Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oppdage Anastasis i Vivo av CaspaseTracker Biosensor

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis er teknisk utfordrende for å oppdage i vivo fordi cellene som tilbakeført celle død prosessen kan være morphologically utvisket fra vanlige friske celler. Her beskriver vi protokoller for å oppdage og spore celler som gjennomgår anastasis i levende dyr ved hjelp av nyutviklet i vivo CaspaseTracker biosensor systemet.

Abstract

Anastasis (gresk for «rising liv») er et nylig oppdaget celle utvinning fenomen der døende celler kan reversere sent celle død prosesser som er vanligvis antatt for å være egentlig irreversible. Fremme anastasis kan i prinsippet redning eller bevare skadet celler som er vanskelig å erstatte som cardiomyocytes eller neurons, og dermed lette vev. Omvendt, undertrykker anastasis i kreftcellene, gjennomgår apoptose etter anti-kreft behandlinger, kan sikre celledød og redusere sjansene for regelmessighet. Men har disse studiene vært hemmet av mangel på verktøy for å spore skjebnen til celler som gjennomgår anastasis i levende dyr. Utfordringen er å identifisere celler som tilbakeført celle død prosessen til tross for deres morphologically normalt utseende etter utvinning. For å overkomme dette problemet, har vi utviklet Drosophila og pattedyr CaspaseTracker biosensor systemer som kan identifisere og permanent spore anastatic celler i vitro eller i vivo. Her presenterer vi i vivo protokoller for generasjon og bruk av CaspaseTracker dobbelt biosensor system for å registrere og spore anastasis i Drosophila melanogaster etter forbigående eksponering for celle død stimuli. Mens konvensjonelle biosensors og protokoller kan merke celler aktivt i apoptotisk celledød, CaspaseTracker biosensor kan permanent merke celler som har kommet til hektene etter caspase aktivisering - et kjennetegn på sent apoptose, og samtidig identifisere aktive apoptotisk prosesser. Denne biosensor kan også spore utvinning av cellene som forsøkte andre former for celledød som direkte eller indirekte involvert caspase aktivitet. Derfor kan denne protokollen vi kontinuerlig spore skjebnen til disse cellene og deres avkom, tilrettelegge fremtidige studier av biologiske funksjoner, molekylære mekanismer, fysiologiske og patologiske konsekvenser og terapeutiske virkningene av anastasis. Vi diskuterer også riktige kontroller for å skille celler som gjennomgår anastasis fra de som viser ikke-apoptotisk caspase aktivitet i vivo.

Introduction

Programmert celledød som apoptose, spiller en viktig rolle i embryonale utviklingen og normal homeostase ved å fjerne uønsket, skadet eller farlig celler i multicellular organismer1,2,3. Tap av balansen mellom celledød og overlevelse kan føre til fatale konsekvenser som kreft, hjertesvikt, autoimmunitet og degenerasjon,4,,5,,6,,7,,8. Aktivering av bøddelen caspases har tradisjonelt vært ansett som den "point of no return" i apoptose9,10,11, som utløser rask og massive mobilnettet riving12, 13,14,15,16. Utfordrende denne generelle dogme, viste vi at kan kultivert døende primære celler og kreftceller gjenopprette ikke bare etter caspase aktivisering, men også følgende viktige celle død kjennetegnene inkludert plasma membran blebbing, celle krymping, Mitokondrielt fragmentering, utgivelsen av mitokondrie cytochrome c i stoffer kjernefysiske og chromatin kondens, DNA skade, kjernefysiske fragmentering, celle overflaten eksponering av fosfatidylserin (PS), og dannelsen av apoptotisk organer 17 , 18 , 19 , 20 , 21. foreslår vi at anastasis er en iboende celle utvinning fenomen, som døende celler kan gjenopprette etter fjerning av celle død stimuli17,18,19,20, 21. vi innførte begrepet "Anastasis" (Αναστάσης)18, som betyr "rising liv" på gresk, å beskrive denne uventede celle utvinning fenomen. Våre observasjon av anastasis støttes av uavhengige studier som også avslører utvinning av cellene etter fosfatidylserin eksternalisering22,23,24, begrenset mitokondrie ytre membran permeabilization25, aktivering av blandet herkomst kinase-lignende (MLKL) og celle krymping26.

Karakterisere mekanismer regulere anastasis vil ha paradigme-skifter fysiologiske, patologiske og terapeutiske konsekvenser. Anastasis kan representere en tidligere ukjent cytoprotective mekanisme for å redde eller bevare viktige postmitotic celler og vev som er vanskelig å erstatte, og muligens konto for hjertesvikt tilbakeføring av ventrikkel lossing med venstre ventrikkel hjelpe enheter (LVADs)27,28, utvinning av photoreceptor celler etter forbigående eksponering av overdreven lys29,30,31eller reparasjon av neurons etter hjernen skade32. Hvis så fremme anastasis kan forbedre celler og vev utvinning. Derimot kan anastasis være en uventet escape taktikk brukt av kreftceller for å overleve celle-død-inducing terapi, forårsaker kreft tilbakefall17,18. Derfor undertrykke anastasis dør kreftcellene under og etter behandling kan være en ny terapeutiske strategi å kurere kreft ved å hindre deres tilbakefall.

Under prosessen med anastasis, har vi funnet at noen gjenopprettede celler ervervet permanent genetiske endringer og gjennomgikk kreftfremkallende transformasjon, sannsynligvis på grunn av DNA skade påløper under apoptose18,20,21 . Reversere prosessen død av DNA-skadet celler kan være en mekanisme tumorigenesis, potensielt underliggende observasjon som gjentas tissue skade øker risikoen for kreft i ulike vev, slik som kronisk termisk skade i spiserøret indusert av inntak av svært varme drikker33,34,35, leverskader på grunn av alkoholisme36,37, svulst utviklingen etter gentoksisk kreft terapi38, 39,40, og utvikling av nye kreft fra normalt vev som oppstår under intervallene mellom sykluser av anti-kreft terapi41,42,43,44 . Hvis sann, kan målretting anastasis hindre eller arrestere hudkreft og progresjon. Vi har funnet at sult-indusert døende bakterie celler gjennomgå anastasis i nytt matet Drosophila19.  Hvis anastasis oppstår i bakterie celler med DNA skade, kan det konto for observasjon som langvarig miljøstress fremmer utviklingen av genetiske sykdommer. For eksempel bidra hungersnød til utviklingen av transgenerational arvelige sykdommer som diabetes og coronary hjertesykdommer45. Forståelse anastasis kan derfor føre til strategier for forebygging av utvikling arvelige sykdommer forårsaket av denne potensielle mekanismen.

Å utnytte oppdagelsen av anastasis og direkte å utvikle nyskapende terapier, er det viktig å studere årsaken og konsekvens av anastasis i levende dyr. Men er det teknisk utfordrende å identifisere og spore anastatic celler i vivo, fordi cellene som utvinnes fra celle død prosessen vises morphologically utvisket fra vanlige friske celler, og det er ingen biomarkør av anastasis identifisert ennå17,18,21. For å løse disse problemene, vi nylig utviklet en ny i vivo caspase biosensor utpekt "CaspaseTracker"19, til å identifisere og spore celler som overlever apoptose etter caspase aktivisering19,46, den Hallmark apoptose10,14. Skille det fra "real-time" caspase biosensors som SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 og iCasper52 som gjenkjenner pågående caspase aktivitet, den CaspaseTracker biosensor har i tillegg muligheten til permanent merke celler som uttrykker caspase aktivitet selv transiently. Derfor kan CaspaseTracker biosensor lang sikt sporing av anastasis etter reversering av caspase-mediert celle død prosessen i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) utarbeidelse av CaspaseTracker Biosensor fluer

  1. Bedøve fluer med CO2, og bruk en pensel til å overføre 7 til 10 caspase-sensitive Gal4 (DQVD)19 jomfru kvinner og 7 til 10 G-spor53 Gal4 reporter unge mannlige fluer (eller omvendt) i samme ampullen med fly mat og fersk gjær pasta.
    Merk: Cross Caspase-sensitive (DQVD) Gal4 og G-spor fluer vil produsere CaspaseTracker avkom fluer. Cross Caspase -isensitive (DQVA)19 Gal4 og G-spor fluer vil gi negativ kontroll flyr (se diskusjon). Fersk gjær lim fungerer som proteinkilde å forbedre eggproduksjon, slik som øker antall avkom. Velg jomfru kvinner og unge mannlige fluer ifølge deres fenotyper54.
  2. Inkuber fluene på 18 grader Celsius (oC) under korset for 3 til 7 dager, og deretter overføre fluene til en ny medisinglass sette opp nye kryss i 18 ° C. Fortsette å ruge opprinnelige ampullen ved 18 ° C før avkom fluer lille.
    Merk: Overføre de overordnede flyr til nye ampuller å unngå overbefolkning Progeny på opprinnelige ampullen. Overordnede fluer kan produsere avkom med fersk mat og gjær lim på bryterne først 2 til 3, og deretter produktivitet reduseres betydelig med tid. Heve fluer 18 ° C kan redusere ikke-spesifikk signaler fra CaspaseTracker biosensor (se diskusjon).
  3. Velg avkom flyr med riktig fenotyper54 for følgende eksperimenter.
    Merk: De effekter av transgener av både caspase-sensitive Gal4 og G-spor her er plassert på det andre kromosomet, balansert med CyO belastningsfordeling. Velg ikke-krøllete fløyen avkommet (uten CyO), som har både effekter av transgener caspase-sensitive Gal4 og G-spor.

2) bruk av forbigående celle død induksjon til CaspaseTracker Biosensor fluer

  1. Overfør 10 til 20 nylig eclosed kvinnelige flyr til en ny medisinglass med fersk fly mat og fersk gjær lim for 1 dag 18 ° c tillate kammer eggproduksjon ved oogenesis.
    Merk: Holde kvinnelige med mannlige fluer kan forbedre kammer eggproduksjon.
  2. For å indusere egg kammer til gjennomgår apoptose-programmert av kaldt sjokk, overføre flyr kvinnelige til ny tom medisinglass, som deretter plasseres ved-7 ° C i 1 time.
    Merk: kaldt sjokk skader celler ved å fremkalle plasma membranen ruptur55,56.
  3. For å indusere egg kammer til gjennomgår apoptose-programmert av protein sult, overføre de kvinnelige flyr til en ny medisinglass med 8% sukrose og 1% agar mat til 18 ° C i 3 dager.
    Merk: Protein sult (ikke-protein mat) kan utløse egg kammer å gjennomgå apoptose57,58,59 og autophagy60,61. Bryteren flyr til en ny medisinglass med 8% sukrose og 1% agar mat hver dag for å holde optimale tilstand av sukrose fly mat.
  4. Overføre stresset fluene tilbake til en ny medisinglass med fersk fly mat og fersk gjær lim for 3 dager på 18 ° C å tillate dem å gjenopprette. Dissekere den starved og sultet-gjenopprettet fluene å få egg chambers på eggstokkene som beskrevet62.
    Merk: For å analysere Drosophila for å få eggstokkene, bedøve fluer med CO2, og bruke 2 par pinsett fjerne fly hodet og bruk tang til å trekke base av magen fjerne eggstokkene Fluenes.

3) fiksering og flekker av dissekert Egg kamre for Imaging

  1. Overføre dissekert egg kamrene sammen med rundt 0,5 mL fosfat bufret saltvann (PBS) til 1 mL sentrifuge rør. Tillate egg å slå seg ned.
    Merk: Coat plastikk pipe-tips med 1% bovin serum albumin (BSA) oppløst i vann eller PBS å hindre egg kamrene å stikke på plast overflaten av tipsene. Utfør følgende prosedyrer i mørket for å unngå photobleaching rød fluorescerende protein (RFP, også kjent som DsRed) og grønne fluorescerende protein (GFP) i egg kamre.
  2. Fjern PBS av pipettering, og deretter bruke 0,5 mL 4% paraformaldehyde i PBS fikse egg kamrene i romtemperatur i mørket i 20-30 min.
    Merk: Bruke skånsom rotasjon i dette og følgende inkubasjon.
  3. Fjerne paraformaldehyde av pipettering og deretter vasket egg kammeret med 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) for 3 timene.
    Merk: Langvarig fiksering kan redusere RFP og GFP signalene.
  4. Ruge egg avdelingene med PBST 1-2 h ved romtemperatur eller overnatting på 4 ° C med mild rotasjon til permeabilize egg kamrene.
    Merk: PBST kan også unngå egg kammer å holde seg til ikke-BSA belagt plast overflaten.
  5. Fjerne PBST av pipettering, og deretter bruke 0,5 mL 10 μg/mL blå kjernefysiske Hoechst fargestoff i PBST egg kamre for 1-2 h ved romtemperatur stain for kjernen.
    Merk1: Unngå langvarig inkubasjon med kjernefysiske fargestoff som dette vil øke uspesifisert signal.
    NOTE2: Alternativ tilnærming stain kjernen uten Hoechst er å legge til 200 μL anti-bleking montering agent med DAPI (se materialer) og ruge over natten63, før montering vev på glass cover slip som beskrevet i protokollen 3.8.
    NOTE3: utfører den flekker og følgende i mørket for å unngå photobleaching.
  6. Fjern kjernefysiske fargestoff av pipettering, og deretter bruke 0,5 mL PBST å vaske egg kamrene i 1 mL sentrifuge rør for 3 timene, med 10 å 20 min incubation med mild rotasjon mellom hver vask trinn.
  7. Fjern alle PBST med fine pipette, og deretter bruke 200 μL anti-bleking montering agent (se materialer) å ruge egg kamrene ved romtemperatur for 3 h eller overnatter 4 ° C før egg kamrene synke å bunnen av røret.
    Merk: vev som har fullstendig absorbert montering agent synke å bunnen av røret.
  8. Montere farget egg kamrene ved å overføre dem med 200 μL anti-bleking montering agent på en pre renset objektglass for bildebehandling av pipettering, dekke egg kamrene med en 20 x 20 mm pre renset glass cover slip, og forsegle cover slip på objektglass ved å sette neglelakk i utkanten av cover slip.
    Merk1: Pre Rengjør objektglass og cover slip med vann eller 70% etanol.
    NOTE2: Bruk petroleum gelé mellom av objektglass og cover slip å unngå ødelegge egg kamrene av overcompression.
  9. Bilde egg kamrene fluorescens eller AC confocal mikroskop, ved hjelp av en 20 x, NA 0,8 Plan-Apochromat mål, med eksitasjon lys bølgelengde 405 nm for kjernefysisk flekker (Søk utslipp ~ 461 nm), 561 nm for RFP (pågående eller nyere caspase aktivitet) signal ( oppdage utslipp ~ 590 nm), og 488 nm for GFP (tidligere caspase aktivitet)-signal (oppdage utslipp ~ 518nm).
    Merk: Se våre publiserte protokoller for mikroskopi20,64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mens time-lapse levende celle mikroskopi er en pålitelig metode for skrift anastasis i kulturperler celler20, er det vanskelig å identifisere hvilke celler har gjennomgått anastasis i dyr, fordi de gjenopprettede cellene vises morphologically utvisket fra vanlige friske celler som ikke har forsøkt celledød. For eksempel vise menneskelige livmorhalskreft HeLa celler morfologiske kjennetegn av apoptose1,2,14, som cellen krymping, kjernefysiske kondens og plasma membran blebbing svar på celledød stimulans 1µM staurosporine17 (figur 1A, figur 1B i-ii). Etter fjerne celle død stimulans og inkubasjon i frisk medium, reversere døende cellene celle død prosessen ved anastasis17,18, som indikert av morfologiske utvinning (figur 1B iii-iv), etterfulgt av spredning (figur 1B v-vi). Våre tidligere studier har også brukt "real-time" caspase biosensors, som ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) å demonstrere reversering av apoptose etter caspase aktivisering18,20. Denne biosensor regionaliserer til stoffer i friske celler (figur 1 c, 1 D jeg). Caspase aktivisering utløst av celle død stimulans 3,7% etanol, er denne YFP-baserte biosensor kløyvde av caspases og translocated til kjernen, der akkumuleres og den resulterende kjernefysiske fluorescensen av YFP koden identifiserer celler med pågående caspase aktivitet (figur 1 C, 1 D ii-iii). Døende cellene også vise morfologiske kjennetegn av apoptose i etanol-induksjon1,14,18,20, som fragmentering av rørformede mitokondriene, kjernefysiske kondens, celle krymping og plasma membran blebbing (figur 1 d ii-iii). Interessant, etter fjerning av celle død stimulans, kan de samme cellene komme seg og gjenvinne normal morfologi (figur 1 d iv-viii). Spesielt kjernefysisk fluorescens av ApoAlert (kløyvde biosensor) er borte innen 1 time i de gjenopprettede cellene (figur 1 d iv-viii), muligens på grunn av lignende prosesser som fjerne skadede komponenter i anastatic celler18 , for eksempel kløyvde caspase-3 PARP og ICAD genereres under apoptose. Derfor er en ny strategi nødvendig for å spore anastasis over en lengre periode, spesielt i vivo.

For å spore skjebnen til anastatic celler, utviklet vi pattedyr CaspaseTracker biosensor systemet, som permanent merker cellene etter blir kløyvde av bøddelen caspase aktivitet. Denne biosensor består av en caspase-sensitive rtTA (omvendt tetracycline-kontrollerte transactivator) og en grobunn-LoxP-baserte reporter for rtTA aktivitet (figur 2A-B). I friske celler uten caspase aktivitet, transactivator rtTA65 er bundet til den plasma membranen anker (Lyn11)66,67, kjernen utelukkelse signal (ne) av kart Kinase Kinase (MAPKK)68, og østrogen reseptor variant (ERT2)69 gjennom caspase-cleavable (DEVD)70 linkers avledet fra PARP (figur 2A, 2B). Som bundet rtTA ikke translocate fra stoffer til kjernen, kan ikke den aktivere rtTA reporter. Men ved aktivering som svar på en celle død stimulans cleave caspases DEVD linkers, frigjøre rtTA til translocate til kjernen (figur 2B). En gang i kjernen, rtTA binder til tet svar element (TRE) og utløsere forbigående uttrykk for grobunn recombinase, som fører til en irreversibel rekombinasjon hendelse som fjerner stopp codon kassetten mellom CAG arrangøren og koding sekvenser for rød fluorescerende protein (DsRed). Dette resulterer i faste uttrykk for DsRed (figur 2B), som fungerer som permanent fluorescerende markør for disse cellene kan forbli i live etter at de har opplevd caspase aktivitet, samt deres avkom (figur 2C).

For å teste den pattedyr CaspaseTracker biosensor, vi introdusert det i HeLa celler av forbigående transfection behandlet cellene med en celle død stimulans (1µM staurosporine) og overvåket utvinning av cellene av time-lapse levende celle AC confocal mikroskopi som vi har beskrevet20. Doxycycline (1µg/mL siste konsentrasjon), som er avgjørende for å tillate rtTA aktivitet65,71, ble lagt til celle kultur medium aktivere biosensor gjennom hele eksperimentet. Svar på celle død stimulans vise behandlet cellene kjennetegner apoptose, inkludert celle krymping og plasma membran blebbing som forventet (figur 2D i-iii). Etter fjerner celle død stimulans, kan skylling celle laget en gang og legge frisk kultur medium, anastasis observeres i de døende cellene, som indikert av deres tilbake til en normal morfologi (figur 2D iv vii). Diagnostically, bare utvinnes celler express DsRed fluorescerende markøren under og etter anastasis (figur 2D iv vii), skille dem fra både ikke-gjenopprettet celler (figur 2D iv vii), og kontroll celler ikke utsatt for celle død stimulans (figur 2E). Dette viser programmet og nytten av pattedyr CaspaseTracker som en roman nye verktøy for å identifisere og permanent merking anastatic celler utvinne fra caspase-aktivering, og gir en måte å spore og studere deres langsiktige skjebne.

For å registrere og spore anastasis i levende dyr, er CaspaseTracker biosensor transgene dyr nødvendig. Derfor vi først brukte Drosophila melanogaster som en modell systemet19, fordi som det er en viktig genetisk medgjørlig organisme for studiet av animalske utvikling og menneskelige sykdommer72,73,74 ,75. Som endret fra pattedyr CaspaseTracker biosensor, kan Drosophila dobbelt biosensor identifisere og skille "siste/pågående" fra "tidligere" caspase aktivitet. Denne doble biosensor består av en caspase-sensitive Gal419, og Gal4 reporter G-spor53 (figur 3A). I celler uten caspase aktivitet, gjær transkripsjon faktoren Gal4 er bundet til en plasma membran anker (mCD8) domene via et caspase-cleavable linker (DQVD) fra DIAP1 (figur 3B), har en 21NN/GV22 mutasjon å hindre nedbrytning av Gal4 i N-end regelen på caspase spalting av linker afterAsp2076, og en D135R mutasjon å avskaffe drICE caspase hemmende funksjonen BIR1 domene77. Som bundet Gal4 ikke translocate til kjernen uten spalting av caspase å løse det, forblir Gal4 reporteren G-spor inaktiv i cellene har ingen caspase aktivitet19. Ved caspase aktivering, men cleave aktivert caspases DQVD linker, frigjøre Gal4 til translocate til kjernen å aktivere G-spor reporter (figur 3A)19. Gal4 binder til spesifikke oppstrøms aktivere sekvenser (UAS) utløse forbigående transkripsjon og uttrykk for RFP, som deretter fungerer som fluorescerende reporter nyere eller aktuell caspase aktivitet før Gal4 (caspase) aktivitet stopper og deretter RFP protein er degradert. Gal4 utløser også uttrykk for FLP recombinase fra transgene, fører til en rekombinasjon hendelse som fjerner stopp codon kassetten mellom en ubiquitin (Ubi) promoter og koding serienummer for kjernen målrettede GFP (nucGFP). Dette resulterer i faste uttrykk for nucGFP, som fungerer som permanent markør for celler som har opplevd caspase aktivitet og forbli i live.

For å teste Drosophila CaspaseTracker biosensor for å oppdage apoptose og anastasis ble i vivo, CaspaseTracker kvinnelige flyr utsatt for fysiologiske stress (Figur 3 c), slik som kalde sjokk19, som effektivt utløse celledød, inkludert apoptose som angitt av caspase aktivisering, kjernefysiske kondens og celle krymping19,78, og nekrose på grunn av kjøling som forårsaker tap av membran integritet og lekkasje av cytoplasmatiske innholdet55,56. Som forventet, CaspaseTracker er ikke aktivert i egget kamre av kontroll fluer hvor stress-relatert celledød ikke var indusert (figur 3D). Derimot egg kamrene av stresset fluer dagen etter kaldt sjokk viste ikke bare karakteristiske apoptotisk celle krymping og kjernefysiske kondens, men også RFP GFP uttrykk, som indikerer tilstedeværelse av nylig eller pågående (RFP +) og siste (GFP +) caspase aktivitet (figur 3E). Men etter 3 dager etter stresset fluene normal ikke-stressende tilstand, GFP, men ingen RFP, ble uttrykket oppdaget i den gjenopprettede egg kammer (figur 3F). Dette indikerer at egg kamre som hadde uttrykt caspase aktivitet etter stress var i stand til å overvinne celle død prosessen og overleve.

For å teste videre Reversibilitet av celle død i egg kamre19, var CaspaseTracker kvinnelige fluer stresset av protein sult etter matet 8% sukrose i 1% agar for 3 dager. Tidligere studier viste at protein sult kan utløse caspase-mediert apoptose og autophagy i vev med somatiske og bakterie celler, inkludert egg kamre57,60,61. Som forventet, ble CaspaseTracker aktivert i egg kamre etter 3 dager av protein sult (Figur 3 g). Døende egg kamrene utstilt både apoptotisk morphologies og uttrykk for RFP og GFP biosensor markører, indikerer nylig eller pågående (RFP +) og forbi (GFP +) caspase aktivitet (Figur 3 g). For å demonstrere at CaspaseTracker kan spore gjenopprettede celler som tidligere har hatt caspase aktivisering etter en død stimulans, ble sultet fluene deretter overført til vanlig protein inneholder fly mat. Som forventet, mangler det gjenopprettede egg kamrene av disse re matet fluer RFP forbigående caspase reporteren, som angir ingen nylig eller pågående caspase aktivitet (Figur 3 H). Imidlertid hadde egg kamrene i disse fluene etter lindre stress ved å returnere dem til vanlig mat vises GFP caspase reporter (Figur 3 H), som angir at cellene i disse egg kamre snudd initiert celle død prosessen på et punkt etter caspase aktivisering. Verifikasjon at CaspaseTracker biosensor aktiviteten er utløst av caspase ble oppnådd ved å erstatte cleavage rekkefølgen DQVD med en rekke DQVA, som caspase kan ikke holde seg og som avskaffe biosensor aktivitet (figur 3B, 3I ).

Etter CaspaseTracker Drosophila gjenopprettet fra protein sult, fant vi at flere typer celle i egg chambers, som somatiske (hårsekken) celler og germline celler (sykepleier celler og oocytes), vises bare GFP, men ikke RFP (figur 3J )19, indikerer at disse cellene kan gjennomgå anastasis etter caspase aktivisering. Interessant, merket GFP også cellene i germarium (figur 3J)19, som inneholder stamceller, sammen med sine tilknyttede egg kamre i samme ovariole kjeden. Derfor kan disse GFP-positive egg rommene ha blitt avledet fra stamceller som har kommet til hektene fra celle død prosessen etter caspase aktivisering. Viktigere, flyr den starved og re matet kvinnelige lå fruktbare egg som kan produsere GFP-uttrykke avkom fluer19, antyder at potensielt cellene snudd celle død prosessen etter caspase aktivisering kanne gjenerhverve tilsynelatende normale funksjon. Fremtidige studier for å avgjøre om avkom fluer som at anastasis viser permanent sekvele.

Figure 1
Figur 1 . Gjenoppretting av HeLa celler etter celle død induksjon.
(A) skjematisk diagram av tilnærming å indusere celledød og deretter la dø celler gjenopprette etter fjerning av celle død induser.
(B) Time-lapse levende celle DIC mikroskopi sunn HeLa celler (jeg), den samme gruppen med celler etter behandling med 1µM staurosporine (ii), og deretter vasket og ytterligere inkubert med fersk kultur medium å fjerne staurosporine ( III-vi). Hvite pil viser en dele celle.
(C) skjematisk diagram caspase biosensor fusion protein NES-DEVD-YFP-NLS, og den subcellular lokaliseringen av YFP under cellen død induksjon og etter anastasis.
(D) Time-lapse levende celle AC confocal mikroskopi for en HeLa celle uttrykke caspase biosensor fusion protein NES-DEVD-YFP-NLS før (jeg), under eksponering til 3,7% etanol (ii - iii), og etter fjerner etanol fra kultur medium (iv - viii). Vist her er bilder av caspase biosensor bare (grønn fluorescens, øverste rad); flettet bilder av Hoechst-farget kjernen (blå fluorescens) og mitokondrier (rød fluorescens) (midterste raden) og bilder i den midtre raden videre sammen med DIC bilder (nederste rad). Hvite pilene i øverste rad angir kjernefysiske lokaliserte YFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Pattedyr CaspaseTracker biosensor systemet.
(A) skjematisk diagram av caspase-sensitive rtTA.
(B) skjematisk diagram av pattedyr CaspaseTracker rtTA biosensor systemet.
(C) flytskjemaet ved bruk av CaspaseTracker rtTA biosensor systemet for å oppdage anastasis. Rød/gul trekant (gjelder celle død induser) og grønn/blå (vask induser av) symboler som figur 1A.
(D) time-lapse levende celle AC confocal mikroskopi av en klynge av HeLa celler uttrykke pattedyr CaspaseTracker rtTA biosensor før (jeg), og under eksponering til 1µM staurosporine (ii - iii), og etter fjerning staurosporine fra kultur medium (iv - vii). Flettede bilder av DIC og DsRed signaler. Pilene angir cellen 1 (gul) og celle 2 (grønn).
(E) time-lapse levende celle AC confocal mikroskopi ubehandlet biosensor-uttrykke HeLa cellene. Flettede bilder av DIC og DsRed signaler. Hvite pilene angir dele celler.
Doxycycline (1ug/mL) finnes i medium gjennom eksperimenter i paneler (D) og (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Drosophila CaspaseTracker dobbelt biosensor system. (Vedtatt med tillatelse fra Tang et al., vitenskapelige rapporter 2015, 9:9015 19 ).
(A) skjematisk diagram av Drosophila CaspaseTracker Gal4 biosensor.
(B) skjematisk diagram av caspase-sensitive (DQVD) og caspase-ufølsom kontroll (DQVA) Gal4.
(C) skjematisk Drosophila eggstokk og flytskjema for celle død-induksjon i 1 dager gamle fluer, etterfulgt av 3-dager utvinning i normal tilstand. Drosophila bilde av Darren Obbard.
(D) representativt AC confocal bilde av egg kamre fra eggstokken av en kvinnelig biosensor fly matet med vanlig fly mat for 6 dager (ubehandlet).
(E) representativt AC confocal bilde av egg kamre fra eggstokken av Røykuttak kaldt sjokkert kvinnelige biosensor plassert ved-7 ° C i 1 time og deretter byttet til normal kultur tilstand for 1 dag (kald sjokk, CS).
(F) som panelet E unntatt kaldt sjokkert fluene ble slått til normal kultur tilstand for 3 dager (gjenopprettet etter CS).
(G) representativt AC confocal bilde av egg kamre fra eggstokken av en starved kvinnelige biosensor fly matet med 8% sukrose i 1% agar uten protein i 3 dager (Starved).
(H) som panelet G unntatt behandlet fluene var byttet til vanlig fly mat for 3 dager etter protein sult behandling (nytt matet).
(I) som panelet G unntatt viser sult av caspase isensitive CaspaseTracker (DQVA) kvinnelige biosensor fluer, som fungerte som negativ kontroll.
(J) representant AC confocal bilde av egg kamre fra en starved og re matet kvinnelige Drosophila. Pilene angir kjernefysiske GFP uttrykke i sykepleier celler (svart), oocytes (hvit) og hårsekken celler (gul) egg chambers, og germarium (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Fysiologiske, patologiske og terapeutiske virkningene av anastasis. (Vedtatt med tillatelse fra Tang et al., F1000Res 2017, 6:43 21 ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CaspaseTracker dobbelt biosensor system er en roman og unikt verktøy som tillater påvisning av nylig eller pågående caspase aktivitet og sporing av celler som tilbakeført celledød behandle og overleve etter caspase aktivitet i vivo. Mens caspase aktivitet har tradisjonelt antatt som et kjennetegn på apoptose, avslører voksende studier at ikke-apoptotisk caspase aktivitet spiller potensielle roller i ulike normal celle-funksjoner, for eksempel regulering av neuronal aktivitet79, 80, læring og hukommelse81,82,83,84, undertrykkelse av necroptotic celle død85,86, spermatid Approach87, 88, microRNA89, celle spredning90og celle skjebne mønstre91. Apoptose og anastasis, kan CaspaseTracker biosensor systemet derfor oppdage ikke-apoptotisk caspase aktivitet, som finnes i hjernen og optikk lobes cardia, gut, Malpighian tubuli, luftrør, muskler og andre vev av Drosophila19,46,64. Biosensor signalet kan også representere nåværende eller tidligere anastatic aktiviteten under embryo utvikling eller normal homeostase i disse vev. For å studere anastasis etter forbigående celle død-inducing miljøstress i levende dyr, er det viktig å velge vev med celler som viser ingen caspase biosensor aktivitet under normale fysiologiske forhold, men som kan bli overtalt til å gjennomgå caspase aktivering av forbigående celle død induksjon. Egg kamre er ideelle for dette formålet, fordi de vanligvis har ingen caspase aktivitet fra germarium til trinn 10 under oogenesis58,59,92.

Utsette kvinnelige Drosophila å forbigående miljømessige påkjenninger, kan som protein sult og kalde sjokk, effektivt utløse caspase aktivisering og celledød i egg kamre19,57,58, 78. Avgjørende skritt i protokollen inkludere unngå langvarig celle død induksjon til fluer. Optimalisert betingelsene for protein sult (8% sukrose i 1% agar for 3-dager) og kalde støt (1 h på-7 oC) til kvinnelige fluer kan utløse caspase-aktivert celle død prosessen i egg kamre, og tillate dem å komme seg etter de stresset flyr tilbake til normal tilstand19. Langvarig behandling med en celle død stimulans kan utløse mer egg kammer å gjennomgå celle død prosessen, men utvinningsgrad også reduseres, antagelig fordi den døende egg kammer oppleve massive skader repareres.

Et mer avgjørende skritt i denne protokollen er å redusere CaspaseTracker bakgrunn signalet i egg kamre av krysset, øke og opprettholde CaspaseTracker flyr ved lavere temperatur, som 18 oC. Mens fleste av egg kamre fra optimalt oppdratt fluer, vises ikke caspase aktivitet i germarium gjennom scene 10 under oogenesis58, om lag 1% av egg kamre kan vist caspase biosensor aktivitet uten celle død induksjon19 . Dette kan gjenspeile den normale utmattelseskrig rate på grunn av iboende feil eller kan utløses utilsiktet under oogenesis av standard laboratorieforhold. Som Gal4 viser mindre aktivitet i fluer på lav temperatur93, kan heve fluer på 18 oC, ikke i romtemperatur, redusere endogene signalet som aktiverer CaspaseTracker systemet. Eventuelt kan bytte flyr til en høyere temperatur, som 29 oC, øke sensitiviteten av CaspaseTracker grunn til økt Gal4 aktivitet93, og potensielt andre endogene temperaturen-avhengige enzymatisk aktiviteter.

Det er viktig å skille CaspaseTracker-positive cellene gjennomgår celle død prosess eller anastasis fra celler som viser ikke-apoptotisk caspase aktivitet. Apoptotisk celler uttrykke RFP (forbigående markør for pågående eller nyere caspase aktivitet), og ofte GFP (permanent maker for siste caspase-aktivitet) i behandling av apoptose induksjon, som disse døende celler har pågående caspase aktivitet som cleave-aktivert Gal4, som aktiverer (Gal4 aktivitet-avhengige RFP) er midlertidig og permanent (Gal4 utløste FLPase-FRT mediert GFP) journalister av G-spor. Apoptose av disse cellene kan bekreftes av morfologiske og biokjemiske kjennetegnene slike amerikanske kjernefysiske kondens oppdaget av flekker med kjernefysiske fargestoffer14,19,58, og caspase cleavage oppdaget av immunostai-19,94. Celler som allerede har gjennomgått anastasis vise permanent GFP uttrykket på grunn av hendelsen FLPase-mediert rekombinasjon av G-spor. Disse cellene uttrykker ingen RFP som de ikke har noen pågående caspase aktivitet, eller andre kjennetegn apoptose19. Disse cellene også vise normal kjernefysiske morfologi. Celler har pågående ikke-apoptotisk caspase aktivitet ofte vise både RFP og GFP, og har en normal kjernefysiske morfologi19.

Det kan være vanskelig å skille celler som opplevd anastasis fra cellene som hadde siste ikke-apoptotisk caspase aktivitet, fordi begge viser bare GFP og har ingen kjennetegner celledød. Derfor må nøye kontroll eksperimenter inkludert19. For eksempel for å studere anastasis i egg chambers, er det viktig å undersøke GFP uttrykk i både stresset-gjenopprettet fluer og ikke-stresset fluer (negativ kontroll). Gjenopprettede fluer bør vise flere GFP-uttrykke celler enn trykklette fluer, hvis anastasis har oppstått etter caspase aktivisering. Det er også viktig å skille CaspaseTracker fluorescerende signaler fra uspesifikke auto-fluorescens, som observert i cuticle, pigmenter og fett organer19. Vi generert negativ kontroll biosensor flyr av mutere caspase cleavage området av biosensor (DQVD) til en ikke-cleavable sekvens (DQVA) og derved oversettelse kontroll biosensor ikke svarer til caspase aktivitet19. Signalet oppdaget i caspase følsom (DQVD), men ikke i negativ kontroll (DQVA) biosensor fluene er signalet av interesse, utløst av caspase aktivitet, i stedet for auto-fluorescens.

Vår nåværende Drosophila dobbelt CaspaseTracker biosensor kan identifisere celler "nyere" caspase virksomhet ved uttrykk for RFP, og celler med "tidligere" caspase aktivitet av uttrykk GFP19. Vi merke at RFP ikke er en "real-time" caspase aktivitet indikator, fordi det tar noen timer av reaksjon tid for Gal4 å kjøre uttrykk for RFP svar på caspase aktivitet. Legge til en "real time"-funksjon, Drosophila CaspaseTracker biosensor kan kombineres med den nylig utviklet iCasper biosensor52, en "real-time" og "mørk til lys" i vivo biosensor som bare viser et langt rødt signal når det er kløyvde av caspases.

Bortsett fra apoptose, CaspaseTracker potensielt også aktiveres under alternative typer celledød som cellene kan bytte celle død veier under sine løp som direkte eller indirekte innebærer caspase aktivisering, som autophagy etter sult95,96nekrose av kaldt sjokk-indusert plasma membran ruptur19,55,56,78og staurosporine-indusert necroptosis97, 98. Våre nåværende og tidligere studier viste at CaspaseTracker biosensors kan merke celler fra disse celle død inductions i vitro eller vivo17,18,19 , 20 , 21. som disse celle død inductions alene kan samtidig aktivere flere celle død stier i de samme cellene, utvinning av disse dør celler antyder at anastasis er en generell celle utvinning fenomen som kan reversere forskjellige celledød prosesser inkludert apoptose, autophagy, nekrose og necroptosis, enkeltvis eller samtidig.

I vivo CaspaseTracker biosensor vil lette jakten på ennå ukjent funksjonene, mekanismer og terapeutiske virkningene av anastasis ((Figur 4)21). For å avsløre molekylær signatur anastasis, utført vi tid-retters hele-genome genet uttrykk microarray studier for å analysere musen primære leverceller under reversering av etanol-indusert apoptose og interessant, fant slående endringer i transkripsjon av gener involvert i flere veier inkludert Pro overlevelse, anti-oksidasjon, DNA skade respons, histone modifisering, angiogenese, celle migrasjon og transformasjon18,21. Dette funnet er støttet av vår validering studie for utvinning av menneskelig leverkreft HepG2 celler fra apoptose18,21, og også en fersk RNA-sekvensering selvstudium HeLa celler i utvinningen av apoptose99. Interessant, opp-regulering av noen Pro overlevelse faktorer i anastatic celler er også observert i hjertesvikt reversering og svulst progresjon kreft tilbakefall100,101,102, tyder potensielle deltakelse av anastasis. For å studere fysiologiske, patologiske og terapeutiske mulighetene for anastasis, er det viktig å identifisere de anastatic cellene og spore deres skjebne i små dyr, da dette vil aktivere mekanistisk og terapeutiske studier. Våre Drosophila og pattedyr CaspaseTracker biosensors vil være nyttig verktøy for å teste potensielle bidrag fra anastasis i normal utvikling, homeostase, vev utvinning, svulst evolusjon, kreft tilbakefall og metastasering. Funn fra disse studiene vil øke vår forståelse av naturlige rollen som anastasis, og har potensial til å identifisere revolusjonerende nye behandlingsmetoder for intractable sykdommer ved mekler celledød og overlevelse gjennom å kontrollere anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Darren Obbard for Drosophila bilde i figur 3 c og video manuskriptet; J. Marie Hardwick, Wade Gibson og Heather M. Lamb verdifull informasjon om dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en Sir Edward Youde Memorial fellesskap (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial stipend (H.L.T.), Fulbright gi 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellesskap (H.L.T.) og NCI K22 gi CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang var en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

Medisin problemet 132 Anastasis apoptose autophagy biosensor caspase CaspaseTracker nekrose necroptosis programmert celledød tilbakeføring av apoptose
Oppdage Anastasis <em>i Vivo</em> av CaspaseTracker Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter