३२ Anastasis apoptosis autophagy caspase CaspaseTracker परिगलन necroptosis क्रमादेशित सेल मौत apoptosis के उत्क्रमण
CaspaseTracker के द्वारा <em>Vivo में</em> Anastasis का पता लगाना
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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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